京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第24792号 / 医博第4984号 / 新制||医||1066(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 椛島 健治, 教授 辻川 明孝, 教授 山中 伸弥 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医科学) / 甲第24531号 / 医科博第145号 / 新制||医科||10(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医科学専攻 / (主査)教授 斎藤 通紀, 教授 松田 秀一, 教授 遊佐 宏介 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第25495号 / 医博第5095号 / 新制||医||1073(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 溝脇 尚志, 教授 伊達 洋至, 教授 黒田 知宏 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

As células-tronco de pluripotência induzida (iPSC) representam uma fonte de maior disponibilidade para obtenção de células estromais mesenquimais (MSC). Além disso, as células mesenquimais derivadas de iPSC, as MSC-like, demonstram in vitro uma atividade parácrina e uma taxa de proliferação que as apontam como uma candidata em potencial à terapia celular. Em paralelo, a terapia celular dispõe das propriedades terapêuticas das células estromais mesenquimais do cordão umbilical (UC-MSC), uma população celular de fácil isolamento, rendimento notável, alta capacidade de proliferação e ausência de tumorigenecidade. Assim, perante a relevância das iPSC como fonte alternativa para obtenção de MSC e do desempenho in vitro demonstrado pelas MSC-like, tornou-se necessário a comparação destas com as UC-MSC. Para tanto, iPSC reprogramadas a partir de células mononucleares do sangue periférico (iPS-PBMC) foram diferenciadas em MSC-like e estas por sua vez foram caracterizadas, segundo à aderência ao plástico, expressão de genes e proteínas de pluripotência, expressão de antígenos de superfície CD73, CD90, CD105, CD14, CD19, CD34, CD45 e HLA-DR; capacidade de diferenciação in vitro em adipócitos e osteócitos e posteriormente comparadas as UC-MSC frente a capacidade de proliferação e imunomodulação. As MSC-like obtidas mostraram-se aderentes ao plástico, não pluripotentes e com morfologia fibroblastoide. Demonstraram um perfil imunofenotípico negativo (menos de 2% de células positivas) para marcadores hematopoéticos e HLA-DR, mais de 90% para CD73 e CD90 e menos de 80% para CD105. Ademais, exibiram capacidade de diferenciação osteogênica e adipogênica. Quando comparadas às UC-MSC, em relação à capacidade de proliferação, as MSC-like apresentaram uma taxa de proliferação duas vezes menor. A comparação da capacidade imunomodulatória entre as duas linhagens demonstrou que as UC-MSC foram capazes de conter a proliferação de linfócitos T CD8+ mas não de linfócitos T CD4+. As MSC-like não foram capazes de conter a proliferação de ambas as populações de linfócitos. Os resultados indicam que o protocolo de indução utilizado foi capaz de gerar MSC-like com antígenos de superfície clássico em mesenquimais, baixa expressão de marcadores de pluripotência, hematopoéticos e HLA-DR e com habilidade de se diferenciar em linhagens mesodérmicas, porém, com menor capacidade de proliferação e ausência de propriedades imunomodulatórias. A funcionalidade das MSC-like geradas neste trabalho pode ser proveniente de fatores genéticos e epigenéticos do doador e pelas metodologias de reprogramação da célula somática à iPSC, bem como pela indução da iPSC à MSC. A investigação futura destes fatores pode contribuir para a obtenção de MSC-like funcionalmente semelhante às UC-MSC. / Induced pluripotent stem cells (iPSC) are an easily available mesenchymal stromal cell (MSC) source. Moreover, iPSC-derived mesenchymal cells (MSC-like) demonstrated an in vitro proliferation rate and paracrine activity that make them a potential candidate for cell therapy. Currently the cell therapy uses the therapeutic properties of umbilical cord-derived mesenchymal cells (UC-MSC), an effortlessly isolated cell population with remarkable yield, high proliferation capacity, and absence of tumorigenecity. Thus, considering the iPSC relevance as an alternative MSC source and their in vitro performance, it has become necessary to compare them with UC-MSC. The iPSC reprogrammed from peripheral blood mononuclear cells (iPS-PBMC) were differentiated in MSC-like and these cells were characterized according their adherence to plastic; pluripotency genes and proteins expression; surface antigens expression such CD73, CD90, CD105, CD14, CD19, CD34, CD45, and HLA-DR; in vitro differentiation capacity into adipocytes and osteocytes; and were compared with the UC-MSC proliferation and immunomodulation capacity. The obtained MSC-like were adherent to plastic, not pluripotent, and with fibroblastoid morphology. They demonstrated an immunophenotypic profile with less than 2% hematopoietic and HLA-DR positive cell markers, over 90% of CD73 and CD90, and less than 80% were CD105 positives. They also exhibited osteogenic and adipogenic differentiation capacity. When proliferation rate was compared between the two cell lineages, MSC-like showed a proliferation rate twice smaller than UC-MSC. The UC-MSC immunomodulatory activity contained the proliferation of T CD8+ lymphocytes but did not of T CD4+. MSC-like did not show immunomodulatory activity in the proliferation of CD4+ and CD8+. These results allow the assumption that the applied induction protocol was able to generate MSC-like with the classic mesenchymal surface markers, low pluripotency, hematopoietic, and HLA-DR surface markers expression and with mesodermal lineage differentiation potential, however, with lower proliferation rate and absence of immunomodulatory properties. The MSC-like functionality could be influenced by donor genetic and epigenetic factors as well as by as well as the methodologies of reprogramming of somatic cells to the iPSC and the induction of iPSC to the mesenchymal phenotype. These influential factors should be investigated in deep detail in order to make the generated MSC-like functionally similar to UC-MSC.

