In part one, betulinic acid (1) was isolated from the American Sycamore (Platanus occidentalis) in 1.6% yield, while ursolic acid (3) was isolated from Fuji and McIntosh apple peels in 1.0% and 0.8% crude yields, respectively. Oleanolic (4) and dehydrocanophyllic (6) acids were previously available, along with several analogs. Additional analogs of 1, 3 and 4 were prepared, including 9 new compounds, for a total of 51 compounds. Compounds were initially screened for cortisol lowering properties in vitro using a fish head kidney cell assay. Platanic acid (43) was selected for in vivo study in rats, along with 1 and a blend of Platanus occidentalis and Souroubea sympetela. No significant cortisol lowering was observed in vivo. In part two, β-ionone-d6 (75) was synthesized in 6.5% yield from ethyl 2-oxo-cyclohexane carboxylate (77). Total deuterium incorporation was 99.85%, with 0.03% d0 analog. 75 was converted to retinoic acid-d6 (93) in 2.2% yield.

In part one, betulinic acid (1) was isolated from the American Sycamore (Platanus occidentalis) in 1.6% yield, while ursolic acid (3) was isolated from Fuji and McIntosh apple peels in 1.0% and 0.8% crude yields, respectively. Oleanolic (4) and dehydrocanophyllic (6) acids were previously available, along with several analogs. Additional analogs of 1, 3 and 4 were prepared, including 9 new compounds, for a total of 51 compounds. Compounds were initially screened for cortisol lowering properties in vitro using a fish head kidney cell assay. Platanic acid (43) was selected for in vivo study in rats, along with 1 and a blend of Platanus occidentalis and Souroubea sympetela. No significant cortisol lowering was observed in vivo. In part two, β-ionone-d6 (75) was synthesized in 6.5% yield from ethyl 2-oxo-cyclohexane carboxylate (77). Total deuterium incorporation was 99.85%, with 0.03% d0 analog. 75 was converted to retinoic acid-d6 (93) in 2.2% yield.

O câncer é um dos principais problemas de saúde pública no mundo. Dentre as neoplasias primárias que acometem o fígado, o carcinoma hepatocelular (HCC) é a mais frequente. Diversos fatores de risco predispõem ao HCC, entre eles a doença hepática gordurosa não-alcoólica (NAFLD). Segundo estudos prévios do grupo, a &#946;-ionona (BI), presente em uvas e aromatizantes de vinho, apresenta potencial quimiopreventivo da hepatocarcinogênese. Além disso, a &#946;I parece atuar na redução da colesterolemia podendo, assim, influenciar a NAFLD. Desta forma pretendeu-se, neste projeto, avaliar o desenvolvimento da NAFLD e sua influência nas etapas de iniciação e seleção/promoção da hepatocarcinogênese em ratos Wistar submetidos ao modelo do hepatócito resistente (RH), além da atividade quimiopreventiva da &#946;I, nessas condições experimentais em ratos. Para isso, os animais foram alocados em 6 grupos experimentais: RH iniciação (n=11), NAFLD iniciação (n=15), BI iniciação (n=15), RH seleção/promoção (n=11), NAFLD seleção promoção (n=15) e BI seleção/promoção (n=15). Na fase de iniciação os animais do grupo NAFLD receberam, diariamente, emulsão hipercalórica até a sexta semana do experimento um dia antes da administração de DEN. Já na fase de seleção/promoção os animais do grupo NAFLD receberam a emulsão hipercalórica, a partir de um dia após a DEN. Os animais dos grupos RH da iniciação e da seleção/promoção servem como controles e receberam, diariamente, 1mL/100g peso corpóreo de água até a sexta semana do experimento e um dia após a DEN, respectivamente. Na fase de iniciação, após 13 semanas os animais do grupo NAFLD não demonstraram sinais de esteatose, apresentaram maiores níveis séricos de triacilglicerol, colesterol total e LDL comparados ao grupo RH (P<0,05). O grupo NAFLD apresentou maior porcentagem de nódulos macroscópicos, bem como maior número e porcentagem de área hepática de lesões pré neoplásicas persistentes (pLPN) comparado ao grupo RH (P<0,05). Já o grupo BI apresentou menor número de pLPN e maior número de lesões em remodelação e uma maior porcentagem de área hepática de rLPN (p<0,05). Em relação a proliferação celular, o grupo NAFLD apresentou maior número de células em sourrounding, pLPN e rLPN comparada ao grupo RH e o grupo BI menor número em pLPN comparada a NAFLD. Já na fase de seleção/promoção foi possível observar o grupo NAFLD tem maiores valores de focos de inflamação, hepatócitos balonizados e grau de esteatose hepática em relação ao grupo BI, assim como maiores níveis séricos de triacilgliceróis, colesterol total e LDL (p<0,05). O grupo NAFLD apresentou maior porcentagem de nódulos macroscópicos <1, maior número, menor tamanho médio de pLPN comparados ao grupo