La prolifération, la migration et l’invasion sont des processus cellulaires biologiques fondamentaux qui sont régulés par une multitude de signaux extracellulaires. L’intégration de ces stimuli au niveau de différentes voies de signalisation intracellulaires permet d’adapter les capacités des cellules à exercer ces fonctions aux conditions du milieu extérieur. Outre des évènements génétiques tels que les mutations ou les translocations chromosomiques, des dérégulations des capacités de prolifération, de migration et d’invasion des cellules sont retrouvées lors de la mise en place d’un processus tumoral. La protéine nucléophosmine (NPM1) est un acteur important dans le contrôle de la balance prolifération/apoptose. Initialement décrite pour son rôle dans la biogénèse des ribosomes, NPM1 participe à de multiples processus cellulaires comme la duplication des centrosomes, la progression du cycle cellulaire et la transcription génique. NPM1 est ainsi fréquemment surexprimée dans les tumeurs solides d’origines histologiques variées, parmi lesquelles les cancers du colon, du poumon ou encore les tumeurs ovariennes. Les travaux antérieurs de l’équipe ont mis également en évidence que la protéine NPM1 est surexprimée dans les tissus de carcinomes prostatiques en comparaison avec le tissu adjacent sain. Mon travail de thèse avait pour objectif d’étudier l’impact d’une surexpression de NPM1 dans la progression des cancers de la prostate. Nous avons dans un premier temps analysé, in vitro et in vivo, les capacités invasives de cellules caractéristiques d’un stade avancé de cancers de la prostate en fonction du niveau d’accumulation de NPM1. Les résultats obtenus suggèrent que la protéine NPM1 intervient dans le processus tumoral en activant des mécanismes prolifératifs, migratoires et invasifs des cellules tumorales de prostate. Dans un second temps, nous avons cherché à déterminer la nature des gènes dont la transcription était susceptible d’être affectée par l’expression de NPM1. L’analyse en qPCR array met en évidence que l’expression du facteur de croissance EGF est diminuée dans un contexte d’inhibition de NPM1, ainsi que l’activation de la voie de prolifération en aval ERK1/2. Enfin, l’activation constitutive de cette voie révèle que le rôle de NPM1 se situe en aval du récepteur EGFR et en amont de l’effecteur MEKK1, activateur de la voie ERK1/2. Ces données indiquent que NPM1 pourrait conférer un avantage prolifératif et invasif aux cellules tumorales de prostate. En revanche, cette protéine ne serait pas un initiateur de la tumorigénèse mais un potentialisateur de la progression des cancers de la prostate suite à des évènements génétiques initiateurs. Dans ce contexte et sur la base de nos travaux, nous proposons comme perspective que l’inhibition de l’accumulation de NPM1, protéine qui active la voie de survie ERK1/2 et qui agit parallèlement sur la disponibilité de contrôleurs du cycle cellulaire et de l’apoptose (e.g. P53), puisse potentialiser l’action d’agents thérapeutiques déjà utilisés comme des inhibiteurs de tyrosines kinases (gefitinib®). / The chaperone nucleophosmin (NPM1) is over-expressed in the epithelial compartment of tumoral prostate glands compared to adjacent healthy tissue and may represent one of the key actors that support the neoplastic phenotype of prostate adenocarcinoma cells. Yet, the mechanisms that underlie NPM1 mediated phenotype remain elusive in the prostate. NPM1 is a major multifunctional nucleolar phospho-protein expressed at high level in the granular region of the nucleolus with capacities of shuttling between the nucleolus and the cytoplasm. Initially identified as a major regulator of the ribosome biogenesis, it was more recently demonstrated to bind to histones, to mediate nucleosome formation and to relax chromatin, thereby controlling gene expression. Furthermore, NPM1 was shown to interact with and to inhibit the tumour suppressor proteins P53 and Rb, and consequently to potentiate cell growth and proliferation. All these data emphasize a proto-oncogenic function of NPM1 although some authors described a tumour suppressive function for NPM1 as it acts as a regulator of centrosome duplication and thus may lead to cell apoptosis. All this studies revealed that NPM1 acts as both tumour suppressor and proto-oncogene during tumourigenesis. Although NPM1 detailed functions are starting to be clarified, the role of NPM1 in solid tumours remains to be determined. Here we addressed the question whether NPM1 could potentiate proliferation, migration and invasion capacities of prostate cancer cells and deciphered the mechanism by which it exerts such a control on tumour cell behaviour. Our results show that NPM1 favors cell migration, cell invasion and colony forming of prostate tumor cells. Furthermore, in vivo knock-down of NPM1 leads to a decrease in the growth of LNCaP-derived tumors grafted in nude mice. Such oncogenic-like properties are exerted via a positive regulation of NPM1 on the ERK1/2 kinase phosphorylation in response to EGF stimuli, stimuli which are emphasized in prostate tumours following the setting of an autonomous production of the growth factor. NPM1 could be a target to switch off specifically ERK1/2 pathway activation in order to decrease or inhibit proliferation and to potentiate actual targeted therapies based on EGFR specific inhibition.

