Zinc finger protein regulator of apoptosis and cell cycle arrest 1 (Zac1) est un facteur de transcription suppresseur de tumeurs capable, à travers des voies différentes et indépendantes, dinduire lapoptose ou larrêt du cycle cellulaire. Malgré ses implications potentielles dans le développement embryonnaire et certaines maladies telles que le cancer et le diabète néonatal, les mécanismes régulant son expression physiologique, ainsi que sa fonction biologique exacte restent méconnus. Les deux principaux objectifs de notre travail consistaient, dune part, à définir la nature des stimuli capables de moduler lexpression endogène de la protéine Zac1 et, dautre part, à étudier la fonction de Zac1. Nous avons tout dabord montré que la protéine Zac1 nétait pas exprimée dans les organes murins où lon détecte son ARN messager. Nous navons cependant pas pu mettre en évidence de mécanisme de dégradation de la protéine Zac1. Malgré ses similitudes de fonction avec le suppresseur de tumeurs p53, Zac1 nétait également pas exprimée après traitement avec des inducteurs de p53 tels que des inducteurs de dommages à lADN. Après avoir testé sans succès de nombreux stimuli pro-inflammatoires susceptibles dinduire lexpression de Zac1, nous avons finalement découvert que le variant de transcrit Zac1b était exprimé dans des fibroblastes embryonnaires murins (MEFs) traités à lacide polyriboinosinique polyribocytidylique poly(I:C), un double brin dARN synthétique. Cette régulation sest avérée être dépendante de la voie du Toll-Like Receptor 3 (TLR3) et de lInterferon Regulatory Factor 3 (IRF3), et indépendante des interférons (IFNs) de type I. Le TLR3 et IRF3 étant des activateurs centraux de limmunité antivirale, nous avons tenté de déterminer si Zac1 pourrait être impliqué dans la réponse antivirale. En rapport avec cette hypothèse, nous avons observé que Zac1b était exprimé dans des MEFs infectées avec le virus de lEncéphalomyocardite (EMCV). Nous avons également constaté que les MEFs déficientes pour Zac1 étaient moins sensibles à la mort cellulaire induite par lEMCV que les MEFs sauvages. Cependant, linactivation du gène Zac1 navait pas deffet sur la survie des souris infectées à lEMCV. En conclusion, ce travail décrit, pour la première fois, une régulation transcriptionnelle de Zac1b induite par des ARN double brin synthétiques et des virus à ARN, mais dont la signification fonctionnelle reste à découvrir. De plus, il montre que les stimuli capables dinduire p53 ninduisent pas lexpression de la protéine Zac1 suggérant que la protéine Zac1 est régulée différemment de p53.

Suite à une infection par des microorganismes tels que des virus, lorganisme hôte met rapidement en place une réponse immunitaire. Celle-ci a lieu en deux étapes. Tout dabord, la réponse immunitaire innée et ensuite, la réponse immunitaire adaptative. Lors de la réponse immunitaire innée, lactivation des Pathogen Recognition Receptors par les Pathogen-Associated Molecular Patterns conduit à lactivation de deux facteurs de transcription clés, NF-kappaB et IRF3 qui coopèrent afin dinduire lexpression de lIFN-beta. À son tour, lIFN-beta active une seconde voie de signalisation assurant lexpression des Interferon-Stimulated Genes encodant des protéines qui possèdent des fonctions antivirales leur permettant de limiter la propagation de linfection. Durant cette thèse de doctorat, nous nous sommes intéressés à la capacité du virus de la varicelle et du zona (VZV) à activer une telle réponse immunitaire innée. Nous avons observé que le VZV induit une phosphorylation atypique dIRF3 lempêchant dhomodimériser et conduisant dès lors à une inhibition de lexpression des gènes cibles tels que lIFN-beta et lISG15. Nous avons également démontré que la phosphorylation atypique dIRF3 induite par le VZV dépendait dune des deux kinases virales, celle encodée par lORF47 et non pas par lORF66. En effet, lutilisation de deux virus mutants incapables dexprimer soit lORF47p (VZV ROka47S) soit lORF66p (VZV ROka66S), nous ont permis de démontrer, que seulement en labsence dexpression de la kinase virale ORF47p, le VZV est incapable dinduire la phosphorylation atypique dIRF3 ce qui lui permet à nouveau dhomodimériser. Nous avons également montré que, contrairement à ce qui est observé dans des cellules infectées par le VZV sauvage, les quantités dARN messagers de lIFN-beta et de lISG15 sont considérablement accrues en labsence dexpression de lORF47p. De plus, nous avons montré, par expérience de co-immunoprécipitation dans des cellules exprimant de façon artificielle lORF47p taggé HA et lIRF3 taggé V5, que lORF47p interagit physiquement avec IRF3. Toutes ces données démontrent que le VZV a développé des mécanismes lui permettant déchapper au système immunitaire de lhôte en ciblant lactivation dIRF3. En effet, par le biais de sa kinase encodée par lORF47, le VZV est capable dinterférer avec lactivation dIRF3 et lexpression subséquente de lIFN-beta et de lISG15, deux protéines cellulaires importantes pour la mise en place de la réponse antivirale. Cependant, le mécanisme exact par lequel lORF47p induit la phosphorylation atypique dIRF3 en réponse à une infection par le VZV reste encore inconnu. Nous avons également consacré une partie de cette thèse à létude de lactivation du NF-kappaB par le VZV. Comme démontré précédemment par notre équipe (El Mjiyad et al., 2007), nous avons observé que le VZV interfère avec lactivation du NF-kappaB et que cette inhibition, contrairement à IRF3, ne dépend pas des kinases virales ORF47p et ORF66p.