RH (p<0,05). O grupo BI apresentou menor número e menor porcentagem de área em pLPN e maior porcentagem de área em rLPN (p<0,05). Em relação a proliferação celular, o grupo NAFLD apresentou maior número de células em sourrounding, pLPN e rLPN comparada ao grupo RH (p<0,05). Na expressão gênica, o grupo BI apresentou maior expressão de HMGCR em relação grupo NAFLD (p<0,05), O grupo NAFLD apresentou maior expressão de INSIG1 em relação ao grupo RH (p<0,05) e tendência na expressão de INSIG 2. / Cancer is a major public health problems in the world. Among the primary neoplasm affecting the liver, hepatocellular carcinoma (HCC) is the most frequent. Several risk factors predispose to HCC, including the non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). According to previous studies of the group, &#946;-ionone (BI), present in grapes and flavors of wine, it presents potential chemopreventive of hepatocarcinogenesis. Furthermore, &#946;I appears to act in reducing blood cholesterol and may thus influence NAFLD. In this way it was intended in this project, evaluate the development of NAFLD and its influence on the steps of initiation and selection/promotion of hepatocarcinogenesis in Wistar rats resistant hepatocyte model (HR), and the chemopreventive activity of &#946;I, these experimental conditions in rats. For this, the animals were divided into 6 groups: RH initiation (n = 11), NAFLD initiation (n = 15), BI initiation (n = 15), HR selection / promotion (n = 11), NAFLD selection promotion ( n = 15) and BI selection / promotion (n = 15). In the inception phase of the NAFLD group animals received daily calorie emulsion until the sixth week of the experiment one day prior to DEN administration. In the selection / promotion stage NAFLD group of animals received hypercaloric emulsion, from one day after the DEN. The animals of groups HR and selection of initiation / promotion serve as controls and received daily 1mL / 100g body weight of water until the sixth week of the experiment, and one day after DEN respectively. In the initiation phase, after 13 weeks the animals of group NAFLD showed no signs steatosis, had higher serum levels of triglyceride, total cholesterol and LDL compared to the HR group (P <0.05). The NAFLD showed higher prevalence of macroscopic nodules as well as higher number and percentage of liver area of persistent pre-neoplastic lesions (pLPN) compared to the HR group (P <0.05). But the BI group had fewer pLPN and higher number of lesions in remodeling and a higher percentage of liver area rLPN (p <0.05). In relation to cell proliferation, the NAFLD group had a higher number of cells in sourrounding, pLPN and rLPN compared to the RH group and the lowest number in pLPN BI group compared to NAFLD. In the selection / promotion layer was observed NAFLD group has the highest values of inflammation foci, balonizados hepatocytes and hepatic steatosis grade in relation to BI group as well as higher serum levels of triglyceride, total cholesterol and LDL (p <0 , 05). The NAFLD showed higher prevalence of macroscopic nodules <1, more, smaller average size pLPN compared to the HR group (p <0.05). The BI group had fewer and smaller percentage area in pLPN and higher percentage of area rLPN (p <0.05). In relation to cell proliferation, the NAFLD group had a higher number of cells in sourrounding, pLPN and rLPN compared to the HR group (p <0.05). In gene expression, the BI group showed higher expression of HMGCR regarding NAFLD group (p <0.05), the NAFLD group had higher expression of INSIG1 against the RH group (p <0.05) and a tendency in the expression of INSIG 2.

O câncer é um dos principais problemas de saúde pública no mundo. Dentre as neoplasias primárias que acometem o fígado, o carcinoma hepatocelular (HCC) é a mais frequente. Diversos fatores de risco predispõem ao HCC, entre eles a doença hepática gordurosa não alcóolica (NAFLD). Segundo estudos prévios do grupo, a &#946-ionona (BI), apresenta potencial quimiopreventivo na hepatocarcinogênese, promovendo redução de lesões preneoplásicas (LPN). Assim pretendeu-se investigar se a NAFLD potencializaria o desenvolvimento de LPN em ratos Wistar submetidos ao modelo do hepatócito resistente (RH) na etapa de iniciação/promoção inicial da hepatocarcinogênese e se a BI apresenta efeito quimiopreventivo nesse contexto. Para tanto, os animais foram distribuídos em 4 grupos experimentais: grupo não-tratado (NT), grupo submetido ao RH (RH), grupo submetido ao RH e ao modelo de NAFLD, que consiste na administração de emulsão hiperlipídica, (AS) e grupo AS tratado com BI (AS + BI). Em uma primeira instância, 5 animais