Les intégrons sont des éléments génétiques d'ADN mobiles tout comme les transposons et les plasmides R. Ils sont grandement impliqués dans la dissémination par transfert horizontal de gènes de résistance qui se retrouvent sous forme de cassette. Une cassette est constituée d'un gène associé à un site de recombinaison spécifique nommé attC reconnu par une intégrase. L'intégrase est l'enzyme capable d'exciser des gènes sous forme de cassettes et de les intégrer dans son intégron au niveau du site attl. Il existe deux types d'intégrons : les intégrons de résistance et les intégrons chromosomiques. L'intégron chromosomique de Treponema denticola est le premier à avoir été identifié chez un spirochète et est le premier exemple où le gène codant pour l'intégrase est dans le même sens que les cassettes. De plus, cet intégron semble plus près des intégrons de résistance que les autres intégrons chromosomiques. Des expériences in vivo chez E. coli nous permettent de constater que des interactions entre l'intégron chromosomique de T. denticola et les intégrons de résistance sont possibles et viennent appuyer notre hypothèse que les intégrons chromosomiques sont à l'origine des intégrons de résistance.

Les intégrons sont des supports génétiques bactériens de capture, d’expression et de dissémination de gènes de résistance aux antibiotiques sous forme de cassettes. Ils sont majoritairement décrits chez les bactéries à Gram négatif chez qui ils confèrent généralement un phénotype de multirésistance. Les intégrons de résistance (IR) jouent un rôle majeur dans l’acquisition de la résistance dans le monde bactérien. Il existe 3 principales classes d’IR ; les IR de classe 1, les IR de classe 2 et les IR de classe 3 (IR3). Contrairement aux 2 premières classes, les IR3 représentent la classe d’intégrons de résistance la moins étudiée. Très peu de travaux s’intéressent à leur étude et on dénombre actuellement moins de 10 IR3 entièrement caractérisés. Les objectifs de ce travail de thèse étaient (i) d’effectuer une étude épidémiologique des IR3 en France et au Cameroun et (ii) d’étudier les modalités d’expression de l’intégrase et des cassettes de ces intégrons. Nos travaux ont permis d’isoler puis de décrire 3 nouveaux IR3 présents au sein de bactéries environnementales appartenant aux genres Aeromonas, Acinetobacter et Citrobacter. Les cassettes de ces IR3 codent des résistances aux bétalactamines, aminosides et ammoniums quaternaires. De plus, nous avons caractérisé des IR3 dans 3 souches de Delftia spp. (2 D.acidovorans et 1 D. tsuruhatensis) isolées en Afrique ; les cassettes de ces intégrons ne codent pas de résistance aux antibiotiques. L’axe plus fondamental de ce travail de thèse a permis de montrer que le PintI3(1) est le promoteur impliqué dans l’expression du gène intI3. De plus, nous avons montré que les variants du promoteur Pc, ainsi que les variants du promoteur PintI3(1) sont fonctionnels et de force différente. Il ressort de nos travaux que l’environnement constituerait un réservoir d’intégrons de classe 3 et que ces supports génétiques pourraient jouer un rôle important dans la dissémination de la résistance au sein de cet écosystème. / Integrons are bacterial genetic elements able to capture and express genes embedded within gene cassettes. They are widely described among Gram-negative bacteria and generally confer a multidrug resistance phenotype. Resistance integrons (RI) play an important role in the acquisition of antibiotic resistance. There are 3 main classes of RI. Class 3 RI has been poorly studied class with less than ten fully IR3 characterized. Objectives of this thesis were (i) to conduct an epidemiological study of class 3 RI in France and Cameroon and (ii) to better understand the modes of expression of the integrase and cassettes of IR3. We described 3 new class 3 RI isolated from environmental bacteria belonging to genus Aeromonas, Acinetobacter and Citrobacter. Gene cassettes encoded resistance to betalactams, aminoglycosides and quaternary ammonium compounds. We also described IR3 from three Delftia strains (2 D.acidovorans and 1 D.tsuruhatensis) in Africa containing cassettes that do not encode antibiotic resistance. The fundamental part of the work showed that the PintI3(1) promoter is involved in the expression of the intI3 gene. Furthermore, we demonstrated that variants of the Pc promoter and variants of the PintI3(1) promoter are functional with different strengths. These results showed that the environment may constitute a reservoir of class 3 integrons and that these genetic elements could play an important role in the spread of the resistance in this ecosystem.

