RESUME Le proto-oncogène c-myc code pour un facteur de transcription qui est impliqué dans de multiples processus cellulaires tels que la prolifération, la différenciation et l’apoptose. Une dérégulation de son expression suite à des altérations génétiques (mutation, translocation, amplification) est retrouvée dans plusieurs tumeurs telles que le lymphome de Burkitt, des plasmacytomes murins ainsi que des tumeurs non-lymphoïdes. c-myc est un gène dont l’expression est régulée à différents niveaux. Chez l’homme, le gène c-myc est transcrit à partir de quatre promoteurs alternatifs appelés respectivement P0, P1, P2 et P3. P1 et P2 sont les deux promoteurs les plus utilisés. Ensemble, ils permettent de former 90% des transcrits c-myc dans des cellules normales. Les promoteurs P0, P1 et P2 permettent la transcription de trois ARNms qui comportent deux codons d’initiation de la traduction (un CUG et un AUG). L’utilisation alternative de ces deux codons d’initiation est à l’origine de la synthèse de deux protéines (c-Myc 1 et c-Myc 2) ayant à la fois des fonctions identiques et distinctes. La grande taille des parties 5’ non-traduites ainsi que la présence dans celles-ci de phases ouvertes de lecture sont des éléments défavorables à la traduction de l’ORF codant pour les protéines Myc par un mécanisme classique d’initiation de la traduction. Notre laboratoire avait précisément montré que les protéines c-Myc sont synthétisées par un processus d’initiation interne de la traduction. Les ARNms dont l’initiation de la traduction s’effectue par entrée interne des ribosomes présentent une structure spécifique appelée IRES (Internal Ribosome Entry Site). Cette structure permet la fixation du ribosome directement à proximité du codon d’initiation. Dans le cas des ARNms c-myc, on retrouve une IRES se situant en amont des codons CUG et AUG qui permet la synthèse des protéines c-Myc1 et 2 respectivement. Un tel mécanisme permet la synthèse des protéines c-Myc dans des conditions où toute traduction dépendante de la coiffe est inhibée (mitose, apoptose). Au cours de mon travail, tout d’abord j’ai montré qu’une séquence de 40 nt dans les transcrits P2 permet à elle seule une initiation interne efficace de la traduction. Nous avons déterminé aussi que cette séquence, appelée B4, est active dans quatre types cellulaires différents avec une efficacité variable et qu’elle active la traduction indépendamment de l’ORF placée en aval. D’autre part, il a été déterminé que la séquence B4 recrute le complexe de préinitiation 43S, qui ensuite scanne le messager jusqu’aux codons initiateurs comme c’est le cas de l’IRES du rhinovirus. Une analyse plus détaillée de la séquence B4 a permis d’identifier trois plus petites séquences de plus ou moins 14 nt (Ti1, Boucle, Ti2), qui indépendamment l’une de l’autre permettent une entrée interne des ribosomes. Il a été déterminé que la présence du motif A-N6-AC dans la séquence de Ti2 était importante pour l’activité IRES de celle-ci. Cependant, ce même motif également présent dans la séquence Ti1 n’est pas essentiel à l’activité IRES de Ti1. Par la suite, nous avons démontré que l’IRES de c-myc nécessite pour son activité un évènement nucléaire. Nous avons donc entrepris la recherche de facteurs cellulaires impliqués dans l’activité de l’IRES de c-myc. Dans un premier temps, nous avons exclu le rôle de certaines protéines connues pour activer d’autres IRES dont le mécanisme de recrutement du complexe de préinitiation est similaire. Ainsi, nous avons montré, par des expériences de complémentation d’un RRL, que les protéines PTB et unr connues pour activer l’IRES du rhinovirus ne contribuent pas à l’activité de l’IRES de c-myc. De plus, la complémentation de RRL avec des extraits S10 ou nucléaires de cellules HeLa n’a pas permis d’identifier des protéines impliquées dans l’activité IRES de c-myc. D’autre part, des méthodes alternatives d’interaction d’ARN et de protéine comme le triple hybride ou la chromatographie d’affinité d’ARN n’a pas permis dans un premier temps de détecter une interaction entre un facteur non canonique et l’IRES de c-myc. Dès lors, l’existence de facteurs cellulaires impliqués dans l’activité de l’IRES de c-myc reste à déterminer.