L’invasion cellulaire est un phénomène pendant lequel les cellules présentent des changements importants dans leur forme et acquièrent la capacité à dégrader les structures qui les entourent afin de migrer au sein d’un organisme. L’invasion est cruciale pour la stabilité physiologique d’un organisme car elle intervient à différentes étapes de notre vie notamment lors du développement embryonnaire ou pendant une réaction immunitaire. Cependant ce mécanisme est également majeur lors de la progression tumorale. Dans nos organismes, les cellules sont entourées par la matrice extracellulaire (MEC) qui doit être remodelée ou dégradée lors du processus d’invasion. Cette dégradation est réalisée par des structures cellulaires spécialisées, les invadopodes, qui sont des sites où sont libérés les protéines spécialisées dans la dégradation de la MEC, parmi lesquelles MT1-MMP joue un rôle prépondérant. Les capacités à envahir et à dégrader la MEC d’une cellule dépendent donc fortement de la libération de MT1-MMP aux sites de dégradation. Les mécanismes qui permettent le transport de MT1-MMP aux zones d’intérêts sont encore mal compris. Dans ce contexte, nous avons mis en évidence que les Flotillines sont d’importants régulateurs de l’adressage et la libération de MT1-MMP à ces sites de dégradations. Les Flotillines 1 et 2 sont des protéines ubiquitaires très conservées. La quantité de Flotillines est augmentée dans de nombreux cancers invasifs et ceci est considéré comme un marqueur de mauvais pronostic. Lors de mon projet, nous avons mis en évidence que l’augmentation de la quantité de Flotillines dans des cellules normales de différentes origines, est suffisante pour induire une forte invasion cellulaire in vivo et in vitro (respectivement dans des modèles de xénogreffes chez le poisson zèbre dans modèles de sphéroïdes 3D dans des matrices de collagènes). De même, la suppression des Flotillines dans des cellules cancéreuses est associée à une diminution de leurs capacités invasives in vivo et in vitro. Ces résultats s’expliquent par le fait que les Flotillines régulent le trafic intracellulaire de MT1-MMP et augmentent sa libération aux sites de dégradation favorisant ainsi l’invasion cellulaire. / Tumor cell invasion and consecutive metastasis formation are the main cause of death in cancer patients. Invading tumor cells are surrounded by stroma and extracellular matrix (ECM) that is remodeled or degraded during the metastatic process. ECM degradation is mediated by specialized organelles called invadosomes. Their function strongly depends on matrix metalloproteinases (MMPs) that degrade ECM. Among all the MMPs, MT1-MMP plays a major role the invasive behavior of metastatic cells.Flotillin 1 and 2 are two ubiquitous and highly conserved membrane proteins that can assemble in large oligomers, known to participate in membrane proteins clustering and endocytosis. Flotillins are overexpressed in many invasive cancers and considered as markers of poor prognosis, results we confirmed using several sarcoma and carcinoma models. During my project we identified Flotillins as regulators of MT1-MMP trafficking and cell invasion.We used a dual reciprocal approach consisting of the overexpression of Flotillins in non tumoral cells and of down-regulation of Flotillins in metastatic cells. We showed that flotillins downregulation in invasive cancer cells dramatically inhibit their invasive properties as monitored in vitro using a 3D-collagen invasion assay and in vivo using zebrafish xenografts. Reciprocally, ectopic overexpression of Flotillins in non-tumoral cells is sufficient to induce their invasive behavior in vitro and in vivo. This increase of invasion is mainly due to a higher ability to degrade the matrix in a MT1-MMP-dependent manner. Finally, we showed that Flotillins are critical regulators of the trafficking and the release of MT1-MMP at the degradation site.

