Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-04-28T10:46:28Z No. of bitstreams: 1 julianafrancamonteirodemendonca.pdf: 2542669 bytes, checksum: 4bb85fe6239ae04615793a019786fe59 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-05-02T01:07:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 julianafrancamonteirodemendonca.pdf: 2542669 bytes, checksum: 4bb85fe6239ae04615793a019786fe59 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-02T01:07:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 julianafrancamonteirodemendonca.pdf: 2542669 bytes, checksum: 4bb85fe6239ae04615793a019786fe59 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Em muitos casos, o leite e seus derivados são responsáveis por causar doenças transmitidas por alimentos pela veiculação de micro-organismos, como Salmonella spp. e Staphylococcus aureus. A contaminação desses produtos pode ocorrer, principalmente, devido ao processamento térmico ineficiente ou à falta de observação das práticas de higiene e limpeza durante as diversas etapas do processo produtivo, como na manipulação do alimento ou, até mesmo, após o tratamento térmico. Assim, a identificação rápida de patógenos presentes em alimentos é de extrema importância, tanto para a garantia da qualidade dos produtos, quanto em casos de surtos. Nestes casos o uso de métodos altamente sensíveis e específicos para detectar patógenos alimentares se torna indispensável. Uma das técnicas que tem sido utilizada para este fim é a PCR em Tempo Real (qPCR), devido a sua rapidez e eficiência na identificação de patógenos em alimentos. Contudo, uma das grandes desvantagens dessa técnica é a sua incapacidade em diferenciar o DNA de células viáveis e inviáveis dos patógenos. Para suplantar tal ponto, o brometo de etídeo monoazida (EMA) pode ser usado para detectar somente células viáveis. O EMA é um intercalante de DNA que pode entrar seletivamente em células com membrana danificada (consideradas inviáveis) e se ligar covalentemente ao seu DNA, quando exposto à luz halógena, inibindo sua amplificação durante a qPCR. Desse modo, o objetivo do presente trabalho foi estabelecer um protocolo para detecção em multiplex de células viáveis de Salmonella spp. e S. aureus em culturas puras e em Queijo de Coalho pelo uso do EMA combinado à qPCR. O protocolo estabelecido foi eficaz para a identificação de células viáveis de Salmonella spp., tanto em culturas puras quanto em Queijo de Coalho. Entretanto, foi observado que a diferenciação de células viáveis e inviáveis de S. aureus pelo uso do EMA não foi eficiente. Portanto, não foi possível realizar a detecção de células viáveis dos patógenos em multiplex em culturas puras e em Queijo de Coalho. Além disso, observou-se que o protocolo estabelecido, combinando a técnica de qPCR aliada ao uso do EMA, foi capaz de detectar concentrações tão baixas de células viáveis de Salmonella typhimurium quanto 101 UFC/10g de Queijo de Coalho. Contudo, somente foi possível diferenciar estatisticamente as médias dos valores de Cycle threshold (Ct) em concentrações de células superiores a 103 UFC/10 g de queijo. O protocolo desenvolvido é, portanto, uma ferramenta útil para a vigilância de alimentos, uma vez que fornece identificação rápida e específica de células viáveis de Salmoenlla spp. em Queijo de Coalho. / In many cases, milk and milk products are responsible to cause foodborne illness through transmission of microorganisms, like Salmonella spp. and Staphylococcus aureus. The contamination of these products can mainly occur due inefficient thermal processing or the lack of practices of hygiene and cleaning during the various stages of the production process, like occur during food handling or, even, after the thermal treatment. The rapid identification of pathogens in foods is extremely important, both for the quality assurance of products, such as in cases of outbreaks. Thus, the use of highly sensible and specific methods to detect food pathogens becomes indispensable. One of the techniques has been used to this is the Real Time PCR (qPCR), due its quickness and efficiency to identify pathogens in foods. Nevertheless, one of the major disadvantages of this technique is its inability to differentiate the DNA of viable and nonviable cells of microorganisms. To overcome this drawback, the ethidium bromide monoazide (EMA) can be used to detect viable cells only. EMA is a DNA intercalating dye that can enter selectively in cells with damaged membrane (considered dead) and bind covalently to DNA when exposed to halogen light, inhibiting its amplification during qPCR. So, the aim of this work was establish a protocol to detect in multiplex viable cells of Salmonella spp. and Staphylococcus aureus in pure cultures and Coalho cheese by use of EMA combined to Real-time PCR technique. The protocol established is efficient to identify viable cells of Salmonella spp., both in pure culture as for Coalho cheese. However, was observed that the differentiation between viable and nonviable cells of S. aureus by use of EMA is not efficient. Therefore, is not possible to detect viable cells of these pathogens in multiplex in pure cultures and in Coalho cheese. Moreover, it was observed that the established protocol, combining the qPCR technique and EMA, was able to detect viable cells concentrations of Salmonella typhimurium as low as 101 CFU/10g of Coalho cheese. However, it could only statistically differentiate the means of Cycle threshold (Ct) values in cells concentrations above to 103 UFC/10 g of cheese. The developed protocol is, therefore, an useful tool for food surveillance, since it provides rapid and specific identification of viable cells of Salmonella spp. in Coalho cheese.

L'ADN est au cœur de nombreux processus biologiques. De ce fait, il est la cible de nombreuses molécules pharmacologiques employées notamment dans les thérapies anticancer. Parmi celles-ci, la daunomycine va interagir avec la double hélice d'ADN en s'intercalant entre deux paires de bases, bloquant ainsi la réplication. Malgré l'efficacité reconnue des molécules intercalantes, et de nombreuses études à ce sujet, le mécanisme du processus d'intercalation n'est pas clairement déterminé à l'heure actuelle. Basés sur l'utilisation de la dynamique moléculaire avec une représentation tout atome des systèmes en conditions de solvant explicite, ces travaux ont tout d'abord visé à caractériser l'influence de la flexibilité conformationnelle de la daunomycine vis à vis de l'ADN, ainsi que son importance dans les interactions entre ces deux molécules. Dans un deuxième temps nous nous sommes focalisés sur le chemin réactionnel menant la daunomycine à son site d'intercalation par umbrella sampling. Cette étude, en plus de fournir des énergies libres en accord avec les données expérimentales, a permis de pointer du doigt un mécanisme d'intercalation impliquant une étape préliminaire de liaison de la daunomycine au petit sillon de l'ADN, suivie d'une étape intermédiaire de réorientation du ligand. Finalement, la réalisation de simulations de glissement de la daunomycine le long du petit sillon de l'ADN nous a permis de nous intéresser au mécanisme permettant à ce ligand de localiser son site d'intercalation le long de l'ADN / DNA is at the heart of many biological processes. Therefore, it is the target of numerous pharmacological molecules used in cancer therapies. Among them, daunomycin will interact with the double helix by intercalation between DNA’s base pairs, thus blocking replication. Despite the proven efficiency of intercalating molecules, and many studies on this subject, the mechanism of intercalation process is not yet clearly understood. Based on molecular dynamics with an all atoms representation in explicit solvent conditions, this work, in one hand, aim to characterize the influence of the conformational flexibility of daunomycin during interactions with DNA. In a second hand, we focused on the reaction pathway leading daunomycine to its intercalation site using umbrella sampling. This study, in addition to providing free energies in agreement with experimental data, has allowed to highlight an intercalation mechanism involving a preliminary step where daunomycin bind to the minor groove of DNA, followed by a intermediate step of reorientation of the ligand. Finally, the realization of sliding simulations of daunomycin along DNA minor groove, has allowed us to focus on the mechanism that allow a ligand to locate its intercalation site on DNA