Transtorno do espectro autista (TEA) é um quadro complexo do neurodesenvolvimento associado com elevado prejuízo funcional, onde os pacientes apresentam alterações comportamentais, déficit de comunicação e problemas de sociabilização. A incidência do TEA é muito elevada e vem crescendo constantemente nos últimos anos. Atualmente a prevalência é de 1 em cada 50 crianças nos EUA, sendo os meninos mais afetados que as meninas (4:1). O diagnóstico dos pacientes com TEA é feito clinicamente e ocorre geralmente com a idade de aproximadamente três anos, idade que os sintomas ficam mais evidentes. As causas biológicas e genéticas do autismo vem sendo estudadas em modelos animais e em material biológico humano, como sangue (genéticas) e cérebro post-mortem. Apesar de valiosos, esses modelos não permitem estudos das células neurais humanas em funcionamento. A geração de células neurais funcionais a partir das células previamente reprogramadas mudou esse cenário e abriu portas para gerar modelos celulares e estudar as doenças in vitro. Esse trabalho teve como objetivo modelar o TEA in vitro, a partir de neurônios e astrócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas obtidas a partir das células-tronco de dente decíduo esfoliado (SHED) de pacientes com transtorno autista. Em nossos resultados observamos que neurônios autistas apresentam uma significativa diminuição na expressão de genes sinápticos quando comparados com neurônios não-autistas (controle). Além disso, ensaios funcionais de eletrofisiologia revelaram que neurônios autistas têm um número menor de picos de estimulação (spikes) por segundo, indicando neurônios possivelmente menos ativos. Em tempo, experimentos de co-cultura de neurônios e astrócitos revelaram que astrócitos autistas podem interferir na maturação e complexidade morfológica dos neurônios controle, e o inverso também foi observado, onde astrócitos de controles podem resgatar o fenótipo de neurônios autistas, sendo que um aumento significativo no nível de marcadores sinápticos, mudanças na morfologia com neurônios de pacientes mais maduros e complexos foi observado quando cultivados sobre astrócitos controles. Nossos dados indicam que os astrócitos influenciam na maturação, na complexidade e funcionalidade dos neurônios, mostrados aqui pela primeira vez para o autismo idiopático. Além disso, com este trabalho podemos afirmar que é possível modelar o autismo idiopático in vitro e estudar formas de resgate fenotípico das células afetadas na patologia visando futuras terapias para esses pacientes. A tecnologia das células reprogramadas e modelagem de doenças abre portas para novas descobertas no campo do autismo / Autism spectrum disorder (ASD) is a group of neurodevelopmental disorders characterized by qualitative impairment communication, social interaction and restricted and repetitive patterns of behavior. The prevalence of 1 in every 50 children in The United States has been reported with a tendency to increase in recent years. Patient ASD diagnosis typically occurs by the age of 3 years and affects more boys than girls (4:1). The biological and genetic causes of autism has been studied in animal models, in human biological material such as blood and in post-mortem brain tissues. Although valuable, these models do not allow study of living human neural cells. The generation of functional neural cells from reprogrammed cells previously changed this scenario and opened doors to generate cellular models in vitro and to study diseases as autism. This study aimed to model ASD in vitro to study neurons and astrocytes derived from induced pluripotent stem cells from mesenchymal stem cells from dental pulp (SHED) from patients with idiopathic autism. In our results we found that neurons derived from patients with ASD show a significant decrease in synaptic genes compared with controls. Functional electrophysiology tests were performed and we were able to observe a smaller number of spike per second in neurons derived from patients, indicating that neurons from ASD patients has less activity than control neurons. In our co-culture assay between neurons and astrocytes we observed that astrocytes derived from patients may interfere in the maturation and morphological complexity of neurons derived from controls. On the other hand, when we grow ASD neurons on astrocytes from controls we can observe a significant increase in the level of synaptic markers, changes in morphology where we observe more mature and complex neurons. These data indicate that astrocytes influence in the maturity, complexity and functionality of neurons, data never shown before for ASD patients. With these results we can say that it is possible to model idiopathic autism in vitro. The iPSC technology and disease modeling opens doors to new discoveries and therapies for ASD patients

