Une des propriétés majeures de la thrombine est le caractère pléiotropique de ses effets physiologiques et pathologiques, à la fois dans le compartiment sanguin et tissulaire de la paroi. Notre hypothèse est que les changements phénotypiques des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs) participent aux modifications des propriétés pro- et anticoagulantes de la paroi. Les objectifs ont été d’étudier : (i) le rôle prothrombotique des CMLVs dans l’hypertension chez le rat SHR et le syndrome métabolique (Smet) chez le rat Zucker, (ii) les mécanismes de régulation de la génération de thrombine par l’intégrine αvβ3 des CMLVs (récepteur de la pro- thrombine), et de développer des glyco-peptides fluorés pour l’imagerie permettant d’évaluer l’activité de cette intégrine dans la paroi, et (iii) d’évaluer l’effet de variants génétiques du locus 9p21 de susceptibilité aux maladies coronariennes sur le phénotype de coagulation. Résultats : Les CMLVs sont responsables du phénotype prothrombotique de la paroi artérielle associée à l’hypertension chez le rat SHR. Les acides gras libres et l’inflammation vasculaire augmentent la génération de thrombine dans les 2 compartiments ce qui se traduit par une fibrinolyse diminuée et une activité métallo-protéinase augmentée chez Le rat Zucker. L’invalidation de l’intégrine αvβ3 des CMLVs diminue la génération de thrombine dans les 2 compartiments et ralentit la survenue de thrombose carotidienne en réponse à une stimulation l’angiotensine. Le traçage de l’intégrine αvβ3 par des glyco-peptides comprenant une séquence RGD a été validé au niveau plaquettaire et des CMLVs. La souris invalidée pour le locus 9p21 exprime un phénotype pro-thrombotique qui est retrouvé chez l’homme pour certains variants (rs10120688 et rs1333040) dans ce locus. En conclusion, la CML est un support cellulaire clé de réactions procoagulants et pourrait être impliqué via les intégrines et/ou ses récepteurs pour la thrombine dans un couplage thrombine tissulaire – rigidité cellulaire dans les pathologies vasculaires / One of the major properties of thrombin is the pleiotropic character of its physiological and pathological effects, both in the blood compartment and the tissue of the arterial wall. We hypothesized that the phenotypic changes of vascular smooth muscle cells (VSMCs) are involved in modifications of pro- and anti-coagulant properties of the arterial wall. The objectives were to examine: (i) the prothrombotic role of VSMCs in hypertension of SHR rats and in the metabolic syndrome (Smet) of Zucker rats, (ii) regulatory mechanisms of thrombin generation by integrin αvβ3 of VSMCs (a pro-thrombin receptor), and to develop fluorinated glyco- peptides for imaging, to assess the activity of this integrin in the wall, and (iii) evaluate the effect of genetic variants of the 9p21 locus that give a susceptibility to coronary heart disease on the coagulation phenotype. Results: The VSMCs are responsible for the prothrombotic phenotype of the arterial wall associated with hypertension in SHR rats. Free fatty acids and vascular inflammation increase thrombin generation in the two compartments resulting in decreased fibrinolysis and an increased metallo-proteinase activity in the Zucker rats. The invalidation of integrin αvβ3 of VSMCs reduced thrombin generation in the two compartments and slowed angiotensin-induced carotid thrombosis. Tracing of the integrin αvβ3 by glyco-peptides including RGD was validated at the platelet level and VSMCs. Mice invalidated for the 9p21 locus express a prothrombotic phenotype that is found in humans for certain variants (rs10120688 and rs1333040) in this locus. In conclusion, the VSMC is a cell supported key to procoagulant reactions and may be involved via integrins and/or its receptors for thrombin in the ”tissular thrombin - cell rigidity” coupling in vascular pathologies