Les intégrons sont des plateformes génétiques bactériennes de capture et d'expression de gènes. Les intégrons cliniques sont les principaux responsables de la forte augmentation récente des bactéries multirésistantes aux antibiotiques. Cependant, dans l’environnement, ils ne représentent qu’une part minime de l’importante diversité des intégrons. Ainsi, les objectifs de cette thèse étaient (i) d’évaluer l’étendue de la diversité des intégrons dans l’environnement, (ii) de comprendre les phénomènes responsables de la structuration du pool d’intégrons dans le compartiment sédimentaire d’un milieu estuarien anthropisé et (iii) de rechercher l’existence potentielle d’intégrons indicateurs du niveau de contamination chimique.Le suivi des intégrons de classes 1, 2 et 3 et des populations d’E. coli dans des sédiments du bassin versant de la Risle impactés par des sources de contamination fécale bien caractérisées ont montré qu’en étiage, les souches d’E. coli d’origine humaine se disséminaient sur de courtes distances. Les intégrons de classe 1 se disséminent sur des distances un peu plus importantes et se maintiennent dans les 12 premiers centimètres du compartiment sédimentaire au moins.Une méthode a été développée permettant, pour la première fois, l’analyse de la diversité des intégrons via séquençage haut-débit. L’application de cette méthode sur une carotte sédimentaire de 4,8 m de profondeur prélevée dans l’estuaire fluvial de la Seine a permis de mettre en évidence plusieurs milliers de classes d’intégrons dont de nombreuses intégrases encore jamais répertoriées. La diversité des intégrons chute fortement avec la profondeur. Les intégrons de classe 1, majoritaires dans les sédiments de surface, ont une abondance qui chute fortement avec la profondeur cependant ils répondent plutôt positivement à la contamination chimique renforçant l’idée de leur utilisation comme proxy de pollutions anthropiques récentes. Trois classes d’intégrons dominent dans la vase consolidée représentant 38% des séquences obtenues dans la carotte sédimentaire mais répondant plutôt négativement à la contamination chimique. Enfin, la structure du pool d’intégrons est fortement corrélée à celle de la communauté bactérienne mais semble en partie indépendante de la communauté bactérienne dans deux des fractions sédimentaires profondes avec la dominance d’une nouvelle classe d’intégrons qui semble sélectionnée par les HAP. / Integrons are bacterial genetic platforms allowing acquisition and expression of genes. Clinical integrons play a major role in the strong increase of antibiotic multi-resistant bacteria recently observed. However, in the environment, they represent only a tiny fraction of the large integron diversity. Therefore, the aims of this thesis were (i) estimating the extent of the integron diversity in the environment, (ii) understanding phenomena responsible for integron pool structure in anthropized estuarine sediments and (iii) looking for integrons potentially proxy of chemical pollution level. The research of class 1, 2 and 3 integrons and the analysis of E. coli populations in sediments from the Risle drainage basin impacted by well-characterized fecal contamination sources show that E. coli strains with human origins were spread on short distances during low water level periods. However, class 1 integrons are spread on slightly longer distances and remain present in the 12 first centimeters of sediments at least. A methodology was developed allowing, for the first time, the analysis of integron diversity by high-throughput sequencing. In this way, the analysis of a 4.8 meter core sediment from the fluvial Seine estuary highlighted several thousands integron classes including many new integrases absent from data bases. Integron diversity decreases along with depth. Class 1 integrons are the majority integrons in surface sediments but their abundance strongly decreases in deep sediments. Class 1 integron abundance rather responds positively to chemical pollutions accentuating the idea that class 1 integrons could be used as proxy of recent anthropogenic pollutions. In the sediment core, three integron classes outshine the whole dataset: they represent 38% of all the sequences from the sediment core. However, abundances of these three majority integron classes rather respond negatively to chemical pollution levels. Integron pool structure is highly correlated to bacterial community diversity but seems to be partially independent to bacterial community diversity within two deep fractions from the sediment core: in these two sediment fractions, a new integron class outshines the rest of integron classes and seems to be specific to these two sediment fractions. Furthermore, this new integron class seems to be selected by PAH.