La dissémination des cellules cancéreuses et la formation de métastases sont des étapes cruciales dans la progression tumorale et constituent une cause majeure des décès dus au cancer. La métalloprotéase transmembranaire MT1-MMP est un acteur clé impliqué dans le franchissement des barrières tissulaires et le remodelage de la matrice extracellulaire (ECM) par les cellules cancéreuses. MT1-MMP est présente dans des vésicules intracellulaires, appelées endosomes, via lesquels elle est adressée à la membrane plasmique (PM) afin d'y dégrader la ECM. Des travaux menés au laboratoire ont identifié le complexe exocyste (CE) comme un acteur important pour la formation d'invadopodes dans la lignée d'adénocarcinome mammaire MDA-MB-231. Ce complexe multiprotéique (Sec3, Sec5, Sec6, Sec8, Sec10, Sec15, Exo70 et Exo84) est impliqué dans l'arrimage des vésicules intracellulaires à la PM. Des cribles double-hybride ont identifiés la protéine WASH comme partenaire potentiel du CE (via les sous-unités Exo84 et Sec3). WASH est capable d'induire la polymérisation de l'actine en activant le complexe Arp2/3. In vitro, nous avons montré que les complexes WASH et exocyste interagissent physiquement et coordonnent le trafic intracellulaire et l'adressage de MT1-MMP à la PM. Ces résultats mettent en évidence une étroite collaboration entre le cytosquelette d'actine et les mécanismes d'exocytose lors des étapes précoces de dégradation de la ECM ainsi que dans l'invasion tumorale. / Cancer cell invasion is a prerequisite to tumor progression and metastasis. In order to disseminate, tumor cells must degrade and remodel the extracellular matrix (ECM) in a process that requires the trans-membrane matrix metalloproteinase MT1-MMP, which is a key component of the ECM remodeling apparatus of cancer cells. MT1-MMP overexpression in cancers is associated with increased invasion and metastasis. Many cellular proteins are involved in the transport and delivery of MT1-MMP-containing vesicles to the PM. Previous work from the laboratory identified the exocyst complex (EC) as a key component required for matrix proteolysis and invasion of cancer cells. This multiprotein complex (Sec3, Sec5, Sec6, Sec8, Sec10, Sec15, Exo70 and Exo84) plays essential roles in docking secretory vesicles at the PM for exocytosis. To better characterize this complex, a yeast two-hybrid screen was performed, identifying the protein WASH as a potential partner of Exo84 and Sec3. WASH is a Nucleation Promoting Factor (NPF) able to activate the actin nucleating Arp2/3 complex. Results of the present study showed that WASH and the exocyst complexes interact and localize on MT1-MMP-positive endosomes in MDA-MB-231 breast cancer cells. This study highlight a direct implication of WASH and exocyst complex in ECM degradation by cancer cells through the docking and exocytosis of MT1-MMP-containing endosomes at the PM through connections between these compartments and the extracellular medium. This WASH- and exocyst-dependent MT1-MMP exocytosis mechanism is required for degradation of adjacent tissue by cancer cells during tumour cell invasion.