pertencentes aos grupos NT, AS,AS + BI foram eutanasiados após 6 semanas de administração de emulsão hiperlipídica, antes da aplicação do modelo RH, para se confirmar o desenvolvimento da NAFLD. Foi possível observar que a administração de emulsão hiperlipídica durante 6 semanas foi suficiente para o desenvolvimento de esteatose hepática. Após as 6 semanas foi introduzido o modelo do RH concomitante à administração da emulsão hipercalipídica até o fim do experimento na 13a semana . Após 13 semanas o grupo AS apresentou maiores (p<0,05) valores de focos de inflamação, hepatócitos balonizados e grau de esteatose hepática em relação ao grupo AS+BI, assim como maiores (p<0,05) níveis séricos de triacilgliceróis, colesterol, HDL, LDL, VLDL, e maior (p<0,05) valor de MDA em relação ao grupo RH embora sem diferença estatística. O grupo AS também apresentou maior (p<0,05) incidência, número total e multiplicidade de nódulos, além de maior (p<0,05) número e tamanho de LPN persistentes (pLPN) e índice de proliferação quando comparado aos grupos RH e AS+BI. O grupo AS + BI, por sua vez, demonstrou menores (p<0,05) valores de escore de células ovais e menores valores de comprimentos de cometa e danos no DNA quando comparado ao grupo AS, embora sem diferença estatista para este último parâmetro. Em relação à expressão gênica, o grupo AS apresentou menores (p<0,05) valores de expressão do gene Hmgcr em relação ao grupo RH e maiores (p<0,05) valores dos genes Insig 1 e Thy 1 quando comparados ao grupo AS+BI. Portanto, no contexto de esteatose hepática associada ao modelo do RH, a administração de BI durante a etapa de iniciação/promoção em ratos Wistar resultou em atividade quimiopreventiva que se deu pela diminuição de pLNP, redução da proliferação celular e do número de células ovais, consideradas potenciais alvos para o desenvolvimento da hepatocarcinogênese, entretanto os genes analisados parecem não serem modulados pela BI. / Cancer is a major public health problem in the world. Among the primary neoplasms affecting the liver, hepatocellular carcinoma (HCC) is the most frequent. Several risk factors predispose to HCC, including the nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). According to previous studies of the group, the &#946-ionone (BI), has potential chemopreventive in hepatocarcinogenesis, promoting reduction of preneoplastic lesions (LPN). Thus we investigated whether NAFLD would increase the development of LPN in Wistar rats resistant hepatocyte model (RH) at the stage of initiation / promotion of hepatocarcinogenesis and if BI has chemopreventive effect in this context. Therefore, the animals were divided into 4 groups: non-treated group (NT), the group submitted to HR (HR), the group submitted to HR and NAFLD model, consisting of the fatty emulsion administration (AS) and AS group treated with BI (AS + BI). In a first point, 5 animals belonging to the groups NT, AS, AS + BI were euthanized after 6 weeks of administration of fat emulsion prior to application of the HR model, to confirm the development of NAFLD. It was observed that the administration of fatty emulsion for 6 weeks was sufficient to the development of hepatic steatosis. After 6 weeks it was introduced into the model HR the concomitant administration of fatty emulsion until the end of the experiment at 13 weeks. In the endpoint, the AS group had higher (p <0.05) of serum triacylglycerols, cholesterol, HDL, LDL, VLDL although no statistical difference inrelation to RH group, and increased (p <0.05) amount of MDA in relation to the group RH. The AS group also had higher (p <0.05) incidence, multiplicity and total number of nodes and greater (p <0.05) number and size of persistent LPN (pLPN) and proliferation index when compared to HR groups and AS + BI. AS + BI group. It was observed in AS+BI group lower (p <0.05) cell oval score values compared to AS group. In addition the AS+BI group showed lower values of the comet length and DNA damage compared to the AS group, although no statistical differences. In relation to gene expression, the AS group showed lower(p <0.05) HMGCR gene expression values in relation to HR group and higher (p <0.05) expression of Insig genes 1 and Thy 1 compared to group AS + BI.Therefore, in the context of hepatic steatosis associated with HR model BI for administration to the stage of initiation / promotion in rats resulted in chemopreventive activity was due to decrease in area of pLNP, reducing cell proliferation, and the number of oval cells, as potential targets for the development of hepatocarcinogenesis, however the genes do not seem to be modulated analyzed by BI.

