Les intégrines sont bien reconnues pour être impliquées dans plusieurs mécanismes cellulaires tels que la migration, la différenciation et la survie cellulaire. Il est également connu que les différentes sous-unités des intégrines peuvent elles aussi avoir des rôles différents au sein de ces mécanismes.Les signaux de survie engendrés par l'adhésion cellulaire sont principalement médiés par les intégrines. Ainsi lors de la perte d'adhésion à la matrice extracellulaire, les cellules entrent en anoïkose. Notre laboratoire a démontré que les cellules épithéliales intestinales entrent, elles aussi, en anoïkose lors d'une perte d'adhésion à la matrice. Ainsi l'objectif de ce travail est de déterminer l'implication des différentes sous-unités [alpha] des intégrines dans la survie cellulaire dans l'épithélium intestinal selon l'état de différenciation. Tout d'abord, nous avons déterminé le profil d'expression des sous-unités [alpha]2, [alpha]3, [alpha]5 et [alpha]6 des intégrines.Les cellules indifférenciées expriment toutes les sous-unités d'intérêts, alors que les cellules différenciées expriment surtout la sous-unité [alpha]6 des intégrines. Ensuite, afin de déterminer quelles sous-unités des intégrines sont impliquées dans la survie cellulaire selon l'état de différenciation, nous avons utilisé des anticorps bloquants afin d'inhiber leur adhésion à la matrice.Les sous-unités [alpha]2, [alpha]3 et [alpha]6 des intégrines sont importantes pour la survie des cellules indifférenciées alors que ce sont les sous-unités [alpha]2, [alpha]5 et [alpha]6 qui sont importantes pour la survie des cellules différenciées. Nous avons généré des shARNs dans des lentivirus afin d'infecter les cellules indifférenciées HIEC. Aucun des shARNs générés contre les sous-unités [alpha]2, [alpha]3 et [alpha]5 n'est fonctionnel. Le troisième shARN contre la sous-unité [alpha]6 a fonctionné. De plus, la perte d'expression de la sous-unité [alpha]6 a entraîné une augmentation de l'anoïkose. Donc, la sous-unité [alpha]6 des intégrines est importante pour la survie des cellules indifférenciées. À l'aide de ce shARN, nous avons déterminé que la perte d'adhésion causée par la perte d'expression de la sous-unité [alpha]6 des intégrines affecte les niveaux relatifs d'activation de Fak. Ainsi les différentes sous-unités [alpha] des intégrines sont impliquées de façon différentielle dans la survie des cellules épithéliales intestinales selon l'état de différenciation.

Notre recherche a pour objectif la biocompatibilisation active de polymères de synthèse. La stratégie utilisée consiste à greffer de manière covalente en surface du polymère des signaux synthétiques. Parmi les nombreuses applications de cette stratégie, nous nous sommes intéressés à la promotion de l'adhésion cellulaire sur le poly(éthylènetéréphtalate) (PET). Ce matériau possède des propriétés déjà amplement exploitées dans des application biomédicales. Durant cette thèse, nous avons abordé plusieurs aspects dans le contrôle et l'évaluation du substrat modifié. Afin de réaliser un greffage efficace, nous avons étudié les sites réactifs du PET (fonctions acides vs fonctions alcools) ainsi que les méthodes de couplage via la chimie organique appliquées à l'interface solide-liquide (surface wet chemistry). En relation avec cette étude, nous avons synthétisé et évalué différents bras d'espacements afin d'établir les plus performants lors d'un greffage en surface. L'adhésion cellulaire est un phénomène s'établissant via des récepteurs cellulaires. Par le greffage de motifs de reconnaissance de ces récepteurs, nous envisageons d'accroître le taux d'adhésion cellulaire. Pour cela, nous avons réalisé le design et la synthèse de peptidomimétiques de la séquence RGD, motif universellement reconnu par les intégrines. Ces dernières sont une des grandes familles de récepteurs cellulaires, très étudiés en chimie médicinale. Finalement, notre évaluation biologique se scinde en 2 parties. D'une part, greffés en surface, nos peptidomimétiques ont pour effet recherché, la promotion de l'adhésion cellulaire. D'autre part, la saturation des récepteurs cellulaires par les ligands en solution inhibe l'adhésion cellulaire via ces récepteurs. Ce dernier point est un aspect développé par de nombreux groupes pharmaceutiques dans le traitement de certaines maladies. Un test plus poussé de binding moléculaire a pu être effectué nous apportant des informations quand au phénomène de reconnaissance. A partir des premiers résultats obtenus, nous avons pu optimiser le design selon un protocole itératif basé sur une analyse théorique par modélisation plus poussée.

