Die in dieser Arbeit etablierte Insertions-Duplikations-Mutagenese IDM ermöglicht es, das Genom von pathogenen Bakterien zu mutagenisieren und die so generierte Mutantenbank im high-throughput-Format auf Gene zu untersuchen, die unter bestimmten Bedingungen für das infektiöse Potential oder für das Überleben dieser Keime von Bedeutung sind. Die Grundlage von IDM bildet ein konditional replizierender Vektor, in den eine Genbank des Wirtsorganismus kloniert wird und der unter nicht-permissiven Replikationsbedingungen mittels homologer Rekombination ins Chromosom integriert und dadurch einen Gen-Knockout bedingt. Das IDM-Verfahren weist gegenüber der Transposon-Mutagenese den Vorteil auf, dass das Genom nach dem Zufallsprinzip saturierend mutagenisiert werden kann und dass keine hot spots für die Insertion auftreten. Darüber hinaus kann der mutierte Genlocus nach Screening der Mutanten schnell per PCR identifiziert werden, indem die Exzision des Vektors induziert und das klonierte, homologe Fragment sequenziert wird. Die Insertion des Vektors ins Chromosom und damit der Gen-Knockout ist selbst ohne Selektionsdruck sehr stabil, so dass die Mutanten im Zellkultur- oder Tier-System untersucht werden können. IDM wurde im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich auf Salmonella enterica Serovar typhimurium und Listeria monocytogenes angewandt. Die Applikation von IDM auf S. typhimurium hatte zum Ziel, Gene zu identifizieren, deren Produkte für das Überleben dieses Gram-negativen Keims in Vollmedium unter Laborbedingungen essentiell sind. Ausgehend von 14.000 S. typhimurium Fragmentbank-Klonen konnten durch Induktion der Integration des Vektors 262 Klone identifiziert werden, für welche die Mutation zu einem lethalen Phänotyp führte. 116 der 262 entsprechenden Proteine konnte durch IDM erstmalig eine essentielle Funktion für die Vitalität von S. typhimurium zugewiesen werden. Darunter befinden sich sowohl Proteine, die homolog sind zu Proteinen anderer klinisch-relevanter Keime, als auch Proteine, die Salmonella-spezifisch sind. Der größte Teil der identifizierten Proteine ist in die Speicherung und Weitergabe von Information (Transkription, Translation, DNA-Reparatur etc.) involviert, viele sind allerdings auch Proteine unbekannter Funktion. Die Essentialität der durch IDM identifizierten Gene konnte durch die Konstruktion von konditional lethalen Mutanten bestätigt werden. IDM ist demnach das erste Mutagenese-Verfahren, welches das essentielle Gen-Set von S. typhimurium für das Überleben in Vollmedium zu definieren vermochte. Basierend auf den IDM Daten konnte es auf 511 Gene, d.h. auf 11 % des Gesamt-Genoms beziffert werden. Bei der Applikation von IDM auf L. monocytogenes lag der Fokus auf der Identifizierung von Genen, die für das Überleben dieses Gram-positiven Bakteriums im Zytosol von eukaryontischen Zellen von Bedeutung sind. Im Screening von bis dato 720 der 1491 L. monocytogenes Insertionsmutanten auf ein attenuiertes Replikationsverhalten in Caco-2 Zellen konnten 69 Mutanten selektioniert werden. In diesen Mutanten sind Gene ausgeknockt, deren Produkte hauptsächlich wichtige Funktionen in der Nährstoffbereitstellung, in der Energiesynthese und im Metabolismus inne haben. Mit der Insertions-Duplikations-Mutagenese IDM steht ein molekulares Werkzeug zur Verfügung, welches für die Identifzierung neuer targets für sowohl Breitband- als auch Spezies-spezifische Antiinfektiva eingesetzt werden kann und welches unbekannten Proteinen eine biologische Funktionen zuweisen kann. / Using insertion-duplication-mutagenesis IDM, that has been established in this work, it is possible to mutate the genome of pathogenic bacteria and to generate a mutant bank. This bank can be screened in a high throughput format on genes that are relevant under certain conditions for the infectious potential and the survival of these germs. IDM is based on a conditionally replicating vector which integrates into the chromosome under non-permissive replication conditions via homologous recombination after having cloned a gene bank from the host organism into it. The vector integration causes a knockout of the respective gene. In contrast to transposon mutagenesis, the IDM approach has the advantage that the whole genome is mutated and that no mutation hot spots occur. Furthermore, after having screened the mutant bank, the mutated gene locus can be identified very quickly by applicating PCR: excision of the vector is induced and the cloned, homologous fragment is sequenced. Integration of the vector into the chromosome and therefore the gene knockout is very stable even without any selection so that the mutants can be examined in the cell culture and animal model. In this work IDM has been applicated successfully to Salmonella enterica Servovar typhimurium and Listeria monocytogenes. Application of IDM to S. typhimurium aimed to identify genes whose products are essential for the survival of that Gram negative germ in rich medium under laboratory conditions. Starting with 14.000 S. typhimurium fragment-bank clones, induction of integration of the vector led to the identification of 262 clones for which the mutation resulted in a lethal phenotype. For 116 of the 262 respective proteins, this is the first data that assigns to these proteins an essential function for viability of S. typhimurium. Amongst them are proteins that are homologue to proteins of other clinically relevant germs, as well as proteins that are Salmonella specific. Most of the identified proteins are involved in information storage and processing (transcription, translation, DNA repair etc.), but many are proteins of unknown function. The essentiality of the identified genes could be confirmed by construction of conditionally lethal mutants. Hence, IDM is the first mutagenesis approach that reached to define the essential gene-set of S. typhimurium for survival in rich medium. Based on the IDM data it could be estimated at 511 genes, that means at 11 % of the whole genome. The application of IDM to L. monocytogenes focussed on the identification of genes that play an important role for the survival of that Gram-positive bacterium in the cytosol of eucaryotic cells. Until now 720 of the 1491 L. monocytogenes mutants have been screened on a attenuated replication behaviour in Caco-2 cells and 69 mutants have been selected. These mutants harbour mutations in genes whose products mainly hold important functions in nutrient uptake, energy synthesis and metabolism. The insertion-duplication-mutagenesis IDM has proven to be a suitable molecular tool that can be used for the identification of novel targets for both broad spectrum and species-specific antibiotics and that can assign a biological function to unknown proteins.