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Mosquito-borne diseases continue to be a burden to global health. The viruses that cause these diseases are maintained in nature through a biological transmission cycle involving susceptible vertebrate and mosquito hosts. While knowledge of the interactions occurring between mosquito-borne viruses and vertebrates is considerable, much less is known about the interactions of these viruses with their disease vectors. Studies with Drosophila melanogaster have been important in understanding how insects respond to viral infections. However, mosquitoes and the viruses they vector have co-evolved during a long period of time. Unfortunately, many of the genetic advantages of a fly model are not available when working with mosquitoes. Nevertheless, a sequenced genome, and molecular tools such as high-throughput sequencing and RNAi knockdown are helping to bridge these gaps. Here we describe several additional tools for the study of virus-vector interactions in the mosquito. / Ph. D.

RACK1 (Receptor for activated protein C kinase 1) est une protéine ribosomale associée à de nombreuses voies de signalisation. RACK1 est nécessaire à la traduction sélective de virus contenant des sites d’entrée interne du ribosome (IRES). En outre, l’expression de RACK1 est nécessaire au cours du développement, suggérant que ce facteur participe à la traduction de certains ARNm cellulaires. Dans le but de mieux comprendre la fonction de RACK1 chez la drosophile, j’ai au cours de ma thèse caractérisé l’interactome de RACK1 et un IRES viral régulé par ce facteur. J’ai également essayé d’établir un lien entre signalisation cellulaire et traduction, et montré que la région du knob est importante pour la fonction de RACK1 au ribosome. Enfin, j’ai établi que RACK1 est nécessaire à la réponse à des stress abiotiques, et identifié les gènes cellulaires régulés par RACK1 dans ce contexte. J’ai en particulier découvert que RACK1 était un régulateur négatif de l’expression de plusieurs gènes de l’immunité innée. Mes résultats suggèrent que RACK1 joue un rôle pivot au sein du ribosome, régulant la traduction de façon positive ou négative selon l’ARNm et le contexte cellulaire. / RACK1 (Receptor for activated protein C kinase 1) is a ribosomal protein associated to many signaling pathways. RACK1 is required for the selective translation of viruses containing internal ribosome entry sites (IRES). In addition, expression of RACK1 is necessary during development, suggesting that it regulates the translation of cellular mRNAs. In order to better understand the function of RACK1 in Drosophila, I have participated in the characterization of the RACK1 interactome and of a RACK1-dependent viral IRES. I have also attempted to establish a connection between the function of RACK1 in signaling and in translation, and I have shown that the knob domain of RACK1 is important for IRES-dependent translation. Finally, I have established that RACK1 is required for the response to abiotic stresses, and I have identified cellular genes regulated by RACK1 in this context. In particular, I discovered that RACK1 is a negative regulator of several innate immunity genes. My results suggest that RACK1 plays a pivotal role within the ribosome, regulating translation positively or negatively in an mRNA- and possibly context-specific manner.