Ce travail, réalisé au sein du laboratoire de chimie organique et médicinale de Louvain-la-Neuve, concerne la biocompatibilisation active de matériaux polymères de synthèse par des modifications ciblées de leur surface. Le polymère considéré dans le cadre de cette étude est le poly(éthylèneterephtalate) sous forme de membranes micro-poreuses « track-etched » (tePET) utilisées en cultures cellulaires. Notre stratégie scientifique se base sur le greffage covalent de signaux biologiques (peptidomimétiques) issus de la chimie médicinale. Ces molécules sont reconnues par des récepteurs transmembranaires, les intégrines, impliqués dans l’adhésion ferme des cellules. Les recherches sont articulées autour de deux grands axes. Le design et la synthèse des ligands des récepteurs visés (αVβ3) constitueront la première partie de l’ouvrage. Une voie de synthèse rapide et efficace vers les différentes molécules cibles a été mise au point. L’affinité des ligands pour le récepteur isolé a été évaluée in-vitro (Test de type ELISA). Une tentative d’analyse des résultats est fournie par une approche théorique de modélisation. Les meilleurs candidats sélectionnés ont été équipés d’un bras d’ancrage pour la poursuite de leur développement et finalement participer aux campagnes de greffages. La seconde partie est centrée sur l’étude par diverses techniques de la réactivité des fonctions de surface du tePET par une nouvelle voie utilisant un dérivé halogéné de la triazine. Suite à une optimisation systématique des conditions d’activation, nous avons pu réaliser la fixation covalente de nos ligands avec des rendements de 50 à 140pmol/cm2 de surface. L’étude de l’adhésion primaire de cellules endothéliales nous a permis d’évaluer la biocompatibilisation apportée par la modification des surfaces avec nos ligands. De plus, une étude d’adhésion cellulaire sur les surfaces stérilisées par deux techniques classiques nous a permis d’évaluer la stabilité de nos matériaux. Dans tous les cas, les supports en tePET greffés avec des ligands synthétiques (peptidomimétiques RGD) des intégrines αVβ3, présentent des propriétés d’adhésion cellulaire (cellules HSV) supérieures aux supports de références pro-adhésifs (tePET+gélatine A) ; la stérilisation ne modifie quasi pas ces bonnes propriétés. Finalement, une application de nos ligands greffables a été réalisée dans le cadre des agents de contraste en imagerie par résonance magnétique nucléaire (IRM). Une de nos molécules, greffée à la surface de micro-particules d’oxyde de fer permet de les vectoriser et ainsi d’en augmenter la capture par des cellules cancéreuses stimulées.