Thesis (doctoral)--Swedish University of Agricultural Sciences, 2001. / Includes bibliographical references.

Universiẗat Hohenheim, Diss.--Stuttgart, 1999.

T-Zellrezeptor (TZR)-Gentherapie zeigte erste Erfolge in klinischen Studien, jedoch wurden gleichzeitig Risikofaktoren deutlich. Ein Risikofaktor ist das falsche Paaren der transferierten TZR-Ketten mit den endogenen, was zu TZR-Molekülen von unbekannter Spezifität führt und die Oberflächenexpression und somit auch die Funktionalität des transgenen TZR reduziert. Dieser Aspekt wurde in generierten T-Zellklonen mit einer konstitutiven/endogenen TZR-Expression sowie einer zweiten induzierbaren/transgenen TZR-Expression untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass nach Induktion der transgenen TZR-Expression der endogene TZR seine Funktionalität verlor, obwohl er noch auf der Oberfläche detektierbar war. Als Ursachen wurden neben einer reduzierten Oberflächenexpression des endogenen TZR auch falsch gepaarte TZR-Moleküle, die mit Hilfe der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Methode detektiert wurden, gefunden. Die Modifikation des TZR durch den Einbau einer zweiten Cystein-Brücke, was das Paaren der korrespondierenden TZR-Ketten stabilisieren soll, führte in den T-Zellklonen zu keiner Reduktion der falsch-paarenden TZR-Moleküle. In primären Wildtyp-T-Zellen verbesserte sich das richtige Paaren des transgenen TZR leicht und konnte durch Codon-Optimierung der TZR-Gene weiter verbessert werden. Der zweite untersuchte Risikofaktor ist die Insertionsmutagenese durch den retroviralen Vektor. Die sichere Verwendbarkeit von differenzierten T-Zellen für die TZR-Gentherapie wurde in einem Tiermodel mit wiederholter T-Zellstimulierung, um weitere Mutationen während der Zellteilung zu provozieren, analysiert. Im Laufe der Zeit reicherten sich die transferierten T-Zellen in den Tieren dramatisch an, aber entwickelten sich nicht zu T-Zelllymphomen. Die Proliferationskapazität und die Funktionalität der transferierten T-Zellen wurden bestätigt. Die Polyklonalität der TZR-gen-modifizierten T-Zellen wurde mit Hilfe der linear-amplifizierten Polymerasekettenreaktion nachgewiesen. / T cell receptor (TCR) gene therapy is a new therapy for cancer which showed first clinical success but at the same time risk factors evolved. One risk factor is the mispairing of the TCR chains with the endogenous TCR chains which leads to TCRs with unknown specificities and to a reduced expression and functionality of the transferred TCR. This aspect was analyzed in dual TCR T cell clones which had one constitutive/endogenous TCR expression as well as a second inducible/transgenic TCR expression. It could be shown that the endogenous TCR lost its functionality after induction of the transgenic TCR expression although it was still detectable on the cell surface. The reason was found in the lower surface expression level of the endogenous TCR as well as in mispaired TCR dimers detected by fluorescence resonance energy transfer (FRET) technique. Modification of the TCR by insertion of a second cysteine bridge which should stabilize the pairing of the corresponding TCR chains did not reduce the TCR mispairing in the T cell clones. In primary wild-type cells, the pairing of the transgenic TCR improved slightly and could be further improved by codon-optimization of the TCR genes. The second analyzed possible side effect of TCR gene therapy is the insertional mutagenesis by the retroviral vector. The safety of differentiated T cells for TCR gene therapy was analyzed in an animal model with a repetitive T cell stimulation to provide the opportunity for mutations to occur during cell division. Over time, transferred T cells increased dramatically in the recipient mice, but did not lead to T cell lymphomas. The proliferative capacity and the functionality of transferred T cells were confirmed. The polyclonality of the TCR gene-modified T cells could be confirmed by linear amplification-mediated polymerase-chain reaction.

No description available.