Les Rhabdomyosarcomes (RMS) sont des sarcomes qui touchent préférentiellement les enfants et les adolescents. Les RMS sont à l'origine de nombreuses métastases qui sont responsables d'une réduction importante de l'espérance de vie du malade. Une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant la migration et l'invasion des RMS pourrait orienter vers de nouvelles thérapies visant à enrayer le développement de métastases. La dissémination métastatique fait intervenir de nombreuses protéases dont la µ- et la m-calpaïne, cystéine-protéases, constituant avec leur inhibiteur endogène, la calpastatine, le système protéolytique neutre calcium-dépendant. Dans différents travaux, l'activité de ces calpaïnes a été montrée comme dérégulée, notamment dans le cancer du rein, de la peau ou encore les adénocarcinomes colorectaux. Une connaissance approfondie de l'impact de la dérégulation de l'activité des calpaïnes sur la dissémination métastatique pourrait en faire des cibles thérapeutiques de choix. L’étude de l’activité, de l’expression et de la localisation des différents composants du système protéolytique neutre calcium-dépendant a permis de mettre en évidence une activité dérégulée des calpaïnes dans les RMS. Cette forte activité serait due à une expression très faible de la calpastatine. L’analyse comparative des caractéristiques adhésives et cinétiques des RMS par rapport aux cellules témoins, des myoblastes humains (LHCN-M2) montre un faible taux d’adhésion associé à une vitesse de migration élevée des RMS. L’activité calpaïne présente une corrélation linéaire positive avec la vitesse de migration ; les calpaïnes se présentent donc comme marqueur de l’agressivité tumorale. L’inhibition des calpaïnes par la calpeptine réduit fortement cette vitesse. Le cytosquelette des RMS est désorganisé et ne présente pas, contrairement à celui des cellules non-tumorales, de fibres de stress. À ce niveau, les études pour tenter de discriminer le rôle de la µ-calpaïne et de la m-calpaïne, utilisant des oligonucléotides antisens, montrent que dans les LHCN-M2, la µ-calpaïne jouerait un rôle prépondérant dans la régulation de l’alpha-actine en régulant de manière négative son expression. Quant à la béta-actine, elle serait régulée, aussi de manière négative, mais, uniquement par la m-calpaïne. Dans les ARMS, la µ-calpaïne et la m-calpaïne jouent un rôle similaire en stimulant l’expression des deux isoformes. De plus, le pouvoir invasif important des RMS est fortement diminué lorsque l’activité calpaïne est inhibée. L’implication des calpaïnes tant au niveau de l’adhésion, de la migration que de l’invasion des RMS font de ces dernières une cible d’étude importante pour tenter de contrecarrer le développement de métastases. / Rhabdomyosarcoma (RMS) are a soft-tissue sarcoma commonly encountered in childhood and adolescence. RMS cells can acquire invasive behaviour and can form metastases which decrease less than 20% the patients healing. The comprehension of mechanisms that regulate cancer cells migration and invasion may be a key for development of new therapies for limiting metastasis. The metastatic dissemination implicates lots of proteases of which µ-calpain and m-calpain. Calpain activity is Ca2+-dependent and is principally regulated by calpastatin, its specific endogenous inhibitor. The deregulation of calpains has been involved in tumour invasion and metastasis in several different cell types. Then, calpains would be a good target for development of novel therapies to control metastasis. Study of calpain activity, expression, and localisation underline the deregulation of calpain activity in RMS. This high activity may be due to weak expression of calpastatin. The comparative analysis of adhesive and kinetical characteristics of RMS cells, compared to human myoblasts, LHCN-M2 cells, show a weak adhesiveness and an important migration velocity in RMS cells. The calpain activity presents a positive linear correlation with the migration velocity; so, calpain may be considered as marker of tumoral aggressiveness. The inhibition of calpain by calpeptin reduces significantly the migration velocity. The cytoskeleton RMS cells is disorganised and does not present stress fibers, contrary to LHCN-M2 cells. At this level, discrimination of µ- and m-calpain role, using antisens oligonucleotides, shows that in LHCN-M2 myoblasts, µ-calpain may negatively regulate the alpha-actin expression and that béta-actin may be positively regulated by the m-calpain. In ARMS cells, both µ- and m-calpain positively regulate alpha- and béta-actin. Moreover, the invasive behaviour of RMS cells is importantly decreased when calpains are inhibited. In summery, calpains may implicate in the anarchic adhesion, migration and increase of invasion. In this way, targeting calpain activity may represent a good strategy for limiting development of RMS tumour as well as their metastatic behaviour.