La présence de leucocytes dans les dérivés sanguins à transfuser a été soulignée et rendue responsable de différentes complications graves chez les patients receveurs,et notamment chez certaines catégories de patients plus sensibles tels les immunodéprimés, les nouveau-nés, les candidats aux greffes, et les personnes transfusées à répétition. Le but de ce projet est l'aménagement de membranes de filtration du sang permettant une rétention cellulaire sélective par greffage covalent de ligands spécifiquement reconnus par les intégrines α4β1, α4β7, et β2 exprimées chez les leucocytes Nous avons envisagé l'amélioration des propriétés filtrantes de deux membranes commerciales, de PVDF et de PBT, en y fixant de manière covalente des ligands d'intégrines de leucocytes. Nous avons réalisé la synthèse de divers dérivés des tripeptides LDV et LLG ainsi que d'un composé peptidomimétique. Ces molécules ont été greffées de manière covalente aux membranes, par le biais de bras d'espacement de type polyéthylène glycol, permettant d'exposer les signaux biologiques de façon optimale vis-à-vis de la reconnaissance cellulaire. Nous avons caractérisé les membranes de PVDF et de PBT par SEM (Scanning electron microscopy : étude structurale, compatibilité des solvants, contrôle d'intégrité après traitements), par XPS (X-Ray photoelectron spectroscopy : étude sur les membranes natives, greffages de sondes chlorées ou fluorées) ainsi que par LSC (Liquid scintillation counting : mesures de réactivité de surface vis-à-vis de la lysine tritiée,tests d'activation, mise au point des modes opératoires).Les fonctions accessibles au greffage sont de type acides carboxyliques et alcools pour les membranes de PBT et de type alcools pour celles de PVDF. Diverses méthodes de greffage ont été testées sur ces deux matériaux. La méthode retenue pour le PBT consiste en l'utilisation d'un clip moléculaire muni d'une fonction azoture et d'un ester activé sous forme de N-hydroxysuccinimide, mis au point au laboratoire, greffé par activation photochimique. D'autre part, c'est une activation des fonctions alcools présentes sur le PVDF par le fluorure de cyanuryle qui a retenu notre attention. Ces deux méthodes ont été appliquées à la fixation des ligands d'intérêt synthétisés par nos soins. Les membranes dérivatisées ont finalement été analysées en XPS pour s'assurer de la présence des ligands et utilisées dans des tests de filtration de buffy coat. La qualité de la filtration obtenue a pu être évaluée en cytométrie de flux. Les résultats obtenus sont intéressants puisqu'une nette amélioration de la qualité de la rétention leucocytaire a pu être observée (facteur 100).

Les lymphocytes Th17 sont une sous-population de lymphocytes T auxiliaires impliqués dans les maladies inflammatoires et auto-immunes dont les mécanismes d’activation sont encore mal compris. Au laboratoire, nous avons déjà démontré que α2β1 ainsi que le récepteur à l’IL-7 étaient deux molécules de costimulation potentielles chez les lymphocytes T. Nous avons donc émis l’hypothèse que l’intégrine α2β1 et l’IL-7R coopèrent pour activer la production d’IL-17 chez les Th17. Nous avons montré que les lymphocytes Th17 co-expriment l’IL-7R et l’intégrine α2β1. De plus, la liaison de l’IL-7R et de l’intégrine α2β1 avec leurs ligands respectifs mène à la production d’IL-17, et ce, de manière additive. L’augmentation de la production d’IL-17 par l’IL-7R et l’intégrine α2β1 dépend de l’activation des voies de signalisation JAK/STAT, PI3 kinase/AKT et MAPK/ERK, respectivement. Ainsi, l’intégrine 21 et l’IL-7R sont des voies de réactivation importantes chez les Th17 et pourraient constituer des cibles thérapeutiques importantes.

Les intégrines, des récepteurs trans-membranaires exerçant une fonction importante dans l'adhésion et la migration cellulaire, pourraient contribuer aux propriétés, tumorigènes et métastatiques du mélanome uvéa!. Nous avons démontré que le patron d'expression de certaines intégrines différait entre les lignées tumorales: la sous-unité d'intégrine a4 est anormalement élevée dans la lignée métastatique H79 alors que l'expression de la sous-unité a5 est presque entièrement abolie dans des lignées à plus fort potentiel tumorigène mais non dans les lignées peu agressives. La transcription du gène a4 étant sous l'influence régulatrice du facteur de transcription (FT) Pax-6, nous avons démontré que celui-ci n'est cependant pas l'élément déterminant dans l'expression aberrante du gène a4. Sachant que le promoteur du gène a5 est sous l'influence des FTs Spl/Sp3, AP-l et NFI, nous avons démontré que l'agressivité des lignées de mélanomes pouvait être étroitement liée à des changements dans l'expression ou les propriétés de ces FTs.