As células-tronco de pluripotência induzida (iPSC) são células geradas a partir da reprogramação de células somáticas e têm potencial para diferenciação em todos os tipos celulares do organismo adulto. A indução da diferenciação de iPSC pacienteespecífico em células hematopoéticas é uma forma de estudo da hematopoese em modelos de doenças, como a anemia falciforme, e também essencial para o desenvolvimento de terapias. O presente estudo propôs a geração de célulastronco/progenitoras hematopoéticas e progenitores eritroides in vitro a partir de iPSC derivadas de pacientes com anemia falciforme através da formação de corpos embrioides. Ao longo da diferenciação, os desenvolvimentos hematopoético e eritroide foram monitorados através de ensaios de formação de colônia e imunofenotipagem por citometria de fluxo. Neste estudo, demonstramos a presença de células com fenótipo de células endoteliais no início da diferenciação hematopoética por formação de corpos embrioides, possivelmente indicando que as células progenitoras hematopoéticas são provenientes de um endotélio hemogênico. Também verificamos a presença de células endoteliais sem potencial de endotélio hemogênico. Geramos células com características de células-tronco/progenitoras hematopoéticas, de fenótipos CD34+CD45+ e CD45+CD43+, progenitores eritroides (CD36+, CD71+ e CD235a+), bem como a formação de colônias hematopoéticas em cultura em meio semi-sólido. A linhagem de iPSC PBscd08 demonstrou maior potencial para diferenciação em células hematopoéticas e eritroide que as demais linhagens celulares avaliadas. A linhagem PBscd01, também gerada a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de paciente com anemia falciforme, não demonstrou o mesmo potencial para a diferenciação hematopoética, gerando apenas células CD34+ e baixa porcentagem de células CD45+ e CD43+. A linhagem de iPSC PB12, gerada a partir de PBMC de indivíduo saudável, promoveu a geração de populações de células CD34+, CD45+ e CD43+, mas não duplo-positivas, e a geração de células com morfologia de células mieloides após a maturação. As linhagens celulares de iPSC demonstraram variabilidade quanto ao potencial de diferenciação hematopoética. Isto monstra a necessidade de estudos futuros para uma investigação mais detalhada. / Induced pluripotent stem cells (iPSC) are cells generated by reprogramming somatic cells, they have the potential for differentiation into all types of cells in the adult organism. The differentiation of patient-specific iPSC into hematopoietic cells is a way of studying hematopoiesis in disease models, such as sickle cell anemia, and is also essential for the development of therapies. The present study proposed the generation of hematopoietic stem/progenitor cells and erythroid progenitors from iPSC derived from patients with sickle cell anemia. Throughout the differentiation, hematopoietic and erythroid developments were monitored by colony forming cell assay and immunophenotypic analysis. In this study, we demonstrated the presence of cells with endothelial phenotype at the beginning of hematopoietic differentiation by formation of embryoid bodies, possibly showing that hematopoietic progenitor cells originate from a hemogenic endothelium. We generated cells with characteristics of hematopoietic stem/progenitor cells, of CD34+CD45+ and CD45+CD43+ phenotypes, erythroid progenitors (CD36+, CD71+ and CD235a+), as well as the formation of hematopoietic colonies in culture in semi-solid medium. The iPSC line PBscd08 demonstrated greater potential for differentiation into hematopoietic and erythroid cells than the other cell lines evaluated. The iPSC line PBscd01, also generated from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from patients with sickle cell anemia, did not demonstrate the same potential for hematopoietic differentiation, generating only CD34+ cells and a low percentage of CD45+ and CD43+ cells. The iPSC line PB12, generated from healthy individual PBMC, promoted the generation of CD34+, CD45+ and CD43+ cell populations, but not double-positives, and the generation of cells with myeloid cell morphology after maturation. The iPSC cell lines demonstrated variability in the potential for hematopoietic differentiation. This shows the need for future studies for a more detailed investigation.