Le développement de traitements thérapeutiques du cancer du sein reste limité par le niveau de connaissance des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués lors du développement normal et tumoral de la glande mammaire. L’épithélium mammaire est entouré d’une matrice extracellulaire (MEC) organisée, la membrane basale, dont le constituant principal est la laminine. Des études ont montré que les interactions entre les cellules mammaires et la MEC, dépendantes des intégrines, jouent un rôle majeur dans le développement et la tumorigenèse mammaires. Ces études n’ont cependant pas permis de déterminer les hétérodimères d’intégrine spécifiquement impliqués. Dans ce contexte, mon projet de thèse a visé à définir le rôle joué par les intégrines liant la laminine (dimères contenant les sous-unités 3 et/ou 6) dans le développement mammaire, dans le maintien de cellules souches mammaires fonctionnelles dans la glande adulte et dans le développement tumoral. Les résultats de mon travail suggèrent que :(i) l’intégrine 31 présente une fonction unique au cours de la lactation. Les mécanismes moléculaires impliqués en aval de 31 font intervenir la voie FAK/Rac1/PAK1 menant à l’inhibition de la MLCK, nécessaire à la relaxation des cellules myoépithéliales mammaires et permettant de nouveaux cycles de contraction. (ii) les interactions régulées par les intégrines entre les cellules basales mammaires et la laminine sont essentielles pour régénérer l’épithélium mammaire. Cependant, les intégrines 3 et 6 présentent des fonctions redondantes dans les cellules souches mammaires. (iii) l’intégrine 31 joue un rôle clef dans le développement tumoral mammaire. L’intégrine 31 active des voies de signalisation intracellulaires FAK/Rac1/PAK1, MAPK et JNK qui favorisent la survie et la prolifération des cellules tumorales. Ensembles, ces données permettent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans le développement mammaire, la fonction de la glande adulte et la tumorigenèse. / The improvement of breast cancer therapy requires thorough analysis of the pathways leading to tumorigenesis and clear understanding of the molecular and cellular mechanisms involved in normal mammary gland development. Mammary epithelium is surrounded by a specifically organized extracellular matrix (ECM), basement membrane, and secreted glycoproteins, laminins, are among its major constituents. Integrin-mediated interactions between mammary epithelial cells and ECM have been shown to play an essential role in the control of mammary development and tumorigenesis. However, specific roles played by distinct integrin heterodimers are yet poorly understood. My thesis project aimed to define the functions of laminin-binding integrins, i.e., heterodimers, containing 3 or 6 subunits, in normal mammary gland development, in control of mammary stem and progenitor cell functions in adult gland, and in mammary tumorigenesis. The results of my work suggest that: (i31 integrin has a unique function in the control of the myoepithelial cell contractile activity during lactation; it contributes to the activation of the FAK/Rac1/PAK1 pathway leading to MLCK inhibition required for myoepithelial cell relaxation, thereby, permitting further contractile cycles. (ii) integrin-mediated interactions of mammary basal cells with laminins are essential for the regeneration of the mammary epithelium. However, 31 and 6-contaning integrins have redundant functions in mammary stem cells.(iii) 31 integrin plays a major role in mammary tumorigenesis, it promotes survival and proliferation of tumor cells activating intracellular signaling pathways involving FAK/Rac1/PAK1, MAPK and JNK pathways. Altogether, these data provide new insights into the molecular mechanisms of mammary development, adult gland function and tumorigenesis.