H λοίμωξη που προκαλείται απο τον ιό της ηπατίτιδας C HCV είναι μείζον πρόβλημα για την δημόσια υγεία όπως επίσης και η κύρια αιτία της χρόνιας ηπατικής νόσου και ηπατοκυτταρικού καρκινώματος, με περίπου 180 εκατομμύρια μολυσμένα άτομα σε όλο τον κόσμο. Ο HCV είναι ένας RNA ιός θετικής πολικότητας που ανήκει στο γένος Hepacivirus της οικογένειας των Flaviviridae. Έξι γονότυποι ( 1-6 ) είναι γνωστοί, καθένας από τους οποίους μπορεί να υποδιαιρεθεί περαιτέρω σε αρκετές υποτύπους. Το γονιδίωμα του HCV αποτελείται από ένα μεγάλο ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF), πλαισιωμένο από ιδιαίτερα δομημένες 5 'και 3' αμετάφραστες περιοχές (UTRs). Και οι δύο περιοχές UTRs είναι συντηρημένες και έχουν τον έλεγχο της ιογενούς μετάφρασης και αναπαραγωγής. Το 5' UTR του HCV περιέχει μια περιοχή IRES απο την οποία γινεται η έναρξη της cap ανεξάρτητης μετάφρασης του ιικού RNA. Η HCV IRES εξαρτώμενη μετάφραση του ORF παράγει μια ενιαία πρόδρομη πολυπρωτεΐνη που μεσω μετα-μεταφραστικής τροποποίησης από κυτταρικές και ιικές πρωτεάσες, οδηγεί στην ωρίμανση δομικών και μη δομικών πρωτεϊνών. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι διαφορετικές κυτταρικές ή ιικές πρωτεΐνες μπορούν να ρυθμίσουν την ενεργότητα του HCV IRES. Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η κατανόηση της ρύθμισης της HCV IRES εξαρτώμενης μετάφρασης. Πρώτον, προσπαθήσαμε να ορίσουμε το ρόλο των ιικών πρωτεϊνών στην HCV IRES εξαρτώμενη μετάφραση που παραμένει αμφιλεγόμενος. Σαφώς, οι μελέτες μας έδειξαν ότι η HCV NS5A ρυθμίζει αρνητικά την ενεργότητα του IRES με κύτταρο-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπρόσθετα, υπάρχουν ισχυρές ενδείξεις ότι η ενεργοποιημένη PKR ρυθμίζει θετικά την ενεργότητα του IRES ενώ η καταστολή της έκφρασης της ενδογενούς PKR έχει το αντίθετο αποτέλεσμα. Επιπλέον, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η NS5A μεσολαβεί ανασταλτικά στην IRES-εξαρτώμενη μετάφραση και συνδέεται με την αδρανοποίηση της PKR. Τέλος στην παρούσα εργασία ερευνήσαμε τη ρύθμιση της ενεργότητας του HCV IRES σε συνθήκες χαμηλού οξυγόνου, δεδομένου ότι υποξικές περιοχές εντοπίζονται στον ηπατοκυτταρικό καρκίνο (HCC) και συνδέονται με την ύπαρξη ενός εναλλακτικού προφίλ κυτταρικής μετάφρασης Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η HCV IRES-εξαρτώμενη μετάφραση ρυθμίζεται αρνητικά σε υποξικές συνθήκες και μάλιστα με κύτταρο-εξαρτώμενο τρόπο. / HCV infection is a major public health problem and a leading cause of chronic liver disease and hepatocellular carcinoma, with approximately 180 million infected individuals worldwide. HCV is a positive sense RNA virus that belongs to the genus hepacivirus of the Flaviviridae family. Six major HCV genotypes (1–6) are known, each of which can be further subdivided into several subtypes (1a, 1b, 2a, etc). The HCV genome consists of a large open reading frame (ORF), flanked by highly structured 5’ and 3’ untranslated regions (UTRs). Both UTRs are conserved and control viral translation and replication. The HCV 5'-UTR contains an IRES that initiates cap-independent translation of the viral RNA. IRES-mediated translation of the HCV ORF yields a single polyprotein precursor that is co- and post-translationally processed by cellular and viral proteases, giving rise to mature structural and non structural proteins. Several studies have suggested that different cellular non canonical proteins or viral proteins can regulate the HCV IRES activity. The aim of this study was to understand the regulation of the HCV IRES dependent translation. Firstly, we tried to delineate the role of the viral proteins on HCV IRES dependent translation that still remains controversial. Clearly our studies demonstrated that HCV NS5A down-regulates IRES activity in a cell-type dependent manner. Additionally, we provide strong evidence that activated PKR up-regulates the IRES activity while silencing of endogenous PKR had the opposite effect. In addition, we concluded that the NS5A-mediated inhibitory effect on IRES-dependent translation was linked with the PKR inactivation. Moreover, as it is already reported that localised hypoxic areas are continuously present in HCC due to its high proliferation rate leading to an altered translation pattern, we investigated modulation of HCV IRES activity under low oxygen settings. Our results provided preliminary evidence that HCV-IRES-dependent translation is negatively regulated by low oxygen levels or under hypoxia-mimicking conditions in cell-specific manner.