Chez la pomme de terre Solanum tuberosum, la jambe noire et la pourriture molle sont des maladies provoquées par des populations bactériennes associant une ou plusieurs espèces des genres Pectobacterium et Dickeya. Depuis plusieurs décennies en Europe, l’implication des Dickeya s’amplifie, notamment avec l’émergence récente de D. solani dans les années 2000. Aucun moyen de lutte curatif n’est efficace contre ces phytopathogènes ; seules des approches prophylactiques sont mises en place par les filières de production. Dans ce travail, l’analyse de la structure de populations pathogènes au sein de parcelles de pomme de terre du nord de la France montre que D. dianthicola et D. solani dominent en abondance relative les populations de Pectobacterium, tandis que D. dianthicola domine D. solani lorsque les deux populations coexistent. Dans une seconde partie, des populations artificielles de D. dianthicola et D. solani ont permis d’évaluer leur agressivité et leur compétitivité en serre. Tandis que la population de D. dianthicola confirme sa plus forte agressivité et compétitivité après infection de plantes entière de S. tuberosum, celle de D. solani s’avère plus agressive et compétitive après infection de jacinthes Hyacinthus orientalis, ainsi qu’en milieux de culture riche et minimum. L’analyse individuelle des isolats composant les populations artificielles de D. dianthicola et de D. solani montre que l’agressivité différente chez l’hôte S. tuberosum est un trait distinctif de ces espèces pathogènes ; ce qui renforce l’hypothèse d’un transfert d’hôte récent (plantes à bulbes vers plants de pomme terre) de D. solani. D’une manière remarquable, dans les tissus infectés de S. tuberosum (tige et tubercules), les gènes de virulence pelD et pelE sont plus fortement exprimés et d’une manière plus hétérogène chez les isolats de D. solani que ceux de D. dianthicola. Une analyse transcriptomique comparative confirme la variabilité de l’expression de fonctions de virulence entre 3 isolats de D. solani. L’ensemble de ce travail révèle que D. solani est encore en phase d’adaptation à l’hôte S. tuberosum avec une moindre compétitivité contre D. dianthicola lors de co-infection mais a une expression des fonctions de virulence en condition de macération plus importante que D. dianthicola. Ainsi, sous condition de sélection de variations génétiques favorables à son installation sur l’hôte S. tuberosum et à l’amélioration de sa compétitivité contre D. dianthicola, D. solani représente un risque majeur à moyen terme pour la culture de pomme de terre. / In potato plant (Solanum tuberosum), blackleg and soft rot are diseases caused by bacterial populations associating one or more species of the genus Pectobacterium and Dickeya. For several decades in Europe, the involvement of the genus Dickeya has increased, notably with the recent emergence of D. solani in the 2000s. No effective control exists against these plant pathogens; only prophylactic approaches are set up by the production industry. In this work, analysis of the structure of pathogenic populations in potato fields of northern France shows that D. dianthicola and D. solani dominate populations of Pectobacterium in relative abundance, while D. dianthicola dominates D. solani when both populations coexist. In a second part, artificial populations of D. dianthicola and D. solani isolates have allowed to assessed their aggressiveness and competitiveness in a greenhouse experiment. While the D. dianthicola population confirms its strongest aggressiveness and competitiveness when whole plants of S. tuberosum are infected, D. solani population is more aggressive and competitive when infecting Hyacinthus orientalis, as well as in rich and minimal liquid mediums. The individual analysis of the isolates of the artificial populations of D. dianthicola and D. solani shows that different aggressiveness in the host S. tuberosum is a distinctive trait of these pathogenic species; which reinforces the hypothesis of a recent host transfer (bulb plants to potato plants) of D. solani. Remarkably, in infected tissues of S. tuberosum (stem and tubers), the virulence genes pelD and pelE are highly expressed and more heterogeneously among D. solani isolates than those of D. dianthicola. A comparative transcriptomic analysis confirms the variability of the expression of virulence functions between 3 isolates of D. solani. All this work reveals that D. solani is still in adaptation phase to the host S. tuberosum, with less competitiveness against D. dianthicola during co-infection but an expression of the virulence functions in maceration condition greater that D. dianthicola. Thus, under the condition of selection of favorable genetic variations to its establishment on S. tuberosum host plant and the improvement of its competitiveness against D. dianthicola, D. solani represents a medium-term major risk for potato cultivation.