Les cellules sont organisées en tissus dont les propriétés physiques comme la rigidité et l'élasticité sont variables. La matrice extracellulaire (MEC) est produite et remodelée par les cellules qui s'adaptent en retour aux conditions physico-chimiques de cet environnement extracellulaire. Cela nécessite une communication bidirectionnelle entre la cellule et la matrice. Les intégrines sont des protéines transmembranaires impliquées dans l'adhérence, liant la MEC au cytosquelette d'actine via une plateforme protéique appelée adhérence focale, lieu d'une double signalisation (inside-out et outside-in). Des variations de tension intracellulaire imposées par l'environnement modifient la distribution et la taille de ces adhérences. Leur dynamique est aussi contrôlée par certaines protéines cytoplasmiques comme la protéine ICAP-1, partenaire de l'intégrine b1. En cherchant à comprendre le lien entre la tension interne et l'activation des intégrines, j'ai montré qu'ICAP-1 contrôle l'étalement, la contractilité interne et la migration cellulaire en présence comme en absence de l'intégrine b1, révélant un rôle ICAP-1 indépendant de son interaction avec l'intégrine b1. Ce contrôle semble passer par l'interaction ICAP-1/ROCK et a révélé un contrôle de l'intégrine b3 par l'intégrine b1. / The physical properties of cell tissues are variable and cells adapt their behaviour to the physical and chemical extracellular environment such as rigidity and composition of the extracellular matrix (ECM) which is produced and remodelled by cells. This implicates a bidirectionnal signalling between cells and the ECM. Integrins are transmembrane proteins involved in cell adhesion, linking the ECM to the actin cytoskeleton through adaptor proteins forming adhesion site called focal adhesion (FA) where take place an inside-out and an outside-in signallings. Intracellular tension can be controlled by extracellular cues, modifying the size and distribution of FA. FA dynamics is also regulated by cytoplasmic proteins such as ICAP-1 that interacts with b1 integrin. Looking for a better comprehension of the link between cell tension and integrin activation, I show that ICAP-1 controls cell spreading, cell contractility and cell migration both in presence or absence of b1 integrins meaning that ICAP-1 has an action without its interaction b1 integrin. This action seems to implicate the interaction between ICAP-1 and ROCK and revealed a control of b1 integrin on b3 integrin.

Le CD40 ligand (CD40L) est un régulateur important de la réponse immunitaire et un contributeur clé dans les maladies auto-immunes. Nous avons rapporté précédemment que le CD40L se liait à l’intégrine α5β1, toutefois, les conséquences fonctionnelles de cette interaction demeurent inconnues. Les lymphocytes T sont au centre de la pathogénèse des maladies auto-immunes. Ils expriment, lors de celles-ci, des quantités aberrantes d’intégrines β1 faisant en sorte que la liaison CD40L/α5β1 pourrait être d’une haute importance dans les réponses inflammatoires. Dans cette étude, nous avons démontré que la forme soluble du CD40L (sCD40L) se liait aux lymphocytes T primaires ainsi qu’aux cellules Jurkat E6.1 et ce, dépendamment de l’intégrine α5β1. L’interaction du CD40L avec l’α5β1 lymphocytaire a induit l’activation des voies anti-apoptotiques dont les MAPKs (les protéines kinases mitogène activée) et les PI3 kinases (PI3K). La liaison du sCD40L à l’α5β1 n’a pas induit son changement structural ni son adhésion à la FN (fibronectine). Ceci pourrait avoir des conséquences directes sur la survie des cellules T lors de la progression des maladies inflammatoires. Ces résultats soulignent l’impact de l’interaction CD40L/α5β1 sur la fonction biologique des lymphocytes T et ils pourraient expliquer leur survie et leur persistance au niveau des sites d’inflammations durant les maladies auto- immunes. / CD40 ligand (CD40L) is a critical regulator of the immune response and a key contributor to autoimmune diseases. We have previously reported that CD40L binds to α5β1, albeit the functional consequences of this interaction remain elusive. T cells are central to the pathogenesis of autoimmune diseases and express high levels of β1 integrins in disease conditions, making the CD40L/α5β1 interaction a potential axis of significant importance in inflammatory complications. Here, we show that soluble CD40L (sCD40L) binds to freshly isolated primary T cells and to Jurkat E6.1 T cells in a α5β1-dependant manner. This leads to the activation of key survival proteins, including the mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and the Akt PI3 kinase (PI3K). Binding of sCD40L to α5β1 does not induce its conformational change nor allow adherence to fibronectin. These results highlight the impact of the CD40L/α5β1 interaction in T-cell function and may explain the link between sCD40L and T-cell survival and persistence in inflammatory diseases.