Les intégrons sont des éléments génétiques permettant la capture et l'expression de gènes sous la forme d'unités fonctionnelles nommées cassettes. Une cassette d'intégron est généralement constituée d'un gène suivi d'une séquence de recombinaison nommée site attC. Les cassettes sont mobilisables par un mécanisme de recombinaison spécifique de site qui est catalysé par une intégrase d'intégron. Les intégrons présents sur des éléments mobiles (les intégrons mobiles) sont grandement impliqués dans l'acquisition, l'expression et la dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques dans les bactéries à Gram négatif. Malgré toutes les informations dont nous disposons sur les intégrons, les origines des gènes codant pour les intégrases d'intégrons (intl) retrouvés dans les intégrons mobiles demeurent imprécises. De plus, le mécanisme de formation des cassettes reste inconnu. Plusieurs indices suggèrent que les gènes intl retrouvés dans les intégrons mobiles proviennent de ceux présents dans les intégrons retrouvés dans les chromosomes de bactéries environnementales (les intégrons chromosomiques). D'autre part, des éléments génétiques mobiles ciblant les sites attC, nommés introns du groupe UC-attC, pourraient contribuer au recrutement des gènes en les associant avec des sites attC. Les objectifs principaux des travaux de cette thèse ont été divisés en deux volets : i) l'étude des activités de recombinaison d'une intégrase d'intégron chromosomique et ii) l'étude des introns bactériens du groupe UC-attC, dans le cadre de l'évolution des intégrons. L'objectif du premier volet de cette thèse consistait en l'étude des activités d'excision et d'intégration de l'intégrase IntINeu de l'intégron chromosomique de la bactérie environnementale Nitrosomonas europaea ATCC 19718 à l'aide d'un test de recombinaison in vivo. Les objectifs du deuxième volet consistaient en l'étude des introns du groupe UC-attC afin a) de caractériser les promoteurs internes permettant l'expression de cassettes de résistance aux antibiotiques, b) de définir les principes de base de la reconnaissance des séquences cibles (les sites attC), et c) de déterminer leur rôle potentiel dans la formation des cassettes d'intégrons. Les résultats obtenus dans le premier volet ont révélé que l'intégrase IntINeu peut capturer plusieurs cassettes de résistance aux antibiotiques retrouvées dans des intégrons mobiles. Ces résultats suggèrent que les gènes intl retrouvés dans les intégrons mobiles proviennent de ceux présents dans les intégrons chromosomiques de bactéries environnementales. Les résultats obtenus dans le deuxième volet ont révélé que les introns du groupe UC-attC possèdent potentiellement un ou deux promoteurs conservés permettant, à l'occasion, l'expression de cassettes de résistance aux antibiotiques. Ensuite, les études de mobilité de l'intron du groupe UC-attC S.ma.12 provenant d'un isolât clinique de Serratia marcescens ont révélé l'importance de la structure secondaire conservée des sites attC dans la reconnaissance des séquences cibles. Des expériences additionnelles de mobilité ont permis de démontrer que S.ma.12 peut cibler une variété de séquences correspondant à des sites attC, mais également à de possibles terminateurs de transcription. Des études in vitro ont révélé, pour certains des introns à l'étude, les produits d'épissage des exons, les activités de transcription inverse, de même que les activités ADN polymerase de protéines introniques purifiées. Les résultats obtenus dans le deuxième volet de cette thèse ont permis d'élaborer un modèle concret du mécanisme de formation des cassettes d'intégrons.