La protéine de nucléocapside (NC) du virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1) joue de nombreux rôles dans les phases précoce et tardive de l’infection. La NC est une protéine à deux doigts de zinc, chaperonne des acides nucléiques. Nous avons cherché de nouveaux partenaires cellulaires de la NCp7 et identifié une protéine de liaison aux ARNs, Upstream of N-ras (Unr), dont l’interaction avec Gag et NCp7 a été confirmée. L’interaction entre Gag et Unr est dépendante de l’ARN et médiée par le domaine NC. Unr est une ITAF (IRES transacting factor) régulant la traduction médiée par plusieurs IRESs cellulaires et viraux. L’ARN génomique du VIH-1 possède deux IRESs dont un localisé dans la région non traduite en 5’ qui permet aux ARNm viraux de conserver un fort niveau de traduction lorsque la traduction coiffe-dépendante de la cellule est affaiblie par l’arrêt du cycle viral induit par l’infection. En utilisant un système de dual luciférase, nous avons montré qu’Unr est une ITAF dont la surexpression stimule l’IRES VIH-1. Des mutations ponctuelles de cet IRES, dans un motif consensus de liaison à Unr, altèrent à la fois l’activité de l’IRES et sa réponse à Unr suggérant que l’activité IRES dépend fortement de Unr. L’effet d’Unr sur l’IRES est inhibé par la surexpression de NCp7 mais pas par celle de Gag dont l’effet stimulateur sur l’IRES est additif de celui d’Unr suggérant un rôle d’Unr différent dans les phases précoce et tardive de l’infection. Pour finir, le knockdown de l’expression d’Unr entraîne une diminution significative de l’infection par un pseudovirus non réplicatif soulignant l’implication fonctionnelle d’Unr dans la phase précoce. / The Human Immunodeficiency Virus-1 (HIV-1) nucleocapsid protein (NC), as a mature protein (NCp7) or as a domain of the polyprotein Gag, plays several important roles in both the early and late phase of the infection. NC is a nucleic acid chaperone protein with two zinc fingers. We searched for new cellular protein partners of NCp7 and identified the RNA binding protein Unr, Upstream of N-ras, whose interaction with both Gag and NCp7 was confirmed. Unr interaction with Gag is RNA dependent and mediated by its NC domain. Unr is an ITAF (IRES trans-acting factor) regulating the translation driven by several IRESs. The HIV-1 genomic mRNA harbors two IRESs elements: one of them found within the HIV-1 5’-Untranslated region drives HIV-1 mRNA translation when the cap-dependent translation is diminished due to the infection-induced cell cycle arrest. Using a dual luciferase assay, Unr was shown to act as an ITAF, increasing the HIV-1 IRES dependent translation. Point mutations of the HIV-1 IRES in a consensus Unr binding motif were found to alter both the IRES activity and its activation by Unr suggesting a strong dependency of the IRES on Unr. Unr stimulation effect is furthermore counteracted by NCp7, but not by Gag overexpression, which increases the IRES activity in an additive manner to Unr suggesting a differential Unr effect on the early and late phases of the infection. Finally, knockdown of Unr in HeLa cells leads to a decline in infection by a non-replicative lentivector proving its functional implication in the early phase.

Il est maintenant clairement établi que la biogenèse des ribosomes est l’un des nombreux processus cellulaires qui voit sa régulation profondément modifiée au cours de la transformation cellulaire.Toutefois, si il est bien décrit que le taux synthèse des ribosomes est augmenté au cours du processus tumoral, de plus en plus de données suggèrent que les étapes posttranscriptionnelles peuvent aussi être altérées. Dans ce contexte biologique, les objectifs de cette thèse sont de déterminer si : i) la maturation de l’ARNr est altérée en plus de l’augmentation de sa synthèse ; ii) cette altération peut conduire à la synthèse de ribosomes modifiés dont la fonction est altérée ; iii) ces modifications participent directement à la dérégulation traductionnelle observée dans les cellules cancéreuses. Pour cela, nous avons étudié les principales étapes de la biogenèse des ribosomes ainsi que la composition des ribosomes et leurs capacités fonctionnelles dans différents modèles de progression et/ou d’agressivité tumorale. Les résultats obtenus montrent qu’en plus de l’augmentation du taux de