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Une analyse génomique (Comparative Genomic Hybridization) a été réalisée sur une cohorte d’adénomes et de tumeurs coliques et a mis en évidence, parmi d’autres altérations, la délétion de la région 1p36.12 dans 23% des adénomes et 47% des carcinomes. Parmi les 15 gènes ayant une fonction connue retrouvés dans cette zone, le gène codant pour le facteur de transcription E2F2 a été retenu en raison de son implication dans des processus cellulaires clés. Une analyse de Kaplan- Meier a montré que la délétion de E2F2 est un facteur de bon pronostic de survie sans progression. Afin de mieux cerner l’implication des gènes ciblés par la micro-délétion en 1p36.12, une étude fonctionnelle in vitro et in vivo de la perte de fonction de E2F2 a été réalisée, et étendue à celle de ID3 dont le gène est le voisin direct de E2F2. Nos observations indiquent qu’in vivo, la perte d’E2F2 favorise la croissance tumorale et bloque le développement de métastases. Dans le cadre d’une collaboration avec l’équipe de biochimiste du Pr Céline TARNUS (U.H.A.), une étude pilote a été réalisée pour prouver l’efficacité anti-tumorale de nouveaux inhibiteurs hautement sélectifs pour l’aminopeptidase N. / A genomic analysis (Comparative Genomic Hybridization) evidenced, among other chromosomic alterations, a microdeletion at 1p36.12 locus in 23% and 47% of colon adenomas and carcinomas, respectively. Among the 15 genes located in the deleted region, we focused on E2F2 gene involvedin various cellular processes. The Kaplan-Meier curve analysis showed that E2F2 deletion is associated with a better progression-free survival. To better understand the involvement of genes targeted by the microdeletion in colon tumors, we assessed the functional impact of the underexpression of E2F2 and of its direct neighbor gene ID3, coding for a dominant-negative repressor involved in cell differentiation. Our results indicated that E2F2 loss favors tumor growth and prevent metastatic spread. In collaboration with the biochemical team directed by the Pr Céline TARNUS, we started a pilotstudy to prove the anti-tumor potential of new chemical inhibitors highly selective of the aminopeptidase N.

Des modifications du gène PMP22 (Peripheral Myelin Protein 22) sont responsables de neuropathies du système nerveux périphérique : l’Hypersensibilité à la Pression (HNPP : Hereditary Neuropathy with liability to Pressure Palsy) lorsqu’il est délété, CMT1A (Charcot-Marie-Tooth type 1A) lorsqu’il est dupliqué et CMT1E ou HNPP lors de mutations ponctuelles. Cependant, le rôle de la protéine PMP22 dans ces neuropathies demeure obscur. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés aux partenaires d’interactions potentiels de PMP22 : l’intégrine α6β4 (un récepteur des laminines), pourrait être impliqué dans le CMT1A. Dans cette étude, nous avons utilisé un modèle de rat transgénique portant des copies supplémentaires de PMP22 de souris. Chez ce modèle, nous avons mis en évidence des variations d’expression génique des intégrines, ainsi qu’une mauvaise localisation cellulaire de celles-ci. Ces variations des niveaux d’expression des intégrines sont les témoins d’un retard de la maturation des cellules de Schwann myélinisantes, expliquant la diminution de l’épaisseur des gaines de myéline, observée chez les rats CMT1A. Dans un second temps, nous avons étudié le cas particulier d’un patient sans expression de PMP22, en raison de deux mutations composites sur les deux allèles de PMP22. Nous avons observé que l’absence de PMP22 chez l’homme entraine une absence complète de myéline due à un blocage de l’initialisation de la myélinisation lors de la formation du mésaxone. Dans un troisième temps, nous avons effectué une étude comparative de modèles animaux et de patients atteints de CMT1A / 1E et d’HNPP permettant de valider l’utilisation de tels modèles dans l’étude de ses neuropathies. Enfin, nous nous sommes intéressés d’un point de vue informatique à la structure tridimensionnelle de différentes protéines dont PMP22 grâce à la dynamique moléculaire. Ce modèle tridimensionnel de PMP22 est le point de départ de l’étude des mutations ponctuelles ainsi que des interactions de PMP22 avec son environnement. Grâce aux animaux modèles et à l’étude de patients, nous avons montré le rôle indispensable de PMP22 dans l’initialisation de la myélinisation ainsi que son effet