Les intégrons sont des éléments génétiques capables d'intégrer et de disséminer, par un mécanisme de recombinaison spécifique de site, des gènes de résistance aux antibiotiques trouvés sous la forme de cassettes. Ils contiennent un gène qui code pour une intégrase (intl) qui effectue la recombinaison en agissant sur deux sites cibles : le site attl en cis avec le gène d'intégrase et le site palindromique attC d'une cassette. Les intégrases d'intégrons sont donc directement impliquées dans l'accumulation et la formation de nouvelles combinaisons de cassettes de résistance dans la région variable des intégrons plasmidiques et il est donc important de mieux comprendre leur fonctionnement. Les travaux présentés à l'intérieur de cette thèse visent l'étude des interactions entre les intégrases d'intégrons et leurs sites d'attachement. Le premier objectif est de vérifier si la substitution de certains résidus peut permettre de modifier la capacité d'une intégrase d'intégron à exciser différentes cassettes. Pour ce faire, nous avons étudié l'intégrase chromosomique, SamlntLA, trouvée chez Shewanella amazonensis SB2BT afin de déterminer si cette enzyme est capable d'exciser différentes cassettes, de comparer son activité avec celles des intégrases SonIntIA et IntI2*179E et finalement de comparer les propriétés de l'enzyme sauvage avec celles de quelques enzymes mutantes. Nous avons donc testé la capacité de ces trois intégrases sauvages et de quelques mutantes à exciser plusieurs cassettes contenant différents sites attC. Les résultats démontrent que l'intégrase SamlntLA est beaucoup moins active que les intégrases SonIntIA et IntI2*179E pour effectuer l'excision des cassettes. Ils démontrent aussi que les substitutions V206R, V206K et V206H permettent d'augmenter l'efficacité de SamlntLA à exciser certaines cassettes mais que l'activité de ces intégrases mutantes est inférieure à celle montrée par les intégrases SonIntIA et IntI2*179E. Le deuxième objectif est d'analyser l'influence de l'identité des bases protubérantes et de l'espacement qui les sépare sur l'excision des cassettes par les intégrases d'intégrons. Nous avons ainsi effectué la mutagenèse du site attCdfrAi en amont de la cassette sat2 pour obtenir des variantes de séquences et d'espacement entre les bases protubérantes afin de déterminer comment ces modifications influencent la capacité des intégrases Intll, IntI2*179E, IntI3 et SonIntIA à exciser les cassettes. Nous avons ainsi démontré que l'intégrase Intll est plus efficace pour exciser les cassettes contenant des sites attC caractérisés par des bases protubérantes T et G séparées par 6 nucleotides tandis que l'intégrase IntI3 excise les cassettes contenant un nombre limité de sites attC. Nous avons aussi démontré que les intégrases IntI2*179E et SonIntIA tolèrent les changements de bases protubérantes et qu'elles excisent une plus grande variété de cassettes que les intégrases Intll et IntI3.

Les intégrons sont des éléments génétiques bactériens. Découverts récemment dans le contexte clinique, ils sont présents dans le génome d’un certain nombre de bactéries provenant d’environnements très variés. Ils sont composés d’un gène codant une intégrase et d’une succession de cassettes de gènes. L’activité de l’intégrase permet l’acquisition, la perte ou le réarrangement des cassettes. Par ailleurs un promoteur permet l’expression des cadres de lecture contenus dans les cassettes de gène. Ainsi les intégrons sont à la fois des réservoirs de gènes et des systèmes d'expression de ces gènes. Dans le contexte clinique, ils sont connus pour être impliqués dans l'adaptation des bactéries pathogènes. Ils sont en effet capables d'acquérir et de diffuser des gènes conférant un avantage sélectif face à la pression exercée par l’usage des antibiotiques et des biocides, et par ailleurs d’être mobilisés afin d’être transférés horizontalement. Quelques études ont porté sur les intégrons en dehors des environnements cliniques. Elles ont permis de caractériser de nombreuses cassettes de gènes, sans toutefois en atteindre toute la diversité, à partir de bactéries ou de communautés bactériennes issues d’environnements soumis à différents niveaux