As células-tronco de pluripotência induzida (iPSC) são células geradas a partir da reprogramação de células somáticas e têm potencial para diferenciação em todos os tipos celulares do organismo adulto. A indução da diferenciação de iPSC pacienteespecífico em células hematopoéticas é uma forma de estudo da hematopoese em modelos de doenças, como a anemia falciforme, e também essencial para o desenvolvimento de terapias. O presente estudo propôs a geração de célulastronco/progenitoras hematopoéticas e progenitores eritroides in vitro a partir de iPSC derivadas de pacientes com anemia falciforme através da formação de corpos embrioides. Ao longo da diferenciação, os desenvolvimentos hematopoético e eritroide foram monitorados através de ensaios de formação de colônia e imunofenotipagem por citometria de fluxo. Neste estudo, demonstramos a presença de células com fenótipo de células endoteliais no início da diferenciação hematopoética por formação de corpos embrioides, possivelmente indicando que as células progenitoras hematopoéticas são provenientes de um endotélio hemogênico. Também verificamos a presença de células endoteliais sem potencial de endotélio hemogênico. Geramos células com características de células-tronco/progenitoras hematopoéticas, de fenótipos CD34+CD45+ e CD45+CD43+, progenitores eritroides (CD36+, CD71+ e CD235a+), bem como a formação de colônias hematopoéticas em cultura em meio semi-sólido. A linhagem de iPSC PBscd08 demonstrou maior potencial para diferenciação em células hematopoéticas e eritroide que as demais linhagens celulares avaliadas. A linhagem PBscd01, também gerada a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de paciente com anemia falciforme, não demonstrou o mesmo potencial para a diferenciação hematopoética, gerando apenas células CD34+ e baixa porcentagem de células CD45+ e CD43+. A linhagem de iPSC PB12, gerada a partir de PBMC de indivíduo saudável, promoveu a geração de populações de células CD34+, CD45+ e CD43+, mas não duplo-positivas, e a geração de células com morfologia de células mieloides após a maturação. As linhagens celulares de iPSC demonstraram variabilidade quanto ao potencial de diferenciação hematopoética. Isto monstra a necessidade de estudos futuros para uma investigação mais detalhada. / Induced pluripotent stem cells (iPSC) are cells generated by reprogramming somatic cells, they have the potential for differentiation into all types of cells in the adult organism. The differentiation of patient-specific iPSC into hematopoietic cells is a way of studying hematopoiesis in disease models, such as sickle cell anemia, and is also essential for the development of therapies. The present study proposed the generation of hematopoietic stem/progenitor cells and erythroid progenitors from iPSC derived from patients with sickle cell anemia. Throughout the differentiation, hematopoietic and erythroid developments were monitored by colony forming cell assay and immunophenotypic analysis. In this study, we demonstrated the presence of cells with endothelial phenotype at the beginning of hematopoietic differentiation by formation of embryoid bodies, possibly showing that hematopoietic progenitor cells originate from a hemogenic endothelium. We generated cells with characteristics of hematopoietic stem/progenitor cells, of CD34+CD45+ and CD45+CD43+ phenotypes, erythroid progenitors (CD36+, CD71+ and CD235a+), as well as the formation of hematopoietic colonies in culture in semi-solid medium. The iPSC line PBscd08 demonstrated greater potential for differentiation into hematopoietic and erythroid cells than the other cell lines evaluated. The iPSC line PBscd01, also generated from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from patients with sickle cell anemia, did not demonstrate the same potential for hematopoietic differentiation, generating only CD34+ cells and a low percentage of CD45+ and CD43+ cells. The iPSC line PB12, generated from healthy individual PBMC, promoted the generation of CD34+, CD45+ and CD43+ cell populations, but not double-positives, and the generation of cells with myeloid cell morphology after maturation. The iPSC cell lines demonstrated variability in the potential for hematopoietic differentiation. This shows the need for future studies for a more detailed investigation.