Les lymphocytes Th17 sont une sous-population de lymphocyte T découverte récemment et dont la particularité est de produire de l’IL-17. Ces cellules ont été impliquées dans le développement de maladies auto-immunes. Toutefois, les mécanismes régulant les fonctions des lymphocytes Th17 dans ces maladies ne sont pas très bien connus. Plusieurs études indiquent que les intégrines liant le collagène sont des molécules de costimulation pour les lymphocytes T effecteurs. De plus, ces intégrines ont été impliquées dans le développement de plusieurs maladies auto-immunes. On les retrouve entre autres sur les lymphocytes T arthritiques du liquide synovial. Cependant, l’expression et les fonctions des intégrines liant le collagène chez les lymphocytes Th17 sont inconnues. Nous avons montré que l’intégrine liant le collagène alpha2beta1 (α2β1) est exprimée sur les cellules Th17, mais que l’intégrine α1β1 ne l’est pas. Nous avons également observé que les collagènes de type I et de type II costimulent la production d’IL-17A, d’IL-17F et d’IFN-γ dans les lymphocytes Th17 humains activés par le récepteur des cellules T (TCR) alors que le collagène de type IV, liant l’intégrine α1β1, n’a pas d’effet sur la production de ces cytokines. Nous avons également montré que les lymphocytes T expriment un autre récepteur pour le collagène, soit DDR1. Nos résultats suggèrent que ce récepteur n’est pas impliqué dans l’adhésion, mais plutôt dans la migration des lymphocytes T dans le collagène tridimensionnel. Nous avons trouvé que les lymphocytes Th17 expriment DDR1, mais que celui-ci n’est pas impliqué dans la costimulation par le collagène. Nos résultats ont mis en évidence le rôle des voies de signalisation MAPkinases ERK, JNK et la voie PI3K/AKT pour l’expression et la production d’IL-17 suite à la stimulation par le TCR alors que la voie MAPkinase p38 n’est importante que pour la costimulation de l’IL-17 par l’intégrine α2β1. Nos résultats ont également montré que l’expression du facteur de transcription RORc, qui joue un rôle central dans la différenciation Th17 et l’expression de l’IL-17, est augmentée par la costimulation du collagène. L’expression de RORc nécessite les voies MAPkinase ERK et PI3K/AKT qui sont aussi augmentées par le collagène. Nos résultats indiquent que l’intégrine α2β1 participe à l’activation des lymphocytes Th17 et de ce fait peut réguler à la hausse le développement des maladies auto-immunes dans les tissus riches en collagène.

La phosphatidylinositol-3 kinase (PI3-K) est un complexe comportant une sous-unité catalytique (C) et régulatrice (R). Trois isoformes R (p85?, p85? et p55?) et quatre isoformes C (p110?, p110?, p110? et p110?) sont connues. Nous avons démontré préalablement chez les entérocytes humains que la PI3-K performe des rôles différenciation-spécifiques dans la suppression d'anolkose médiée par la signalisation intégrines ? 1 /Fak/Src. Cependant, comme dans la plupart des études concernant la PI3-K, les considérations pour les distinctions entre les isoformes sont négligées. L'hypothèse de la présente étude est donc que les isoformes PI3-K performent des rôles distincts au niveau de la régulation de la survie et de la suppression d'anoïkose médiées par la signalisation intégrines ?1/Fak/Src et ce, selon l'état de différenciation entérocytaire. Les objectifs de l'étude étaient les suivants : 1) Confirmer, valider et compléter la détermination des profils d'expression des isoformes et de complexes isoformes PI3-K chez les entérocytes indifférenciés et différenciés; 2) Analyser l'engagement de chacun des complexes isoformes PI3-K par la signalisation intégrines ? 1 /Fak/Src selon l'état de différenciation entérocytaire; 3) Analyser les contributions de chacune des isoformes au niveau de l'activation d' Akt-1 et de la promotion de la survie selon l'état de différenciation entérocytaire; et 4) Analyser l'impact d'une surexpression des isoformes R chez les entérocytes indifférenciés au niveau de l'activation d'Akt-1 et de la résistance à l'anoikose. Nos résultats indiquent que: 1) les profils d'expression d'isoformes régulatrices et catalytiques PI3-K sont distincts selon l'état de différenciation; 2) des profils distincts de complexes isoformes PI3-K prédominants sont également retrouvés selon l'état de différenciation; 3) des complexes isoformes PI3-K également distincts sont recrutés/engagés par la signalisation Fak/Src; .4) l'inhibition spécifique (pharmacologique ou via siARN) de complexes isoformes PI3-K influence distinctement sur l'activation d'Akt-1, l'effecteur principal de la PI3-K et ce, selon l'état de différenciation; 5) l'inhibition spécifique (pharmacologique ou via siARN) de complexes isoformes PI3-K induit 1'apoptose/anoikose de manière isoforme-distincte et différenciation-spécifique; et 6) la surexpression de certaines isoformes régulatrices confère une certaine mesure de résistance à l'apoptose, et peut même, dans certains cas conférer une mesure additionnelle de résistance à l'anoikose. Mises ensembles, les données de cette étude supportent fortement le principe d'une participation de la PI3-K qui varie selon l' isoforme et en fonction de l'état de différenciation dans la signalisation intégrines ? 1 /Fak/Src de promotion de survie et de suppression d' andikose, chez les entérocytes humains.