sur les intégrines dans le CMT1A. L’utilisation de modèles informatiques tridimensionnels créés de PMP22 permettra de comprendre les effets des mutations ponctuelles sur sa structure, et ses interactions. / Interactions study of PMP22 protein with integrins in Charcot-Marie-Tooth disease type 1A pathogenesisChanges in the PMP22 gene (Peripheral Myelin Protein 22) are responsible for peripheral nervous system neuropathies: Hereditary Neuropathy with liability to Pressure Palsy (HNPP) when PMP22 is deleted, Charcot Marie Tooth disease subtype 1A (CMT1A) when PMP22 is duplicated and CMT1E or HNPP when point mutations are present on the PMP22 gene. However, the PMP22 role in these neuropathies remains unclear. Firstly, we studied one of the PMP22 interaction partner: the α6β4 integrin (a laminin receptor), which could be involved in the CMT1A. During this study, we used a transgenic rat model carrying supplementary copies of PMP22 gene from mouse. With this model, we showed variations of expression of integrins genes and a mislocalization of integrins proteins. These variations of integrins witnesses a delay in myelinating Schwann cells maturation, explaining the reduction of myelin sheath thickness observed on CMT1A rats. In a second time, we studied the case of a patient without PMP22 expression, carrying compound mutations one the two alleles of PMP22. We showed that the lack of PMP22 on human leads to a complete lack of myelin due to a blocking in mesaxon formation. In a third time, we conducted a comparative study of animal models and patients with CMT1A / 1E and HNPP. This study allows us to validate the use of such models in the study of neuropathies. Finally, thanks to computational tools we studied the three-dimensional structure of different protein, including PMP22 by using molecular dynamics. This three-dimensional model is the starting point of point mutations study as well as PMP22 interactions with its environments. With animal models and through the study of patients, we have demonstrated the indispensable role of PMP22 in myelin initiation as well as, its effect on integrins expression in CMT1A. The use of PMP22 three-dimensional computational model will help us to understand effects of point mutation on PMP22 structure and interactions.

Le mélanome uvéal (MU) est une tumeur maligne intraoculaire rare qui touche environ 500 français par an. Malgré un traitement efficace de la tumeur primaire, la moitié des patients développent des métastases principalement hépatiques dans les années qui suivent le diagnostic. En dépit des nombreux efforts réalisés, les thérapies systémiques adjuvantes restent peu efficaces sur le MU métastatique. L’identification de gènes pronostiques et/ou causals du développement métastatique pourrait ainsi permettre des avancées considérables dans la compréhension de cette pathologie et le développement de nouvelles thérapies. Notre laboratoire a identifié la surexpression du gène codant la protéine tyrosine phosphatase PRL-3/PTP4A3 comme hautement prédictive du risque métastatique et du devenir des patients atteints de MU. Sa surexpression est également décrite dans de nombreux autres types de cancers humains métastatiques. La surexpression de PRL-3 dans des cellules de MU augmente significativement la migration cellulaire in vitro et l’invasion in vivo de manière dépendant de son activité catalytique, ce qui suggère un rôle direct de PRL-3 dans le processus métastatique du MU. De plus, nous avons montré qu’empêcher l’ancrage membranaire de PRL-3 en utilisant un inhibiteur de farnésylation (FTI-277) abolit la migration induite par PRL-3 dans les cellules de MU, ce qui révèle l’importance de son ancrage membranaire pour la migration cellulaire. Le but de ma thèse a été d’identifier et de caractériser des substrats cellulaires, et plus particulièrement membranaires, de PRL-3 qui seraient impliqués dans le processus métastatique du MU. Mes résultats montrent que la surexpression de PRL-3 dans des cellules de MU, empêchent l’adhérence des cellules au collagène I et la maturation de structures d’adhérence (FAs) en anneaux impliquant l’intégrine β1 (Itg β1), de manière dépendante de son activité catalytique et de son ancrage membranaire. Nous avons également montré que PRL-3 interagit avec l’Itg β1 et la déphosphoryle sur son motif de phosphorylation intracytoplasmique riche en S/T (T788 et T789), dont l’état de