Obesity is associated with a state of chronic inflammation, which is believed to contribute to insulin resistance. We previously identified interferon regulatory factor 3 (IRF3) as an anti-adipogenic transcription factor with high expression in adipocytes. Because IRF3 is known to drive expression of pro-inflammatory genes in immune cells, we hypothesized that it may also promote inflammation and insulin resistance in adipocytes. Consistent with our expectations, we found that the expression of inflammatory genes in adipocytes was induced by IRF3 overexpression, while knockdown of IRF3 had the opposite effect. Despite this effect on local adipocyte gene expression, we found that \(Irf3^{-/-}\) mice did not show evidence of altered systemic inflammation. Nonetheless, \(Irf3^{-/-}\) mice did display altered metabolism relative to their wild type (WT) littermates. For example, high fat diet (HFD) fed \(Irf3^{-/-}\) mice exhibited increased lean mass and decreased fat mass compared to WT, accompanied by increased food intake and energy expenditure. Further investigation showed that the white adipose tissue (WAT) of \(Irf3^{-/-}\) mice had increased expression of brown adipocyte selective genes compared to WT, and the inguinal WAT of the \(Irf3^{-/-}\) mouse contain multilocular adipocytes that resemble brown adipocytes. These data suggest that IRF3 affects energy homeostasis by regulating the development of brown adipocyte-like cells in WAT. Additionally, \(Irf3^{-/-}\) mice are significantly more insulin sensitive and glucose tolerant compared to WT when kept on HFD. Consistent with in vivo observations, IRF3 knockdown in 3T3-L1 adipocytes resulted in enhanced insulin-stimulated glucose uptake and lipogenesis, while overexpression of constitutively active IRF3 had the opposite effect. Several IRF3 target genes in adipocytes were identified using transcriptional profiling. Interestingly, the expression level of Slc2a4 (encoding the Glut4 protein) was inversely correlated with that of IRF3 in both WAT and cultured adipocytes. Analysis of the Slc2a4 proximal promoter identified a putative IRF3 binding site upstream of the transcription start site, and luciferase assay in 3T3-L1 adipocytes showed that IRF3 negatively regulates Slc2a4 expression via this site. Taken together, these data indicate that IRF3 plays a role in whole body glucose homeostasis by repressing thermogenic gene expression as well as the expression of adipose Glut4.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Das Borna Disease Virus (BDV, Bornavirus) besitzt ein einzelsträngiges RNA-Genom negativer Polarität und ist innerhalb der Ordnung Mononegavirales der Prototyp einer eigenen Virusfamilie, die der Bornaviridae. Eine außergewöhnliche Eigenschaft des Virus ist seine nukleäre Transkription und Replikation, eine weitere besteht in seiner Fähigkeit, als neurotropes Virus sowohl in vivo als auch in vitro persistente Infektionen zu etablieren. Die zugrunde liegenden Mechanismen sowohl der Replikation als auch der Persistenz sind derzeit noch unzureichend verstanden, auch deshalb, weil das Virus noch relativ „jung“ ist: Erste komplette Sequenzen des RNA-Genoms wurden 1994 publiziert und erst vor einigen Monaten gelang die Generierung rekombinanter Viren auf der Basis klonierter cDNA. Im Mittelpunkt dieser Arbeit standen das p10 Protein und das Phosphoprotein (P), die von der gemeinsamen Transkriptionseinheit II in überlappenden Leserahmen kodiert werden. <br><br> Als im Kern der Wirtszelle replizierendes Virus ist das Bornavirus auf zelluläre Importmechanismen angewiesen, um den Kernimport aller an der Replikation beteiligten viralen Proteine zu gewährleisten. Das p10 Protein ist ein negativer Regulator der viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase (L). In vitro Importexperimente zeigten, dass p10 über den klassischen Importin alpha/beta abhängigen Kernimportweg in den Nukleus transportiert wird. Dies war unerwartet, da p10 kein vorhersagbares klassisches Kernlokalisierungssignal (NLS) besitzt und weist darauf hin, dass der zelluläre Importapparat offensichtlich flexibler ist als allgemein angenommen. Die ersten 20 N-terminalen AS vermitteln sowohl Kernimport als auch die Bindung an den Importrezeptor Importin alpha. Durch Di-Alanin-Austauschmutagenese wurden die für diesen Transportprozess essentiellen AS identifiziert und die Bedeutung hydrophober und polarer AS-Reste demonstriert. <br><br> Die Fähigkeit des Bornavirus, persistente Infektionen zu etablieren, wirft die Frage