As doenças do neurônio motor (DNM) apresentam grande variabilidade clínica e genética. A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é a forma mais comum de DNM de início tardio. Sua manifestação devastadora e incurável leva a uma profunda perda da qualidade de vida do paciente. A ELA8 é uma forma autossômica dominante de ELA familial causada por mutações no gene VAPB. A proteína VAPB está envolvida com diversos processos celulares. Nossos dados sugerem que a mutação P56S na VAPB diminui a interação dela com outras duas outras proteínas: Tubulina e GAPDH. Por terem sido previamente relacionadas a outras formas de doenças neurodegenerativas, essas proteínas são potenciais pontos-chave para desvendar a patogênese da ELA8 e de outras formas de DNM. Um número significativo de drogas testadas com sucesso em modelos animais de ELA não pôde ser transferido para os pacientes, trazendo à tona a necessidade de novos sistemas de estudo da doença. A tecnologia das iPSC torna possível a reprogramação celular para um estágio de pluripotência, permitindo a modelagem de doenças in vitro. Apresentamos um novo modelo de ELA baseado em células iPSC derivadas de pacientes com ELA8. Este modelo apresenta uma redução dos níveis de VAPB quando comparado com os controles. Contudo, não identificamos os agregados intracitoplasmáticos, característicos dos modelos de super-expressão. Mostramos pela primeira vez que células-tronco embrionárias humanas normais expressam VAPB. Adicionalmente, nossos resultados sugerem que os pacientes com ELA8 teriam uma redução dos níveis de VAPB desde o início de suas vidas e revelam a importância de modelar a ELA num background humano. Dessa forma, sugerimos a hipótese de que quantidades específicas de VAPB sejam cruciais para a viabilidade dos neurônios motores. A busca por alterações no número de cópias levou à identificação do primeiro caso de uma duplicação multi-exônica (exon10_12dup) no gene SPG4, ampliando o espectro de mutações encontradas nesse gene. Esta mutação leva à formação de um códon de parada prematuro, sugerindo que a proteína produzida não é funcional. A análise de 30 indivíduos portadores desta mutação mostrou que os homens possuem, na média, idade de início antecipada e quadro clínico mais severo. Esses dados sugerem que certas doenças neuromusculares podem ser moduladas por fatores relacionados ao background individual e ao gênero. Em suma, apoiamos a idéia de que os microtúbulos estariam envolvidos na patogênese das doenças neuromusculares, visto que tanto a VAPB quanto a Espastina interagem com estes elementos do citoesqueleto. Ainda, apresentamos um novo modelo in vitro de análise da ELA e além de justificar os estudos num background humano. / The motor neuron diseases (MND) show a huge clinical and genetic variability. Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is the most common late-onset form of MND. ALSs devastating and incurable manifestation leads to a profound loss of life quality. ALS8 is an autosomal dominant form of ALS caused by mutations in the VAPB gene. The VAPB protein is involved with many cellular processes and our data suggest that P56S mutation in this protein reduces its interaction with two other proteins: Tubulin and GAPDH. Since these proteins were previously related to other types of neurodegenerative diseases they potentially are key points to reveal the processes responsible for ALS8 and other MND. A substantial number of successful drug tests in ALS animal models could not be translated to humans, showing the need of novel ALS systems. iPSC technology made possible cellular reprogramming. The iPSC technology brings new hope in this area since it can be used to model diseases in vitro. Here we present a new ALS model based on ALS8-iPSC. Compared to control samples, this model shows a reduction of VAPB levels. However, we could not identify intracytoplasmic aggregates, which characterize overexpression models. We show for the first time that human embryonic stem cells express VAPB. Combined with results showing a VAPB reduction in ALS8 samples, it suggests that ALS8 patients present diminished protein levels since the beginning of their lives and reveal the importance of modeling ALS in a human background. The search for copy number variations has led to the identification of the first multiexonic duplication (exon10_12dup) in SPG4 gene, expanding the mutation spectrum in this gene. This mutation leads to a premature stop codon, which suggests that the expressed protein is not functional. The analysis of 30 individuals who carry the mutation showed that males have on average an earlier AAO and are more severely affected. These data suggest specific neuromuscular diseases can be modulated by factors related to individual background and gender. In sum, we support the idea that microtubules can be involved with neuromuscular disorders pathogenesis, since both VAPB and Spastin interact with these cytoskeleton components. Additionally, we present a new in vitro model to ALS analysis and we justify the studies in a human background.