phosphorylation est connu pour réguler l’adhérence cellulaire. Ainsi, mes travaux de recherche ont permis d’identifier PRL-3 comme régulateur des structures d’adhérence à la matrice extracellulaire (MEC) au travers de la régulation de l’Itg β1 et potentiellement de la kinase FAK. De plus, dans les FAs nous avons observé que PRL-3 régule spécifiquement l’agrégation de l’Itg β1 mais pas celle de l’Itg β3, ainsi nous émettons l’hypothèse que cette régulation par PRL-3 serait différentielle entre les intégrines et dépendante de la MEC. Dans le MU, la migration accrue des cellules par PRL-3 peut également être expliquée par une accumulation de la métalloprotéase MT1-MMP/MMP14 à la surface des cellules. Cette protéine transmembranaire est responsable de la dégradation de différents substrats de la MEC et peut-être trouvée dans les FAs. Un travail auquel j’ai contribué, a montré que PRL-3 favoriserait l’accumulation de MMP14 à la membrane plasmique par l’accélération de son trafic vésiculaire. Enfin durant la dernière année de ma thèse, nous avons entrepris de tester les effets de la pentamidine, un antiparasitaire aux propriétés anti-cancéreuses, sur l’inhibition de l’activité de PRL-3. In vivo, la pentamidine induirait une inhibition moyenne de la croissance tumorale dans un modèle de xénogreffes murins de MU et de métastases. Les essais in vitro sont encore en cours. / Uveal Melanoma (UM) is a rare tumor that affects around 500 French people each year. Despite a successful treatment of the primary tumor, 50% of patients develop metastasis primarily to the liver in the years following diagnosis. Currently, systemic adjuvant therapy has been unsuccessful for effective treatment. As such, identifying genes involved in both prognosis and metastasis is important for a better understanding of this disease and in turn for designing better treatment strategies. Our group previously identified that overexpression of the gene encoding PRL-3/PTP4A3, a protein tyrosine phosphatase, is highly correlated with metastatic tumor progression and predicts poor prognosis in patients with UM. It is also known that PRL3 is implicated in the metastatic process of various cancers. Overexpression of PRL-3, but not the inactive mutant of PRL3 (C104S), in an ocular melanoma cell line significantly increased cell migration in vitro and invasion in vivo, suggesting a direct role of PRL3 in the metastatic process in UM. We also showed that FTI-277, a farnesyltransferase inhibitor that prevents PRL-3 anchorage to the plasma membrane, abolishes PRL-3-induced UM cell migration on collagen I, suggesting that PRL-3 anchorage is important for cell migration. The aim of my thesis was to identify intracellular, and in particular, membrane substrates that could play a role in UM metastasis. My results show that PRL3 overexpression in UM cells prevents both the spreading of cells to the extracellular matrix (ECM), and the formation of large focal adhesions structures (FA) involving integrin β1 (Itg b1).These biological effects are PRL-3-activity and anchorage dependent. We show that PRL-3 interacts with and dephosphorylates Itg b1 on cytoplasmic threonine 788 and 789, residues that are known to be involved in cell adhesion. Our results identify PRL-3 as a new regulator of cell adhesion structures to the ECM via the regulation of Itg b1 and most likely the focal adhesion kinase (FAK). In FA, we observed that PRL-3 specifically regulates the aggregation of Itg b1 but does not affect integrin β3, so we suppose that this regulation could be specific to certain integrins. In UM cells, the PRL-3-induced cell migration could also be explained by membrane accumulation of the metalloprotease MT1-MMP/MMP14 in the presence of PRL3. This transmembrane proteinase is responsible for ECM degradation and can be found in FA. Moreover, we demonstrated that the vesicular trafficking of MT1-MMP is accelerated in the presence of active PRL-3 but not in presence of the inactive mutant of PRL-3 (C104S). During the last year of my thesis, another aspect of my PhD project was to study the biological effect of pentamidine, an antiparasitic which is known to inhibit the phosphatase activity of PRLs in vitro. In vivo, we show that pentamidine treatment induces a decrease of tumor growth in a UM patient-derived xerograph model. Overall, the results of my thesis suggest that PRL-3 plays an important role in UM metastasis.