O câncer é um dos principais problemas de saúde pública no mundo. Dentre as neoplasias primárias que acometem o fígado, o carcinoma hepatocelular (HCC) é a mais frequente. Diversos fatores de risco predispõem ao HCC, entre eles a doença hepática gordurosa não-alcoólica (NAFLD). Segundo estudos prévios do grupo, a &#946;-ionona (BI), presente em uvas e aromatizantes de vinho, apresenta potencial quimiopreventivo da hepatocarcinogênese. Além disso, a &#946;I parece atuar na redução da colesterolemia podendo, assim, influenciar a NAFLD. Desta forma pretendeu-se, neste projeto, avaliar o desenvolvimento da NAFLD e sua influência nas etapas de iniciação e seleção/promoção da hepatocarcinogênese em ratos Wistar submetidos ao modelo do hepatócito resistente (RH), além da atividade quimiopreventiva da &#946;I, nessas condições experimentais em ratos. Para isso, os animais foram alocados em 6 grupos experimentais: RH iniciação (n=11), NAFLD iniciação (n=15), BI iniciação (n=15), RH seleção/promoção (n=11), NAFLD seleção promoção (n=15) e BI seleção/promoção (n=15). Na fase de iniciação os animais do grupo NAFLD receberam, diariamente, emulsão hipercalórica até a sexta semana do experimento um dia antes da administração de DEN. Já na fase de seleção/promoção os animais do grupo NAFLD receberam a emulsão hipercalórica, a partir de um dia após a DEN. Os animais dos grupos RH da iniciação e da seleção/promoção servem como controles e receberam, diariamente, 1mL/100g peso corpóreo de água até a sexta semana do experimento e um dia após a DEN, respectivamente. Na fase de iniciação, após 13 semanas os animais do grupo NAFLD não demonstraram sinais de esteatose, apresentaram maiores níveis séricos de triacilglicerol, colesterol total e LDL comparados ao grupo RH (P<0,05). O grupo NAFLD apresentou maior porcentagem de nódulos macroscópicos, bem como maior número e porcentagem de área hepática de lesões pré neoplásicas persistentes (pLPN) comparado ao grupo RH (P<0,05). Já o grupo BI apresentou menor número de pLPN e maior número de lesões em remodelação e uma maior porcentagem de área hepática de rLPN (p<0,05). Em relação a proliferação celular, o grupo NAFLD apresentou maior número de células em sourrounding, pLPN e rLPN comparada ao grupo RH e o grupo BI menor número em pLPN comparada a NAFLD. Já na fase de seleção/promoção foi possível observar o grupo NAFLD tem maiores valores de focos de inflamação, hepatócitos balonizados e grau de esteatose hepática em relação ao grupo BI, assim como maiores níveis séricos de triacilgliceróis, colesterol total e LDL (p<0,05). O grupo NAFLD apresentou maior porcentagem de nódulos macroscópicos <1, maior número, menor tamanho médio de pLPN comparados ao grupo RH (p<0,05). O grupo BI apresentou menor número e menor porcentagem de área em pLPN e maior porcentagem de área em rLPN (p<0,05). Em relação a proliferação celular, o grupo NAFLD apresentou maior número de células em sourrounding, pLPN e rLPN comparada ao grupo RH (p<0,05). Na expressão gênica, o grupo BI apresentou maior expressão de HMGCR em relação grupo NAFLD (p<0,05), O grupo NAFLD apresentou maior expressão de INSIG1 em relação ao grupo RH (p<0,05) e tendência na expressão de INSIG 2. / Cancer is a major public health problems in the world. Among the primary neoplasm affecting the liver, hepatocellular carcinoma (HCC) is the most frequent. Several risk factors predispose to HCC, including the non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). According to previous studies of the group, &#946;-ionone (BI), present in grapes and flavors of wine, it presents potential chemopreventive of hepatocarcinogenesis. Furthermore, &#946;I appears to act in reducing blood cholesterol and may thus influence NAFLD. In this way it was intended in this project, evaluate the development of NAFLD and its influence on the steps of initiation and selection/promotion of hepatocarcinogenesis in Wistar rats resistant hepatocyte model (HR), and the chemopreventive activity of &#946;I, these experimental conditions in rats. For this, the animals were divided into 6 groups: RH initiation (n = 11), NAFLD initiation (n = 15), BI initiation (n = 15), HR selection / promotion (n = 11), NAFLD selection promotion ( n = 15) and BI selection / promotion (n = 15). In the inception phase of the NAFLD group animals received daily calorie emulsion until the sixth week of the experiment one day prior to DEN administration. In the selection / promotion stage NAFLD group of animals received hypercaloric emulsion, from one day after the DEN. The animals of groups HR and selection of initiation / promotion serve as controls and received daily 1mL / 100g body weight of water until the sixth week of the experiment, and one day after DEN respectively. In the initiation phase, after 13 weeks the animals of group NAFLD showed no signs steatosis, had higher serum levels of triglyceride, total cholesterol and LDL compared to the HR group (P <0.05). The NAFLD showed higher prevalence of macroscopic nodules as well as higher number and percentage of liver area of persistent pre-neoplastic lesions (pLPN) compared to the HR group (P <0.05). But the BI group had fewer pLPN and higher number of lesions in remodeling and a higher percentage of liver area rLPN (p <0.05). In relation to cell proliferation, the NAFLD group had a higher number of cells in sourrounding, pLPN and rLPN compared to the RH group and the lowest number in pLPN BI group compared to NAFLD. In the selection / promotion layer was observed NAFLD group has the highest values of inflammation foci, balonizados hepatocytes and hepatic steatosis grade in relation to BI group as well as higher serum levels of triglyceride, total cholesterol and LDL (p <0 , 05). The NAFLD showed higher prevalence of macroscopic nodules <1, more, smaller average size pLPN compared to the HR group (p <0.05). The BI group had fewer and smaller percentage area in pLPN and higher percentage of area rLPN (p <0.05). In relation to cell proliferation, the NAFLD group had a higher number of cells in sourrounding, pLPN and rLPN compared to the HR group (p <0.05). In gene expression, the BI group showed higher expression of HMGCR regarding NAFLD group (p <0.05), the NAFLD group had higher expression of INSIG1 against the RH group (p <0.05) and a tendency in the expression of INSIG 2.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / A &#946;-ionona (4-[2,6,6-trimetill-1-ciclohexeno]-3-buten-2-ona) à um sesquiterpeno (terpenoide degradado - C13) presente na estrutura molecular do retinol, &#946;-caroteno e Ãcido retinÃico, sendo formado a partir da via do mevalonato em diferentes tipos de plantas. As pesquisas sobre as atividades biolÃgicas da &#946;-ionona ainda sÃo incipientes e poucos resultados com este composto sÃo encontrados na literatura. Este estudo visa investigar a atividade da &#946;-ionona no modelo de lesÃo gÃstrica induzida por etanol. A manipulaÃÃo dos animais e os protocolos experimentais foram registrados na ComissÃo de Ãtica em Pesquisa Animal (CEPA) sob o nÃmero 87/2011. Camundongos Swiss (n = 8), em jejum de 18 h, receberam, por gavagem, BI nas doses de 6,25; 12,5; 25; 50 e 100 mg/kg. ApÃs 60 min da administraÃÃo de BI os animais receberam 0,2 ml de etanol absoluto por gavagem. Decorridos 60 min dessa administraÃÃo, os animais foram sacrificados, os estÃmagos removidos e analisados para determinaÃÃo do Ãndice de lesÃo. A avaliaÃÃo histopatolÃgica do estÃmago foi realizada atribuindo escores aos parÃmetros de edema, hemorragia, perda de cÃlulas epiteliais e infiltrado inflamatÃrio. Para investigar o envolvimento de mediadores no efeito de BI, os animais receberam indometacina (10 mg/kg; v.o.), L-NAME (20 mg/kg; i.p.), ODQ (10 mg/kg; i.p.), glibenclamida (5 mg/kg; i.p.) e capsazepina (5 mg/kg; i.p) antes do tratamento com BI (12,5 mg/kg; v.o.). Misoprostol (50 Âg/kg v.o), L-arginina (600 mg/kg; i.p.), diazÃxido (3 mg/kg; i.p.) e capsaicina (0,3 mg/kg; v.o.) foram utilizados padrÃo positivo. Os nÃveis de nitrito e glutationa foram dosados na mucosa do estÃmago para investigar o efeito da BI sobre os nÃveis de NO e seu efeito antioxidante, respectivamente. O tratamento dos animais com a BI (12,5; 25; 50 