synthèse des ribosomes, les étapes post-transcriptionnelles sont modifiées, en particuliers le niveau de méthylation de l’ARNr. Ces modifications sont associées à des défauts importants de traduction (saut de codon stop, incorporation erronée des acide-amines) et particulièrement à une augmentation de la traduction IRES-dépendante de facteur clefs de la tumorigénèse. Dans leur ensemble, ces résultats suggèrent que les modifications de la biogenèse des ribosomes pourraient être une étape clef de la cancérogenèse, en modifiant les capacités traductionnelles des ribosomes cytoplasmiques / Ribosome biogenesis is a fundamental and extremely complex cell process. In mammals, ribosome synthesis coordinates the assembly of 80 proteins and 4 rRNA to form the two ribosomal sub-units. The maturation of the ribosome is a multi-step post-transcriptional process essential to obtain functional ribosomes. It is now well demonstrated that ribosome biogenesis and its regulation is altered during transformation process. However, if the increase of ribosome synthesis in cancer cell is well documented, there are numerous recent data suggesting that post-transcriptional steps could also be altered. In this biological context, the objectives of my Ph.D were to determine if: i) the maturation of rRNA is altered during the increase of ribosome synthesis; ii) these alterations could modify the ribosomes and alter their function and iii) these modifications directly participate to the deregulation of translation observed in cancer cells. We have explored the major steps of ribosome biogenesis as well as the structure of the cytoplasmic ribosomes and their functional capacity in different cellular models of tumor progression and/or aggressively. The results obtained show that in addition of the increase of the level of ribosome synthesis, post-transcriptional modifications are altered, particularly the level of rRNA methylation. These modifications are associated with strong defect of translation (stop codon bypass, misincorporation of amino-acid) and an increase of the IRES-dependant translation of important factors playing a crucial role in tumorigenesis. These results suggest that modifications of ribosome biogenesis could be a key step of cancer cell transformation

Chez les eucaryotes, les ARNm cellulaires subissent une traduction dépendante de la coiffe qui nécessite des facteurs appelés eIFs pour produire des protéines, mais les ARNm Hox sont traduits dans un mécanisme non canonique en raison de deux régulateurs d'ARN dans l'élément 5'UTR appelé Internal Ribosome Entry Site (IRES) qui recrute le ribosome sans le besoin de coiffe, et un élément inhibiteur de traduction (TIE) qui empêche la translation dépendant de coiffe. L'objectif de ma thèse est de déchiffrer le mécanisme de deux éléments TIE a3 et a11 dans les ARNm Hox. Pour cela, nous avons utilisé le système de traduction sans cellules RRL. Notre modèle pour TIE a3 suggère qu'il inhibe la traduction en uORF qui se traduit par un ARNm Hox a3 UTR 5'UTR de pleine longueur et produit un peptide de 9 KDa avec l'implication de eIF2D, un facteur d'initiation non canonique indépendant du GTP. Pour TIE a11, il séquestre le ribosome 80S sur une combinaison de codons start-stop à 19 nucléotides en amont d'une structure de boucle de tige riche en GC qui bloque le 80S au codon stop. / In eukaryotes, cellular mRNAs undergo cap-dependent translation which requires factors called eIFs to produce proteins.However, Hox mRNAs are translated in a non-canonical mechanism due to two RNA regulons in the 5’UTR called Internal Ribosome Entry Site (IRES) element which recruits the ribosome without the need of a cap, and a Translation Inhibitory Element (TIE) which inhibits cap-dependent translation. The objective of my PhD is to decipher the mechanism of two TIE elements a3 and a11 in Hox mRNAs. For that, we used RRL cell-free translation system. Our model for TIE a3 suggests that it inhibits translation to a uORF which translates through full length 5’UTR Hox a3 mRNA and produces a peptide of 9 KDa with the involvement of eIF2D, a non-canonical GTP-independent initiation factor. For TIE a11, it sequesters 80S ribosome on a start-stop codon combination at 19 nucleotides upstream of a GC-rich stem loop structure which blocks the 80S at the stop codon.