Le mélanome constitue un problème majeur de santé publique. En 2018, on estimait à 15 513 nouveaux cas en France et 1975 décès dûs à ce cancer. S’il ne représente qu’environ 10% des cancers cutanés, il est le plus agressif en raison de son très fort potentiel métastatique. Le développement de ces métastases met en jeu différentes étapes qui nécessitent d’être coordonnées par un ensemble de gènes. Dans les mélanomes, le facteur de transcription MITF connu pour son importance dans la différenciation et la survie des mélanocytes, joue ainsi un rôle majeur dans la progression tumorale. Plusieurs altérations génétiques telles que des mutations ou amplifications du gène ont été décrites et montrent son caractère oncogène, sans que les mécanismes expliquant les conséquences de ces modifications soient encore bien compris. Les altérations génétiques de MITF ne sont pas les seuls événements impliqués dans la mélanomagenèse. Les variations des niveaux d’expression de MITF sont également déterminantes dans l’évolution du mélanome. En effet, si son expression stimule la prolifération, son inhibition est nécessaire à l'émergence des métastases. Il est donc essentiel de comprendre les mécanismes en aval de ce facteur de transcription impliqués dans la progression tumorale.Mes travaux de thèse s’articulent autour de deux axes qui visent à mieux comprendre l’influence de MITF dans l’invasion. Le premier consiste à étudier les effets d’une mutation de MITF dans la progression tumorale du mélanome. Une analyse comparative de plusieurs lignées de mélanomes exprimant la forme sauvage ou mutée de MITF a ainsi permis d’identifier S100A4 comme étant différentiellement régulé dans les mélanomes mutés pour MITF. Notre étude montre que MITF réprime l’expression de S100A4 et que cette répression est levée lorsque MITF est muté, ce qui a pour conséquence de stimuler le potentiel d’invasion des mélanomes. Ces résultats sont confirmés par les données cliniques qui montrent que les patients atteints de mélanomes et présentant une amplification de S100A4 ont une espérance de vie plus faible que les patients où l'expression de S100A4 n'est pas altérée.Le deuxième axe de mon projet s’intéresse au rôle d’une cible en aval de MITF, le récepteur à l’IGF2 (IGF2R), dont l’expression est nécessaire à l’invasion des mélanomes. L'analyse des différentes fonctions de ce récepteur ont révélé que son rôle dans l’adressage des hydrolases vers les lysosomes est requis pour que ces cellules soient invasives. Ce transport nécessite le marquage des hydrolases au mannose-6-phosphate notamment catalysé par l’enzyme codée par GNPTAB dans l’appareil de Golgi et la perte d’expression de ce gène entraîne le même effet que la déplétion d’IGF2R, à savoir une inhibition forte de l’invasion. De manière intéressante, la déplétion d’IGF2R et de GNPTAB induit également une augmentation du nombre de lysosomes, associée à une augmentation de l’expression de TFEB, un régulateur connu de la biogenèse des lysosomes. Nos résultats montrent que ce facteur de transcription appartenant à la même famille que MITF est également impliqué dans la régulation de l’invasion tumorale des mélanomes. / Melanoma constitutes a major public health issue. In 2018, we estimated 15 513 new melanoma cases in France and 1975 deaths caused by this cancer. If it only represents 10% of all cutaneous cancers, it is the most aggressive one due to its high potential to form metastasis. Metastasis cascade is a multi-step process requiring the coordination of specific genes. In melanoma, the microphthalmia-associated transcription factor MITF, the master regulator of melanocyte differentiation and survival has also a crucial role during melanoma tumor progression. Some genetic alterations have been described, mutations and gene amplification, and showed its oncogenic properties, even if mechanisms associated to these genetic modifications in tumor progression remained unknown. Genetic alterations of MITF are not the only events involved in melanomagenesis. In fact, MITF expression levels are determining for melanoma evolution. MITF expression activates proliferation and its inhibition is necessary for metastasis. It is therefore crucial to understand what are the mechanisms downstream of MITF, involved in tumor progression.My PhD project is indeed organized in two different axis, in order to better understand the importance of MITF in melanoma invasion. The first one consisted to study the impact of a single-point MITF mutation in melanoma tumor progression involving direct regulation of S100A4 gene. A comparative analysis using melanoma cell lines expressing the wild-type or mutated form of MITF led us to identify S100A4 as one of the most up-regulated genes in MITF-mutant melanoma. Our findings showed us that the MITFE87R mutant form increases S100A4 transcription, whereas the wild-type form of MITF has an opposite effect. This regulation is important in melanoma tumor progression because it can stimulate invasive potential of non-invasive melanoma. These results are confirmed by clinical data showing that harboring S100A4 amplification is associated to a poor prognosis in melanoma patients, compared to patients presenting no S100A4 alteration.The second axis was interested in the role of IGF2 receptor (IGF2R), a MITF target gene known to regulate melanoma invasion. Among all the different functions attributed to this receptor, our data indicates that only its role in hydrolase trafficking to lysosomes is required for invasion. This transport requires mannose-6-phosphate binding to these hydrolases by the enzyme encoding by GNPTAB gene in Golgi apparatus; loss of GNPTAB expression leads to the same effect as IGF2R depletion, a high decrease of melanoma invasion. Interestingly, IGF2R and GNPTAB depletion also induce an increase in lysosome number, associated to an increase of TFEB expression, a well-known regulator in lysosome biogenesis. Our data showed that this member of the same MiT-TFE family as MITF is also involved in this melanoma invasion regulation.