Les intégrines sont les principaux récepteurs d'adhésion des cellules à la matrice extracellulaire. La perturbation de cette adhésion induit l’anoïkose (mort par détachement). Les intégrines suppriment donc l’anoïkose en adhérant à la matrice extracellulaire. Dans l'intestin, l'intégrine α2β1 est exprimée dans les cryptes (cellules indifférenciées). Nous avons démontré précédemment que le fait de bloquer l’intégrine α2β1 à l’aide d’anticorps bloquants dirigés contre celle-ci induisait la mort cellulaire chez les entérocytes indifférenciés et différenciés. Cependant, il n’avait pas été déterminé par quelles voies de signalisation cette intégrine transmettait ses signaux de survie ou quelle était son implication dans la survie des cellules carcinomateuses de côlon. L’hypothèse de la présente étude est donc que l’intégrine α2β1 contribue à la suppression de l’anoïkose entérocytaire humaine. Le premier objectif pour y répondre était de confirmer le rôle de l’intégrine α2β1 dans la suppression de l’anoïkose chez les cellules absorbantes indifférenciées. Ainsi, nous avons vérifié l’impact de l’invalidation d’α2 sur la survie cellulaire, puis nous avons analysé la signalisation affectée dans ces conditions, soient les voies majeures de la survie cellulaire, les voies PI3K/Akt et MAPK/ERK. Le second objectif était d’analyser le rôle de l’intégrine α2β1 dans la résistance à l’anoïkose exhibée par les cellules carcinomateuses de côlon humain, puisque cette caractéristique contribue à leur capacité à former des métastases. Dans ce cas-ci, nous avons vérifié l’impact de son atténuation sur la résistance à l’anoïkose et évalué son rôle dans la survie de deux modèles cellulaires exhibant une résistance à cette mort cellulaire par leur activation des mêmes voies que chez les entérocytes indifférenciés. Nos résultats indiquent que chez les cellules entérocytaires indifférenciées, la contribution d’α2β1 à la suppression de l’anoïkose pourrait dépendre de son niveau d’expression et de la compensation par d’autres intégrines telle qu’α5β1. De plus, elle communiquerait ces signaux de survie en stimulant l’activation de la voie MAPK/ERK. Par contre, chez les cellules carcinomateuses de côlon, α2β1 ne semble pas jouer de rôle majeur dans la suppression de l’anoïkose entérocytaire humaine et son rôle dans la signalisation de survie demeure incertain.