e 100 mg/kg), reduziu significativamente e de forma dose-dependente, a Ãrea da lesÃo gÃstrica induzida pelo etanol para (11,41  2,0; 7,92  1,8*; 6,32  2,0 e 1,43  0,42 % respectivamente). Entretanto, a BI na menor dose avaliada (6,25 mg/kg), nÃo apresentou reduÃÃo significativa da Ãrea ulcerada (21,97  1,8%). A administraÃÃo de BI reduziu os escores de hemorragia, edema e a perda de cÃlulas epiteliais. A Indometacina e capsazepina nÃo foram capazes de reverter o efeito protetor da BI. O prÃ-tratamento dos animais com L-NAME, ODQ e Glibenclamida reverteu o efeito gastroprotetora da BI, mostrando o envolvimento do NO e canais KATP no seu mecanismo de aÃÃo. O grupo prÃ-tratado com BI (12,5 mg/kg v.o.) mostrou uma maior concentraÃÃo de nitrito (24,18 mM) quando comparado ao grupo controle (17,68 mM). O prà tratamento com BI foi efetivo em proteger contra o dano oxidativo (346,4  60,32 Âg/g de tecido), evitando a depleÃÃo nos nÃveis de GSH no tecido. Estes resultados indicam que a &#946;-ionona possui efeito gastroprotetor no modelo de LesÃo GÃstrica induzida por Etanol mediado pela via NOGMPcKATP e atravÃs da mediaÃÃo do terpeno na depleÃÃo dos nÃveis de GSH provocado pelo etanol. / The &#946;-ionone (4-[2,6,6-cyclohexene-1-trimetill]-3-butene-2-one) is a sesquiterpene (degraded terpenoid - C13) present in the molecular structure of retinol and &#946;-carotene acid retinoic being formed from the mevalonate pathway in different types of plants. Research on the biological activities of &#946;-ionone are still incipient and limited results with this compound are found in the literature. This study aims to investigate the activity of &#946;-ionone in the model of ethanol-induced gastric injury. Handling of animals and experimental protocols were recorded by the Ethics Committee on Animal Research (CEPA) under number 87/2011. Swiss mice (n = 8), fasted 18 hours, were orally treated with BI at doses of 6.25, 12.5, 25, 50 and 100mg/kg. After 60 min of administration BI animals received 0.2 ml of absolute ethanol po. After 60 min this administration, the animals were sacrificed, the stomachs removed and analyzed to determine the rate of injury. Histologic examination of the stomach was performed by assigning scores to the parameters of edema, hemorrhage, loss of epithelial cells and inflammatory infiltrate. To investigate the role of mediators in BI effect, animals received indomethacin (10 mg / kg, po), L-NAME (20 mg / kg, ip) ODQ (10 mg / kg, ip), glibenclamide (5 mg / kg, ip) and capsazepine (5 mg / kg, ip) before treatment with BI (12.5 mg / kg, po). Misoprostol (50 mg / kg po), L-arginine (600 mg / kg, ip), diazoxide (3 mg / kg, ip) and capsaicin (0.3 mg / kg, po) was used positive pattern. The levels of nitrite and glutathione were measured in the stomach mucosa to investigate the effect of BI on the levels of NO and its antioxidant effect, respectively. Treatment of animals with the BI (12.5, 25, 50 and 100 mg / kg) reduced significantly and dose-dependent manner, the area of ethanol-induced gastric lesion to (11.41  2.0, 7 92 *  1.8, 6.32  2.0 and 1.43  0.42% respectively). However, the BI lowest tested dose (6.25 mg / kg) showed no significant reduction of the ulcerated area (21.97  1.8%). The administration of BI scores decreased hemorrhage, edema and loss of epithelial cells. The capsazepine and indomethacin were not able to reverse the protective effect of BI. Pretreatment of animals with L-NAME, ODQ and glibenclamide reversed the gastroprotective effect of BI, showing the involvement of NO and KATP channels in its mechanism of action. The group pretreated with BI (12.5 mg / kg po) showed a higher concentration of nitrite (24.18 mM) compared to the control group (17.68 mM). The pretreatment BI was effective in protecting against oxidative damage (346.4  60.32 mg / g of tissue), preventing depletion of GSH levels in tissue. These results indicate that the &#946;-ionone has gastroprotective effect in the model of ethanol-induced gastric injury mediated by the NO cGMP K ATP and terpene through the mediation of the GSH depletion induced by ethanol.