Glioblastoma is the most malignant primary brain tumor with the average patients surviving only one year after diagnosis, even with aggressive therapy. The formation of numerous micro-tumors dispersed into the brain due to rapid invasion of tumor cells, presents the primary challenge to the surgical removal of tumors and limits the effectiveness of current treatments. This dissertation presents studies aimed at understanding the molecular mechanisms regulating invasion of human glioblastoma cells. Transplantation of human glioblastoma cells in the zebrafish brain showed that the knockdown of calpain 2, a calcium-activated protease, resulted in a three fold decrease in the tumor cell invasion. The result was further verified in the organotypic mouse brain slices where the knockdown cells demonstrated 2-fold decrease in the area of dispersal compared to control cells. Our data show that calpain 2 plays a role in the process of tumor cell angiogenesis. Glioblastoma cells were transplanted into the brain of zebrafish expressing GFP in the blood vessels and we observed that 23% of animals injected with control tumor cells demonstrated angiogenesis. In contrast, only 9% of fish that received calpain 2 knockdown cells showed the formation of new vessels. Consistent to the reports from human glioblastoma patients and rodent models, we did not observe metastasis of transplanted cells outside of the brain in the zebrafish, supporting for the use of zebrafish as an important model for glioblastoma cell invasion studies. These results provide evidence that calpain 2 protease activity is required for the dispersal of glioblastoma cells in the brain microenvironment. To determine the mechanism of calpain 2 regulation of tumor cell invasion, proteolysis of filamin by calpain 2 was studied. Filamin is an important actin cross-linking protein which develops orthogonal actin networks in the periphery of the cell. In this study, we show that the expression of filamin inhibits glioblastoma cell invasion. Hence, knocking down filamin expression by 80% resulted in 220% increase in the invasion of glioblastoma cells through Matrigel extracellular matrix. The regulated proteolysis of filamin is a potential mechanism to facilitate the cyclic turnover of actin orthogonal networks which is required for glioblastoma cell invasion. In this study, we identified a novel mechanism that the PI3 kinase activity regulates the cleavage of filamin by calpain 2 in glioblastoma cells. Binding of a membrane phospholipid phosphatidylinositol (3,4,5) triphosphate [PtdIns (3,4,5)-P₃] to filamin induces its proteolysis by calpain 2 after the amino acid lysine 268, removing the actin binding domain which in-turn abolishes the actin binding ability of filamin. / Graduation date: 2011 / Access restricted to the OSU Community at author's request from Jan. 31, 2011 - Jan. 31, 2012

Colon cancer occurs in over 150,000 men and women in the United States each year and is fatal about one third of the time. There are many well characterized genetic transformations which commonly occur during colon carcinogenesis, including mutations in the Adenometous Polyposis Coli (APC), Kirsten RAS (K-RAS) and p53 genes among many others. There are also many alterations in gene and protein expression which are not yet completely elucidated. We have identified kallikrein 6 (KLK6) as a gene whose expression is dependent on cancer associated proteins such as K-RAS, SRC and caveolin-1 (CAV-1). KLK6 is a member of the kallikrein protein family which consists of 15 secreted serine proteases. Like other types of proteases, kallikreins have been demonstrated to play a role in cancer progression and they hold promise as potential cancer biomarkers. The up-regulation of KLK6 was first identified by performing a microarray analysis on a mutant K-RAS transfected Caco2 cells. The activated K-RAS transfected cells expressed significantly more KLK6 than the mock transfected controls. Pathways downstream of K-RAS were found to induce KLK6 gene expression, including the p42/44 MAPK and the PI3-K/AKT pathways. Caveolae, plasma membrane associated structures, and their principle protein component, CAV-1, positively influence both KLK6 gene expression and KLK6 protein secretion in HCT116 colon cancer derived cells. Finally, it is shown that KLK6 increases the invasive potential of cells through laminin and Matrigel. Because KLK6 plays a role in cancer progression it may serves as a novel therapeutic target. Additionally, KLK6 holds potential for use as a serum biomarker for multiple types of cancer, including colon cancer for colon and other types of cancer.

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