de contaminations. Cependant, la diversité de l'intégrase a été peu étudiée, car le plus souvent les études se sont limitées aux séquences d’intégrons cliniques. Ainsi, les intégrons environnementaux sont encore mal connus et mal caractérisés. Les objectifs de ma thèse étaient de caractériser la diversité des intégrons environnementaux, avec un focus particulier sur les intégrases, à partir d’environnements soumis à des contaminations chimiques variables, dans le but d’évaluer le rôle possible des intégrons dans l'adaptation des bactéries face à des perturbations environnementales. Au cours de ces travaux, environ 800 séquences d’intégrases différentes, pour la plupart encore inconnues, ont été obtenues à partir de différents sédiments d’eau douce et côtiers. Des études in situ et en microcosmes, d’environnements d’eau douce ou de milieux côtiers, et avec différents types et niveaux de polluants, ont permis de mettre en évidence un impact des contaminations du milieu sur la diversité des intégrons, sur l’intégrase comme sur les cassettes de gène, de manière indépendante à la structure de la communauté bactérienne. Enfin, lors de cette thèse a été réalisée la caractérisation d’un intégron potentiellement adaptatif face à une pollution pétrolière, porteur de la séquence intIOPS mise en évidence et nommée par Lionel Huang lors de sa thèse. Finalement, les résultats obtenus lors de cette thèse ont apporté de nouveaux éléments qui viennent soutenir notre hypothèse principale que les intégrons environnementaux seraient impliqués dans l’adaptation des communautés bactériennes en réponse à la présence de contaminants dans les milieux non cliniques. / Integrons are bacterial genetic elements. Recently discovered in the clinical context, they are present in the genome of a number of bacteria from a variety of environments. They are composed of a gene encoding an integrase and a succession of gene cassettes. The activity of integrase allows the acquisition, loss or rearrangement of cassettes. Furthermore, a promoter allows expression reading frames contained in the gene cassettes. Thus, integrons are both reservoirs of genes and these gene expression systems. In the clinical context, they are known to be involved in the adaptation of pathogenic bacteria. They are able to acquire and disseminate genes conferring a selective advantage over the pressure exerted by the use of antibiotics and biocides, and also being mobilized to be transferred horizontally. Some studies have focused on integrons outside of clinical environments. They have characterized many gene cassettes, without however reaching the diversity, from bacteria or bacterial communities coming from environments with different levels of contamination. However, the diversity of integrase has been little studied, because the majority of studies are limited to clinical integron sequences. Thus, environmental integrons are still poorly characterized and their diversity are little understood. The objectives of my thesis were to characterize the diversity of environmental integrate with a particular focus on integrase, from environments with varying chemical contamination, to evaluate the possible role of integrating in adapting bacteria face environmental disturbances. In this work, approximately 800 different integrase sequences, mostly unknown, were obtained from various freshwater and coastal water sediments. Field studies and microcosms of freshwater or coastal environments, with different types and levels of pollutants allowed to demonstrate an impact of environmental contaminations on the integron diversity, whether on the integrase or the gene cassettes, independently to the bacterial community structure. Finally, in this thesis the characterization of a potentially adaptive integron facing an oil pollution were performed. This integron carrying the intIOPS sequence highlighted and named by Lionel Huang during his thesis. Finally, the results obtained in this thesis provide further elements which support our main hypothesis that environmental integrons would be involved in the adaptation of bacterial communities in response to the presence of contaminants in non- clinical settings.