L’endostatine est le fragment C-terminal du collagène XVIII libéré dans la matrice extracellulaire par clivage enzymatique. C'est un inhibiteur endogène de l’angiogenèse et de la croissance tumorale. L'endostatine inhibe la prolifération et la migration des cellules endothéliales induite par le Fibroblast Growth Factor-2 ou le Vascular Endothelial Growth Factor et elle inhibe la croissance de 65 types de cellules tumorales. L’endostatine fait actuellement l’objet d’essais cliniques pour le traitement de différents cancers son mécanisme d’action est encore mal connu. Nous avons caractérisé par résonance plasmonique de surface (SPR) les interactions établies par l'endostatine avec les intégrines αvβ3 et α5β1 qui sont surexprimées à la surface des cellules endothéliales activée. Nous avons identifié le site de fixation l'endostatine sur les intégrines, proposé un modèle de structure du complexe formé par l'endostatine et l'intégrine αvβ3 et montré que l'endostatine ne peut pas se lier simultanément aux intégrines et aux chaînes d'héparane sulfate présentes à la surface cellulaire. Pour identifier des partenaires supplémentaires de l'endostatine, nous avons développé des puces à protéines et à glycosaminoglycanes basées sur la SPR et capables de suivre jusqu'à 400 interactions simultanément. Nous avons identifié neuf partenaires de l'endostatine (le dermatane sulfate, la transglutaminase-2, les collagènes I, IV et VI, le peptide amyloïde β1-42, et des protéines matricellulaires dont SPARC et thrombospondine-1). Nous avons montré que l’endostatine se fixe avec une forte affinité (KD ~ 6 nM) sur la transglutaminase-2 et que cette interaction nécessite la présence de calcium mais que l'endostatine n'est pas un substrat donneur d'acyle de l'enzyme. Nous avons montré que le réseau d'interactions de l'endostatine est enrichi en protéines contenant des modules EGF (Epidermal Growth Factor). Cela offre de nouvelles perspectives pour l'identification d'autres partenaires et donc de nouvelles fonctions de l'endostatine. Des protéines contenant des modules EGF comme la fibrilline-1, composant des fibres élastiques, et des protéines de l'immunité innée par exemple sont des partenaires potentiels de l'endostatine / Endostatin is the carboxyl-terminal fragment of collagen XVIII released in the extracellular matrix by proteolytic cleavage. It inhibits angiogenesis and tumor growth. Endostatin inhibits the proliferation and migration of endothelial cells induced by Fibroblast Growth Factor-2 and Vascular Endothelial Growth Factor and it inhibits 65 different tumor types. Endostatin is currently under clinical trials for several tumors. We have used surface plasmon resonance (SPR) binding assays to characterize interactions between endostatin and α5β1 or αvβ3 integrins which are over-expressed at cell surface of actived endothelial cell. We have identified the binding site of endostatin on those integrins, and we have built a molecular modeling of the endostatin/integrin αvβ3 complex. We have shown that endostatin can not bind simultaneously to integrins and to heparan sulfate. In order to identify new partners of endostatin we have developed glycosaminoglycan and protein arrays based on SPR detection. We have found nine new partners of endostatin include glycosaminoglycans (chondroitin and dermatan sulfate), matricellular proteins (thrombospondin-1 and SPARC), collagens (I, IV and VI), the amyloid peptide Aβ(1-42), and transglutaminase-2 (TG-2). We have shown that endostatin binds to transglutaminase-2 with an high affinity (KD ~ 6 nM) in a calcium-dependent manner. Enzymatic assays indicated that, in contrast to other extracellular matrix proteins, endostatin is not a glutaminyl substrate of TG-2, but would rather be an acyl acceptor. The endostatin network comprises a number of extracellular proteins containing EGF domains (Epidermal Growth Factor), and able to bind calcium. Depending on the trigger event, and on the availability of its members in a given tissue at a given time, the endostatin network might be involved either in the control of angiogenesis, and tumor growth, or in neurogenesis and neurodegenerative diseases