Chez les mammifères, la reproduction est regulée par des neurones spécifiques qui sécrètent le neuropeptide GnRH (Gonadotropin Releasing Hormone). Ces cellules naissent au stade prénatal dans la placode nasale et migrent dans l'hypothalamus, le long des nerfs olfactifs voméro-nasaux, pour devenir des membres à part entière de l'axe hypothalamo-hypophyso-gonadique. Un certain nombre de pathologies de la reproduction humaine sont associées à la perturbation soit de la migration neuronale des cellules à GnRH ou soit de la sécrétion de la GnRH.L'objectif général de ma thèse était d'identifier de nouveaux facteurs moléculaires régulant la migration des cellules à GnRH, leur ciblage axonale à l'éminence médiane, mais aussi leur neurosécrétion au cours de la vie reproductive.Les événements complexes du développement correcte du système à GnRH sont strictement régulés par l'expression spatio-temporelles des molecules de guidage et des molécules de la matrice extracellulaire, dont les fonctions, sont en partie médiées par leur liaison avec la β1-intégrine (Itgb1). La première partie de mon travail a été d’étudier le rôle biologique de ces protéines de surface dans la reproduction. La technologie Cre/loxP a été utilisée pour générer des souris conditionnelles GnRH spécifiques KO pour la β1-intégrine (GnRH-Itgb1-/-). La perte d’activité de la β1-intégrine altére la migration des neurones à GnRH, leur extension axonale à l’eminence mediane et la fertilité de ces souris. Ces résultats mettent en évidence que la β1-intégrine joue un rôle important dans le développement normal du système GnRH et dans l'acquisition de compétences reproductives normales chez les rongeurs.Dans la deuxième partie de ma thèse de doctorat, j'ai identifié de nouveaux facteurs moléculaires qui pourraient être responsables de l'apparition du syndrôme des ovaires polykystiques (SOPK). Cette maladie est présente chez près de 10 % des femmes. Il s’agit d’une hyperandrogénie associée à une oligo-anovulation chronique, une morphologie ovarienne polykystique et d'autres situations cliniques de transition d'un état endocrinien à un autre. Chez les patientes atteintes du SOPK, le niveau d'hormone antimüllérienne (AMH) est élevé et indique clairement que l'AMH pourrait est un marqueur possible dans le diagnostic et le traitement du SOPK. Une autre manifestation du syndrome est une élévation des sécrétions du GnRH provoquant une augmentation des taux de LH et un rapport LH/FSH élevés, qui stimulent la production d'androgènes ovariens. Toutefois, jusqu'à présent cette maladie a été considérée principalement comme une pathologie gonadique et des régulations possibles plus élevées au niveau du système nerveux central ou des interactions avec ce dernier n'ont pas été étudiées. En particulier, des informations concernant les effets extra-ovariens possibles de l'AMH sur l'axe hypothalamo-hypophyso-gonadique manquent actuellement. Mon projet de recherche a été d’étudier le rôle encore méconnu de l'AMH dans la régulation de la physiologie du système à GnRH. Mes études ont permis d’identifier un nouveau rôle extra-ovarien pour l'AMH, et notamment comme un puissant activateur de la neurosécrétion de la GnRH. / During aging, oxidative stress occurs characterized by an imbalance between the production reactive oxygen species and antioxidant capacity. It’s well recognized that acute exercise induces oxidative stress which response may be affected by aging. Only few studies have focused on the response of oxidative stress parameters to an acute exercise in relation with aging and they were not made in humans. The first aim of this work was to investigate the response of oxidative stress parameters to acute exercise in young and older subjects. Our results showed that aging has no effects on oxidative stress parameters at rest. However, in response to an acute physical exercise, our results showed that aging is characterized by an antioxidant defenses deficiency and an increase in free radical damage markers. On the other hand, regular physical activity is considered as an effective way to reduce free radical attacks and enhance the antioxidant defense. These adaptations to regular physical activity are often related to the level of physical activity and this has been shown in young subjects. The second aim of this work was to study oxidative stress parameters in elderly subjects with different physical activity levels. Our results showed a positive correlation between physical activity level and antioxidant potential. However, physical activity at high level increases free radical damage in older adults. In view of changes in oxidative stress parameters with aging, adaptations of those to regular physical activity could also be affected by aging phenomena. The aim of the third study of this work was to investigate the effects of aging and physical activity level on oxidative stress parameters responses to an acute exercise. To do so, we compared these parameters in two young subjects groups (active and sedentary) and two older adults groups (active and sedentary) before and after an acute exercise. Our results showed that, benefits of regular physical activity on the oxidative parameters stress were more pronounced in younger age groups compared to older groups. On the other hand, the effects of aging on oxidative stress parameters in the active groups were lower than those noted in the sedentary groups.