La synthèse des protéines est un mécanisme central de la vie cellulaire dont la compré-hension est un enjeu pour la recherche biomédicale. Des phénomènes comme les erreurs programméesde la traduction eucaryote ou l’initiation par des structures IRES virales sont impliqués dans les processusde réplication de virus et de bactéries. Mieux appréhender ces processus est une étape essentiellepour aboutir au développement d’approches thérapeutiques innovantes. Les études en molécule uniquepermettent d’observer chaque système réactionnel individuellement et donnent accès à des évènementsasynchrones difficilement observables en mesure d’ensemble, tels la traduction de protéines.Ce manuscrit de thèse présente une approche d’étude de la traduction par un ribosome eucaryote(mammifère) en molécule unique. Nous observons les systèmes traductionnels grâce à des marqueursfluorescents liés à des oligonucléotides pouvant s’hybrider sur les séquences d’ARN messagers traduites.L’observation de ces marqueurs est faite par microscopie de fluorescence en réflexion totale (TIRFM),les ARNm étant accrochés à la surface de l’échantillon. En lisant l’ARNm, le ribosome détache lesmarqueurs, et leurs instants de départ nous permettent de remonter à la dynamique de traductionde ribosomes individuels. Cette méthode permet d’obtenir des données cinétiques statistiques surun grand nombre de systèmes traductionnels en parallèle pouvant alors être ajustées par des lois deprobabilité. Partant de ce principe, mes travaux de thèse ont eu pour objectif d’étendre nos expériencesà une nouvelle problématique biologique : l’étude des évènements non canoniques de la traductioneucaryote. Pour cela nous avons apporté les modifications et les optimisations nécessaires au dispositifet au protocole expérimental pour l’adapter à ces nouveaux enjeux.Nos mesures de la cinétique in vitro de l’élongation eucaryote ont mis à jour un délai dû à uneinitiation non-canonique. En effet, nous réalisons le recrutement du ribosome par l’ARNm grâce àune structure virale de type IRES. Dans nos conditions d’expérience, l’incorporation d’un acide aminéprend environ une seconde tandis que cette structure induit un retard à la traduction de plusieursdizaines de secondes. Nous avons réalisé une étude comparative de plusieurs de ces structures viraleset avons montré que le délai mesuré était une caractérisitique conservée dans le cadre de l’initiation noncanonique. Ce résultat ouvre des perspectives d’études cinétiques tant pour approfondir nos conclusionssur les IRES que pour aborder d’autres évènements non canoniques tel que le décalage de la phase delecture ou le franchissement du codon stop. / The synthesis of proteins is a central mechanism of cellular life whose understandingis an issue for biomedical research. Phenomena such as programmed errors of eukaryotic translation orinitiation by viral IRES structures are involved in virus and bacterial replication processes. A Betterunderstanding of these processes is an essential step towards the development of innovative therapeuticapproaches.Single molecule studies allow each reaction system to be observed individually and give accessto asynchronous events, such as protein translation, that are difficult to observe in overall measurements.This phD manuscript presents a single molecule approach to study translation by a eukaryotic(mammalian) ribosome.We observe the translational systems thanks to fluorescent primers linked to oligonucleotides thatare hybridized to the translated mRNA sequences. These markers are observed by Total InternalReflection Fuorescence Microscopy (TIRFM) ; with the mRNAs attached to the sample surface. Whilereading the mRNA, the ribosome detaches the primers, and their instants of departure give us access tothe translation dynamics of individual ribosomes. This method makes it possible to obtain statisticalkinetic data on a large number of parallel translational systems, which can then be fitted by probabilitylaws. On the basis of this principle, my phD work aimed at extending our experiments to a newbiological issue : the study of non-canonical events in eukaryotic translation. To this end, we havemade the modifications and optimizations necessary for the set-up and the experimental protocol toadapt them to these new challenges.Our measurements of the in vitro kinetics of eukaryotic elongation have revealed a delay due tonon-canonical initiation. Indeed, the ribosome are recruited on the mRNA thanks to a viral, IREStype structure. Under our experimental conditions, the incorporation of an amino acid takes aboutone second while this structure induces a translation delay of several tens of seconds. We carried outa comparative study of several of these viral structures and showed that the measured delay was acharacteristic preserved in the framework of the non-canonical initiation. This result opens up prospectsfor kinetic studies both to deepen our conclusions on IRES and to address other non-canonical eventssuch as programmed frameshifting or STOP codon readthrough.

Like the majority of host cell mRNAs, the mRNAs of influenza virus are capped and polyadenylated. The NS1 protein of influenza has been implicated as a translational activator for both influenza and reporter gene mRNAs. Data is presented showing that influenza A virus infection resulted in an increased ratio of cap-dependent to cap-independent translation. This ratio increase was largely due to an increase in cap-dependent translation. These experiments employed a bicistronic reporter construct measuring cap-dependent and cap-independent translation in a single sample. Expression of NS1 alone resulted in a small, but reproducible increase in the ratio of cap-dependent to cap-independent translation. Additionally, with use of an NS1 deleted mutant influenza A virus (delNS1) it is shown that infection without NS1 expression produced less of a translation ratio increase compared to wild-type virus infection. Furthermore, expression of NS1 rescued a more wild-type ratio increase in delNS1 infected Vero cells. These results implicate NS1 as playing a role in increasing the ratio of cap-dependent to cap-independent translation in influenza A virus infected cells. Additionally, eIF4E-binding protein-1 (4E-BP1), a member of the protein family that inhibits cap-dependent translation through their inhibition of the cap-binding protein, eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E), is shown to be inactivated throughout the majority of the influenza A virus infection process.