O câncer é um dos principais problemas de saúde pública no mundo. Dentre as neoplasias primárias que acometem o fígado, o carcinoma hepatocelular (HCC) é a mais frequente. Diversos fatores de risco predispõem ao HCC, entre eles a doença hepática gordurosa não alcóolica (NAFLD). Segundo estudos prévios do grupo, a &#946-ionona (BI), apresenta potencial quimiopreventivo na hepatocarcinogênese, promovendo redução de lesões preneoplásicas (LPN). Assim pretendeu-se investigar se a NAFLD potencializaria o desenvolvimento de LPN em ratos Wistar submetidos ao modelo do hepatócito resistente (RH) na etapa de iniciação/promoção inicial da hepatocarcinogênese e se a BI apresenta efeito quimiopreventivo nesse contexto. Para tanto, os animais foram distribuídos em 4 grupos experimentais: grupo não-tratado (NT), grupo submetido ao RH (RH), grupo submetido ao RH e ao modelo de NAFLD, que consiste na administração de emulsão hiperlipídica, (AS) e grupo AS tratado com BI (AS + BI). Em uma primeira instância, 5 animais pertencentes aos grupos NT, AS,AS + BI foram eutanasiados após 6 semanas de administração de emulsão hiperlipídica, antes da aplicação do modelo RH, para se confirmar o desenvolvimento da NAFLD. Foi possível observar que a administração de emulsão hiperlipídica durante 6 semanas foi suficiente para o desenvolvimento de esteatose hepática. Após as 6 semanas foi introduzido o modelo do RH concomitante à administração da emulsão hipercalipídica até o fim do experimento na 13a semana . Após 13 semanas o grupo AS apresentou maiores (p<0,05) valores de focos de inflamação, hepatócitos balonizados e grau de esteatose hepática em relação ao grupo AS+BI, assim como maiores (p<0,05) níveis séricos de triacilgliceróis, colesterol, HDL, LDL, VLDL, e maior (p<0,05) valor de MDA em relação ao grupo RH embora sem diferença estatística. O grupo AS também apresentou maior (p<0,05) incidência, número total e multiplicidade de nódulos, além de maior (p<0,05) número e tamanho de LPN persistentes (pLPN) e índice de proliferação quando comparado aos grupos RH e AS+BI. O grupo AS + BI, por sua vez, demonstrou menores (p<0,05) valores de escore de células ovais e menores valores de comprimentos de cometa e danos no DNA quando comparado ao grupo AS, embora sem diferença estatista para este último parâmetro. Em relação à expressão gênica, o grupo AS apresentou menores (p<0,05) valores de expressão do gene Hmgcr em relação ao grupo RH e maiores (p<0,05) valores dos genes Insig 1 e Thy 1 quando comparados ao grupo AS+BI. Portanto, no contexto de esteatose hepática associada ao modelo do RH, a administração de BI durante a etapa de iniciação/promoção em ratos Wistar resultou em atividade quimiopreventiva que se deu pela diminuição de pLNP, redução da proliferação celular e do número de células ovais, consideradas potenciais alvos para o desenvolvimento da hepatocarcinogênese, entretanto os genes analisados parecem não serem modulados pela BI. / Cancer is a major public health problem in the world. Among the primary neoplasms affecting the liver, hepatocellular carcinoma (HCC) is the most frequent. Several risk factors predispose to HCC, including the nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). According to previous studies of the group, the &#946-ionone (BI), has potential chemopreventive in hepatocarcinogenesis, promoting reduction of preneoplastic lesions (LPN). Thus we investigated whether NAFLD would increase the development of LPN in Wistar rats resistant hepatocyte model (RH) at the stage of initiation / promotion of hepatocarcinogenesis and if BI has chemopreventive effect in this context. Therefore, the animals were divided into 4 groups: non-treated group (NT), the group submitted to HR (HR), the group submitted to HR and NAFLD model, consisting of the fatty emulsion administration (AS) and AS group treated with BI (AS + BI). In a first point, 5 animals belonging to the groups NT, AS, AS + BI were euthanized after 6 weeks of administration of fat emulsion prior to application of the HR model, to confirm the development of NAFLD. It was observed that the administration of fatty emulsion for 6 weeks was sufficient to the development of hepatic steatosis. After 6 weeks it was introduced into the model HR the concomitant administration of fatty emulsion until the end of the experiment at 13 weeks. In the endpoint, the AS group had higher (p <0.05) of serum triacylglycerols, cholesterol, HDL, LDL, VLDL although no statistical difference inrelation to RH group, and increased (p <0.05) amount of MDA in relation to the group RH. The AS group also had higher (p <0.05) incidence, multiplicity and total number of nodes and greater (p <0.05) number and size of persistent LPN (pLPN) and proliferation index when compared to HR groups and AS + BI. AS + BI group. It was observed in AS+BI group lower (p <0.05) cell oval score values compared to AS group. In addition the AS+BI group showed lower values of the comet length and DNA damage compared to the AS group, although no statistical differences. In relation to gene expression, the AS group showed lower(p <0.05) HMGCR gene expression values in relation to HR group and higher (p <0.05) expression of Insig genes 1 and Thy 1 compared to group AS + BI.Therefore, in the context of hepatic steatosis associated with HR model BI for administration to the stage of initiation / promotion in rats resulted in chemopreventive activity was due to decrease in area of pLNP, reducing cell proliferation, and the number of oval cells, as potential targets for the development of hepatocarcinogenesis, however the genes do not seem to be modulated analyzed by BI.

The necrotrophic fungus Botrytis cinerea (B. cinerea) is one of the most aggressive and widespread pathogenic fungi, causing the gray mold disease in over 200 different plants species and severely impacting the quality of harvested fruits. Due to B. cinerea resistance to common synthetic fungicides and their ecological impact, there is a large demand for novel control approaches, such as bio-fungicides. The family of carotenoid-cleavage products, i.e. apocarotenoids, includes important compounds, such as hormones, signaling molecules and growth regulators. Previous studies indicated that the apocarotenoid B-ionone inhibits the growth of some fungal species. In this thesis, we unravel a novel role for B-ionone as a plant regulatory metabolite increasing the resistance against B. cinerea in several plant models. We achieved this by combining phenotypic, transcriptomic, and metabolomic analysis. We show that pretreatment of Arabidopsis plants with B-ionone significantly alleviated the symptoms of B. cinerea infection, modulated hormone homeostasis and affected the interactions between jasmonic acid (JA)/ethylene (ET) and abscisic acid (ABA) hormone signaling pathways β-ionone treatment stimulated JA/ET signaling pathways and repressed the synthesis of ABA upon B. cinerea infection, which reduced the susceptibility of Arabidopsis plants to B. cinerea. To get an overview on the effect of β-ionone on plants at transcript level, we performed an RNA-seq experiment that supported our hypothesis that B-ionone primes and enhances the Arabidopsis immune response to B. cinerea infection and raveled the effect of this volatile on the expression of several transcription factors involved in Arabidopsis immune response to B. cinerea and on transcripts related to cell wall biosynthesis, Map Kinase 3 signaling and hypoxia tolerance. Further experiments performed with transgenic tobacco and tomato plants confirmed the positive role of β-ionone in reducing the symptoms of B. cinerea in green tissues as well as in tomato fruits. The discovery of β-ionone as a new apocarotenoid signaling molecule that regulates plant hormone homeostasis opens up new possibility to control B. cinerea infection and to establish this natural volatile as an environmentally friendly and safe bio-fungicide.