En infectiologie, comme en cancérologie, la médecine personnalisée se développe. Ainsi, les traitements antibiotiques probabilistes cèdent leur place à des traitements adaptés aux pathologies et aux patients. En plus des risques d’échecs liés à une thérapie non adaptée, le traitement probabiliste d’une infection est associé à l’augmentation des résistances acquises chez les bactéries. Cependant, cette orientation nécessite de disposer de tests compagnons, c’est-à-dire des tests diagnostiques sensibles et spécifiques pouvant précocement identifier les bactéries et les marqueurs de résistance à partir des liquides biologiques. A côté des méthodes moléculaires largement développées mais ayant des limites de multiplexage, les techniques protéomiques ont récemment été intégrées dans le diagnostic en infectiologie. Ce travail de thèse a consisté à développer des méthodes de spéctrométrie de masse et à les appliquer à la détection de pathogènes et de marqueurs de résistance. Ce travail s’est focalisé sur trois applications : 1) l’identification, la caractérisation et la quantification précoce de micro-organismes dans des échantillons primaires (aspirats endotrachéaux (AET)) de patients atteints de pneumopathies acquises sous ventilation mécanique (PAVM), 2) la détection d’éléments génétiques de la résistance aux antibiotiques : les intégrons, 3) la détection de phénotypes de résistance aux antibiotiques chez Staphylococcus aureus. / Personalized medicine for infectious diseases or cancer becomes more and more important in modern therapy. Furthermore, probabilistic treatment has been associated with the development of resistant bacteria causing infectious diseases. As a result, probabilistic treatments are replaced by adapted treatment for pathologies and patients. However, this new approach needs available companion diagnosis tests that are sensitive but also specific tests able to provide rapid pathogen and resistance markers identification in biological fluids. Beside molecular methods, widely developed but with multiplex limits, proteomic technics have recently joined the infectious diagnosis. This work consisted in developing mass spectrometry technics for bacteria and resistance marker identifications. This work focused on 3 applications: 1) identification and quantitation of microorganisms in crude samples (endotracheal aspirates (ETA)) from patient suffering of ventilator associated pneumonia (VAP), 2) detection of genetic elements involved in antibiotic resistance : the integrons, 3) detection of antibiotic resistance phenotypes in S. aureus.

Les éléments génétiques mobiles (EGM) sont des structures génétiques fréquemment associées à la dissémination de gènes de résistance aux antibiotiques (GRA). Dans ce travail, nous avons utilisé deux EGM comme « proxies », les intégrons de classe 1 et les plasmides IncP-1, afin de mieux comprendre (i) le devenir possible des GRA une fois relargués dans un écosystème fluvial (l’Orne, France), ainsi que (ii) l’effet des pressions anthropiques sur leur persistance. À partir d'analyses de l'eau des rivières, nous avons pu montrer que les deux EGM ne se comportaient pas de la même manière. L'entrée des intégrons de classe 1 dans le système fluvial semblait être diffuse plutôt que ponctuelle, tandis que l'abondance du plasmide IncP-1 est relativement stable le long de la section de la rivière étudiée (23 km), indiquant ainsi une origine plutôt indigène. Les intrants anthropiques tels que les stations d’épuration des eaux usées ne semblent pas affecter l’abondance des EGM en raison d’un niveau trop élevé de dilution des effluents. Par ailleurs, il est intéressant de noter que les bactéries porteuses d’EGM semblaient être enrichies sur les matières en suspension, susceptibles de servir de véhicule pour amener des communautés de bactéries plus riches en EGM vers les sédiments. L'analyse de deux carottes de sédiment indique clairement que seules les couches supérieures présentent un niveau élevé de bactéries porteuses d’EGM. Ces abondances diminuent dans les couches plus profondes où seules des zones ponctuelles présentent des microréservoirs avec des abondances d’EGM plus élevées. Pour une carotte sédimentaire au moins, nous avons pu montrer que l'abondance relative d’EGM corrèle négativement la présence de polluants tel que le plomb ou certains HAP / Mobile genetic elements (MGEs) are genetic structures frequently associated to the dissemination of antibiotic resistance genes (ARGs). In this work, we used two of them as proxies, class 1 integrons and IncP-1 plasmids, to better understand (i) the possible fate of ARGs once released in a river ecosystem (Orne, France), as well as (ii) the effect of anthropogenic pressures on their persistence. From river water analyses, we could show that the two MGEs do not behave the same way. The entry of class 1 integrons in the river system appeared to be diffuse rather than punctual, while the abundance of IncP-1 plasmid is relatively stable along the river section studied (23 km) thus indicating a rather indigenous origin. Anthropic inputs such as wastewater treatment plant did not seem to affect the abundance of MGEs because a too high level of effluent dilution. Interestingly, MGE-bearing bacteria appeared to be enriched on suspended material, which is likely to serve as a vehicle to drive MGE-richer communities of bacteria toward the sediments. The analysis of two sediment cores clearly indicates that only the top layers displayed an elevated level of MGE-bearing bacteria. These abundances decrease in deeper layers where only localized zones display micro-reservoirs of elevated MGE abundances. For one sediment core at least, we could show that the relative abundance of MGE negatively correlates with pollutants such as lead or certain PAHs