auf, wie das Virus die zellulären antiviralen Abwehrmechanismen, insbesondere das Typ I Interferon (IFN)-System, unterwandert. Das virale P Protein wurde in dieser Arbeit als potenter Antagonist der IFN-Induktion charakterisiert. Es verhindert die Phosphorylierung des zentralen Transkriptionsfaktors IRF3 durch die zelluläre Kinase TBK1 und somit dessen Aktivierung. Der Befund, dass P mit TBK1 Komplexe bildet und zudem auch als Substrat für die zelluläre Kinase fungiert, erlaubt es, erstmalig einen Mechanismus zu postulieren, in dem ein virales Protein (BDV-P) als putatives TBK1-Pseudosubstrat die IRF3-Aktivierung kompetitiv hemmt. / The Borna Disease Virus (BDV) harbors a single stranded RNA genome of negative polarity. Within the order of Mononegavirales it is the prototype of a new virus family named Bornaviridae. Unique features of this neurotrope virus are its nuclear transcription and replication as well as its ability to establish persistent infections both in vivo and in vitro. The underlying mechanisms of BDV replication and persistence are currently not well understood amongst others due to the fact that BDV is quite a young virus: First complete sequences of the RNA genome have been published in 1994. Only a few months ago the generation of a recombinant Bornavirus from cloned cDNA has been accomplished. <br><br> The work presented here focused on the viral p10 protein and the phosphoprotein P that are both encoded by two overlapping reading frames of the transcription unit II. <br><br> Nuclear replication of the Bornavirus relies on cellular import mechanisms to allow for nuclear import of viral proteins involved in viral replication. The p10 protein has been described as a negative regulator of the viral RNA dependent RNA polymerase (L). In vitro import experiments revealed that p10 translocates into the nucleus via the classical importin alpha/beta; dependent pathway. This was unexpected since p10 does not contain a predictable classical nuclear localization signal (NLS) suggesting that the cellular import machinery is more flexible than generally believed. The first 20 amino acids mediate nuclear import and binding to the import receptor importin alpha. Analysis of di-alanine-exchange mutants identified essential amino acids and furthermore revealed the impact of hydrophobic and polar side chains in receptor binding and nuclear import. <br><br> The ability of the Bornavirus to establish persistent infections rises the question of how the virus circumvents cellular antiviral defense mechanisms, in particular the type I interferon system. This work characterizes the viral P protein as a potent antagonist of IFN beta induction. It prevents the activation of the central transcription factor IRF3 by interfering with the cellular kinase TBK1. The finding that P forms complexes with TBK1 and moreover serves as a kinase substrate allows to postulate a mechanism for the first time, in which a viral protein (BDV-P) acts as a putative TBK1 pseudo-substrate and thereby competitively inhibits IRF3 activation.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

L’immunité innée est notre premier mécanisme de défense contre l’invasion des pathogènes. Cette défense est basée sur la reconnaissance d’éléments invariables des pathogènes par des récepteurs encodés dans les lignées germinales. Dans la réponse anti-virale, le facteur de transcription Interferon Regulatory Factor 3 (IRF3) joue un rôle clé dans la réponse interféron de type I, combattant ainsi la réplication virale et conférant un état anti-viral aux cellules infectées ainsi qu’aux cellules avoisinantes. IRF3 est une protéine dont l’activation et la phosphorylation sont régulées par les kinases TBK1 et IKKi. Nous proposons ici que l’acétylation est une modification post-traductionnelle importante dans la régulation de l’activité d’IRF3. Nous avons observé par immunobuvardage qu’IRF3 est acétylé de façon basale et que cette acétylation est induite par la présence du co-facteur CBP et est inhibée par la présence de la kinase TBK1. Par spectrométrie de masse, nous avons ensuite identifié huit lysines sujettes à l’acétylation sur IRF3. Aussi, par mutagénèse dirigée, nous avons muté de façon ponctuelle chacun de ces sites et avons déterminé que la mutation de la lysine 87 inhibe la capacité d’IRF3 à s’attacher à l’ADN en EMSA et à transactiver son élément de réponse en essai luciférase. Aussi, nous proposons que l’acétylation masque la charge positive de la lysine 87 et contrôle de façon négative l’activité