Les Rétinal déshydrogénases (RALDHs) catalysent irréversiblement la déshydrogénation du Rétinal en Acide Rétinoïque (AR) qui est impliqué dans l’embryogenèse et la différenciation tissulaire. Pour comprendre le rôle dans la biosynthèse de l’AR des RALDHs type 3 et 4 de souris, nous avons déterminé leurs propriétés cinétiques ainsi que leur comportement en présence de différents inhibiteurs. Les tests enzymatiques sont effectués avec une préparation d’enzyme recombinante, tagguée avec 6 histidines, purifiée sur colonne Ni-NTA (Qiagen). L’activité enzymatique est évaluée en quantifiant la production d’AR par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) en phase inversée. Les constantes cinétiques ont été déterminées pour les isomères du rétinal tout-trans, 9-cis et 13-cis. La RALDH4 catalyse les isomères 9-cis et 13-cis de rétinal, elle présente un faible KM (3μM) pour les deux isomères et a une efficacité catalytique élevée pour le 9-cis rétinal 3.4 fois supérieure au 13-cis rétinal. La RALDH3 est spécifique au tout-trans rétinal avec un KM de 4 μM et une efficacité élevée. β-Ionone, inhibiteur possible pour la RALDH4, inhibe l’activité avec le rétinal 9-cis et 13-cis, mais n’influence pas l’activité de la RALDH3. Le para-hydroxymercuribenzoïque (p-HMB) inhibe l’activité de deux isoenzymes. Le cation MgCl2 augmente par 3 fois l’oxydation du rétinal 13-cis par la RALDH4, diminue l’oxydation du 9-cis rétinal et influence faiblement la RALDH3. Ces données enrichissent les connaissances sur les caractéristiques cinétiques des RALDHs recombinantes de souris de types 3 et 4 et fournissent des éclaircissements sur la biogenèse de l’acide rétinoïque in vivo. / SUMMARY Retinal dehydrogenases (RALDHs) catalyze the dehydrogenation of retinal into retinoic acids (RA) that are required for embryogenesis and tissue differentiation. This study sought to determine the detailed kinetic properties of 2 mouse RALDHs, namely RALDH3 and 4, for retinal isomer substrates, to better define their specificities in RA isomer synthesis. RALDH3 and 4 were expressed as His-tagged proteins and affinity-purified. RALDH3 oxidized all-trans retinal with high catalytic efficiency but did not show activity for either 9-cis or 13-cis retinal substrates. RALDH4 was inactive for all-trans retinal substrate, exhibited high activity for 9-cis retinal oxidation, and oxidized 13-cis retinal with lower catalytic efficiency. β-ionone, a potent inhibitor of RALDH4 activity, suppressed 9-cis and 13-cis retinal oxidation competitively, but had no effect on RALDH3 activity. The p-HMB inhibited the activity for both RALDH3 and RALDH4. The divalent cation MgCl2 activated 13-cis retinal oxidation by RALDH4 by 3-fold, slightly decreased 9-cis retinal oxidation, and did not significantly influence RALDH3 activity. These data extend the kinetic characterization of RALDH3 and 4, providing their specificities for retinal isomer substrates, which should help in determining their functions in the synthesis of RAs in specific tissues.

Les Rétinal déshydrogénases (RALDHs) catalysent irréversiblement la déshydrogénation du Rétinal en Acide Rétinoïque (AR) qui est impliqué dans l’embryogenèse et la différenciation tissulaire. Pour comprendre le rôle dans la biosynthèse de l’AR des RALDHs type 3 et 4 de souris, nous avons déterminé leurs propriétés cinétiques ainsi que leur comportement en présence de différents inhibiteurs. Les tests enzymatiques sont effectués avec une préparation d’enzyme recombinante, tagguée avec 6 histidines, purifiée sur colonne Ni-NTA (Qiagen). L’activité enzymatique est évaluée en quantifiant la production d’AR par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) en phase inversée. Les constantes cinétiques ont été déterminées pour les isomères du rétinal tout-trans, 9-cis et 13-cis. La RALDH4 catalyse les isomères 9-cis et 13-cis de rétinal, elle présente un faible KM (3μM) pour les deux isomères et a une efficacité catalytique élevée pour le 9-cis rétinal 3.4 fois supérieure au 13-cis rétinal. La RALDH3 est spécifique au tout-trans rétinal avec un KM de 4 μM et une efficacité élevée. β-Ionone, inhibiteur possible pour la RALDH4, inhibe l’activité avec le rétinal 9-cis et 13-cis, mais n’influence pas l’activité de la RALDH3. Le para-hydroxymercuribenzoïque (p-HMB) inhibe l’activité de deux isoenzymes. Le cation MgCl2 augmente par 3 fois l’oxydation du rétinal 13-cis par la RALDH4, diminue l’oxydation du 9-cis rétinal et influence faiblement la RALDH3. Ces données enrichissent les connaissances sur les caractéristiques cinétiques des RALDHs recombinantes de souris de types 3 et 4 et fournissent des éclaircissements sur la biogenèse de l’acide rétinoïque in vivo. / SUMMARY Retinal dehydrogenases (RALDHs) catalyze the dehydrogenation of retinal into retinoic acids (RA) that are required for embryogenesis and tissue differentiation. This study sought to determine the detailed kinetic properties of 2 mouse RALDHs, namely RALDH3 and 4, for retinal isomer substrates, to better define their specificities in RA isomer synthesis. RALDH3 and 4 were expressed as His-tagged proteins and affinity-purified. RALDH3 oxidized all-trans retinal with high catalytic efficiency but did not show activity for either 9-cis or 13-cis retinal substrates. RALDH4 was inactive for all-trans retinal substrate, exhibited high activity for 9-cis retinal oxidation, and oxidized 13-cis retinal with lower catalytic efficiency. β-ionone, a potent inhibitor of RALDH4 activity, suppressed 9-cis and 13-cis retinal oxidation competitively, but had no effect on RALDH3 activity. The p-HMB inhibited the activity for both RALDH3 and RALDH4. The divalent cation MgCl2 activated 13-cis retinal oxidation by RALDH4 by 3-fold, slightly decreased 9-cis retinal oxidation, and did not significantly influence RALDH3 activity. These data extend the kinetic characterization of RALDH3 and 4, providing their specificities for retinal isomer substrates, which should help in determining their functions in the synthesis of RAs in specific tissues.