La matrice extracellulaire est constituée d'un réseau tridimensionnel de protéines et de polysaccharides complexes, les glycosaminoglycanes. Elle apporte un support structural aux tissus et aux cellules dont elle est capable de moduler la prolifération, la migration et la différenciation. Nous avons créé une base de données d'interactions extracellulaires protéine-protéine et protéine-glycosaminoglycane, MatrixDB, qui est disponible sur le Web (http://matrixdb.ibcp.fr). Nous avons intégré des données expérimentales, des données issues de l’analyse de la littérature et des données issues de bases de données d'interactions publiquement disponibles. Nous avons respecté les standards de curation et d’échange de données du consortium IMEx dont fait partie MatrixDB. MatrixDB permet la construction et la visualisation de l'interactome extracellulaire entier et de plusieurs types de réseaux d'interactions, spécifiques d'une molécule, d'un tissu, d'une pathologie ou d'un processus biologique. Nous avons ainsi caractérisé le réseau d’interactions extracellulaire associé au vieillissement et mis en évidence le rôle important des glycosaminoglycanes et du calcium dans ce réseau. Nous avons construit le réseau d'interactions d'une matricryptine anti-angiogénique et anti-tumorale, l'endostatine, qui est issue du collagène XVIII. Les analyses structurales et fonctionnelles de ce réseau ont montré que les partenaires de l’endostatine sont majoritairement impliqués dans l’adhésion cellulaire et que les domaines EGF (Epidermal Growth Factor) sont surreprésentés. Cette propriété nous a permis d'identifier expérimentalement d'autres partenaires de l'endostatine possédant un ou plusieurs domaines EGF et de nouvelles fonctions de l’endostatine. Nous avons modélisé les complexes formés par l'endostatine avec deux de ses partenaires pour identifier les sites d'interactions. Ces prédictions, associées aux données expérimentales, ont permis de déterminer des interactions susceptibles d'être établies simultanément par l'endostatine. L'intégration de ces données et des paramètres cinétiques et d'affinité dans le réseau d'interactions de l'endostatine sera utilisée pour proposer un modèle de son mécanisme d'action qui reste mal connu / The extracellular matrix is composed of a tridimensional network of proteins and complex polysaccharides called glycosaminoglycans. It provides a structural support to tissues and modulates cell proliferation, migration and differenciation. We have created a database of protein-protein and proteinglycosaminoglycan extracellular interactions, MatrixDB (http://matrixdb.ibcp.fr). We have integrated experimental data, data issued of the literature curation and data from interaction databases publicly available. We have respected the curation and exchange standards of the IMEx consortium that includes MatrixDB. MatrixDB allows the construction and the visualization of the entire extracellular network and other types of interaction networks specific of a molecule, a tissue, a disease or a biological process. We have characterized the aging-related extracellular interaction network and underlined the important role of glycosaminoglycans and calcium in this network. We have constructed the interaction network of an antitumoral and anti-angiogenic matricryptin, endostatin, issued from collagen XVIII. Functional and structural analysis of their network showed that partners of endostatin are mostly involved in cell adhesion and that EGF domains are overrepresented. This has allowed us to to identify experimentally other partners of endostatin possessing one or more EGF domains and to propose new functions of endostatin. We have modelled complexes formed by endostatin with two of its partners to identify the binding sites.These predictions, associated with experimental data, allowed us to determine interactions able to be established simultaneously by endostatin. Integration of these data and of kinetics and affinity parameters in the interaction network of endostatin will be used to build a model of its mechanism of action that is not fully elucidated