du facteur de transcription IRF3. Notre groupe démontre ainsi pour la première fois l’acétylation du facteur de transcription dans un modèle cellulaire et propose que ce processus joue un rôle inhibiteur dans la régulation de la protéine. / Innate immunity is our first line of defense against invading pathogens. This process is based on the recognition of invariable molecular patterns present on different pathogens by germ-line encoded receptors. In the innate immune response against invading viruses, the transcription factor Interferon Regulatory Factor 3 (IRF3) plays a major role in the regulation of type I interferons, priming the defense of infected and surrounding cells against viral infection. The phosphorylation and activation of IRF3 is regulated by the kinases TBK1 and IKKi. Here we suggest that acetylation is also an important post-translational modification in the regulation of this transcription factor. We have observed by immunoblot analysis a basal acetylation of IRF3, which is increased in the presence of its co-factor CBP and inhibited in the presence of its kinase TBK1. Also, we have identified on IRF3 eight different lysine residues subjected to acetylation using mass spectrometry and we have mutated these sites using sitedirected mutagenesis. We found that the K87R mutation inhibits IRF3-DNA binding in EMSA and leads to the transactivation of its promoter in luciferase assays. We also suggest that by masking the positive charge of the lysine 87 residue, acetylation negatively controls the activity of IRF3. Our group thus demonstrates for the first time the acetylation of IRF3 in a cellular model and suggests that this modification plays a role in the inhibition of the IRF3 transcription factor.

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Suite à une stimulation de macrophages au LPS, TANK est phosphorylé en C-terminal et polyubiquitiné de manière non dégradative en N-terminal. Ces deux phénomènes sont indépendants mais dépendent tout deux des kinases IKKe/TBK1. TANK comme ces deux kinases est indispensable à l'activations des facteurs transcriptionnels IRF3/7. Le signalosome COP9/CSN semble aussi intervenir dans la régulation de cette activation via l'interaction TANK/IKKe/CSN5.

Influenza A viruses can cause a highly contagious respiratory illness in humans. Immediately after virus infection the innate immune response is initiated by binding of viral RNA species to RIG-I that leads to activation of IRF3 and NF-κB transcription factors and activation of interferon (IFN) transcription. LGP2 is a member of the RIG-I like receptor (RLR) family and is induced after virus infection. The role of LGP2 in virus infection is controversial: it has been reported to either positively or negatively affect RIG-I mediated signaling. The goal of this study was to determine whether LGP2 has a role during infection with influenza A viruses that have circulated in humans. We focused on two viruses expressing NS1 proteins that differ in their ability to inhibit IRF3 activation and IFN transcription; a H1N1 virus (Tx91) that inhibits IRF3 activation and a H3N2 virus (Ud) that does not. This study revealed that LGP2 has strikingly different roles during infection of mouse embryonic fibroblasts and human cells with these viruses. Specifically, LGP2 has no detectable role in H1N1 virus-infected cells, whereas it downregulates IFN synthesis in H3N2 virus-infected cells. Our results indicate that LGP2 acts as a negative regulator of the IFN response in influenza A viruses that activate IRF3. The NS1 protein also binds the 30kDa-subunit of the cleavage and polyadenylation specificity factor-CPSF30, a protein required for 3′-end processing of cellular pre-mRNAs, thereby inhibiting production of mature IFN-β mRNA. The NS1 proteins of pathogenic 1997 H5N1 viruses lack two highly conserved residues (F103 and M106) that are needed to stabilize the NS1-CPSF30 complex. Instead their NS1 proteins have L at 103 and I at 106, resulting in non-optimal CPSF30 binding in infected cells. We demonstrated that strengthening CPSF30 binding by changing L and I to the consensus residues (F and M respectively) leads to a dramatic (300-fold) increase in lethality of the virus in mice. This increased virulence is associated with faster systemic spread of the virus. Microarray analyses revealed increased cytokine levels in extrapulmonary tissues, particularly the brain. These results highlight the importance of NS1:CPSF30 binding in modulating virulence in H5N1 viruses. / text