Le foie et le poumon sont deux organes intimement liés et les atteintes pulmonaires sont fréquentes dans les pathologies hépatiques. En transplantation hépatique, les atteintes pulmonaires, les complications et la morbi-mortalité qu’elles engendrent, peuvent être en lien avec la pathologie hépatique du receveur mais aussi avec le donneur via le greffon, sa qualité et sa préservation. L’objectif de cette thèse était d’étudier deux aspects de cette interaction : 1- l’impact de l’insuffisance respiratoire aigüe (définie par le recours à la ventilation mécanique) sur le devenir post-transplantation ii) les conséquences des phénomènes d’ischémie-reperfusion du greffon hépatique sur les paramètres cardio-pulmonaires du receveur.Dans le premier travail, nous avons étudié, sur une cohorte de patients transplantés hépatiques à l’Hopital Henri Mondor (n=350 patients), le devenir post-opératoire en fonction de la présence ou non d’une ou plusieurs défaillances d’organe (neurologique, respiratoire, rénale, hémodynamique, hépatique et de la coagulation). Les patients avec au moins une défaillance d’organe ont une diminution significative de la survie post-LT à 90 jours (79% contre 96%) et 1 an (70% contre 91%) comparés aux patients cirrhotiques sans défaillance. Dans un deuxième travail issu de la même cohorte, nous développons un modèle permettant de prédire la mortalité à court terme et composé de 6 facteurs dont l’existence d’une défaillance d’organe. Le 3e travail, avec un effectif plus important (cohorte de l’Agence de la Biomédecine, PHRC « Optimatch »), a cherché à confirmer nos premiers résultats et à étudier le poids de chacune des défaillances d’organe et en particulier de la défaillance pulmonaire. Non seulement la présence d’une défaillance mais le nombre de défaillances au moment de la TH influence négativement le devenir à 3 mois des transplantés hépatiques. De plus, les défaillances pulmonaire et rénale sont des facteurs de risque indépendant de mortalité à 3 mois post-transplantation. Ces travaux montrent aussi que l’influence de ces défaillances d’organe peut être modulée en fonction du type de greffon, i.e. des critères du donneur.En plus de la qualité du greffon hépatique, la conservation de celui-ci a un impact sur la fonction du greffon et sur les paramètres cardio-pulmonaires chez le receveur. En effet dans un modèle de transplantation hépatique chez le gros animal (cochon), nous avons montré que les lésions d’ischémie/reperfusion du greffon engendrées entre le prélèvement et l’implantation ont des conséquences sur la fonction du greffon, le myocarde et le poumon. Ces lésions sont modulables selon la technique de préservation, notamment via l’utilisation de machine de perfusion.Ces travaux démontrent qu’au cours de la transplantation hépatique l’atteinte du parenchyme pulmonaire a un rôle clinique majeur chez le receveur et est médiée en partie par des phénomènes d’ischémie-reperfusion du greffon potentiellement modifiables par des améliorations des pratiques médicales. / Liver and lung are two closely related organs. In liver transplantation, lung damage, complications, morbidity and mortality can be related to the liver disease of the recipient but also to the donor via the graft, its quality and its preservation. The aim of this manuscript was to study two aspects of these interactions: 1- the impact of acute respiratory failure (defined by the use of mechanical ventilation) on the post-transplantation outcome ii) the consequences of the ischemia-reperfusion injury of the graft on cardiopulmonary parameters in the recipient.In the first study, we investigated the impact of one or more organ failure (cerebral, lungs, kidney, circulation, hepatic and coagulation) on the 90-day mortality post LT. Patients with at least one organ failure had a significant decrease in post LT survival at 90-day (79% versus 96%) and 1 year (70% versus 91%) compared with cirrhotic patients without failure. In a second study, from the same cohort, we developed a model to predict short-term mortality. This model is composed of 6 factors including the existence of organ failure. In the third study, with a largest cohort (Agence de Biomedicine, PHRC “Optimatch”), we have confirmed these first results and we observe that the number at the LT influences the outcome. Decision tree-modeling identified 6 subgroups further classified in 4 increasing risk classes, highlighting the prognostic importance of respiratory failure and renal failure at the LT as well as complex interactions between donor and recipient features.In addition to the quality of the graft, its preservation has an impact on the graft function and on the cardiopulmonary parameters in the recipient. Indeed, in a model of LT in the large animal (pig) we show that the ischemia / reperfusion injuries, generated between the sampling and the implantation, have consequences on graft function, myocardium and lung. These lesions could be subdued according to the preservation technique.These studies demonstrate that during LT the recipient's pulmonary complications and its morbidity are related to the recipient’s pre-existing hepatic disease and to the donor via the graft through ischemia-reperfusion phenomena of the graft.

Notre équipe s’intéresse à la relation structure-fonction d’une protéine, l’antithrombine (AT), un inhibiteur physiologique de la coagulation, en vue d’un développement thérapeutique. Cette protéine anticoagulante, capable de lier un motif pentasaccharidique sur les dérivés hépariniques, possède en outre, à fortes concentrations (500%), des propriétés anti-inflammatoires médiées par sa liaison aux héparan-sulfates cellulaires. Ce profil a mené à l’évaluation de l’AT dans des situations associant un emballement de la coagulation et de l’inflammation, comme c’est le cas au cours du sepsis sévère et d’autres situations d’ischémie-reperfusion (I/R). Cependant, les fortes concentrations utilisées dans les études précliniques nécessiteraient d’administrer des doses d’AT incompatibles avec le profil de sécurité de cette protéine anticoagulante.Dans ce contexte, nous avons, au cours de ce travail, caractérisé un variant d’AT (AT-N135Q-Pro394) dépourvu d’activité anticoagulante et doué d’une affinité augmentée pour l’héparine. Ce variant est capable de piéger des dérivés hépariniques et apparait comme un candidat idéal pour une utilisation comme antidote en cas de surdosage en héparine non fractionnée (HNF), héparines de bas poids moléculaire (HBPM) ou fondaparinux. Par ailleurs, ce variant pourrait être utilisé à des doses cytoprotectrices, sans risque hémorragique.Afin de tester cette dernière hypothèse, nous avons développé un modèle d’I/R rénale chez la souris, qui s’accompagne d’une augmentation significative de marqueurs de dysfonction rénale (Urée, Créatinine, Kim-1) et de l’inflammation (expression tissulaire de cxcl-1, il-6). L’AT avait déjà été montrée protectrice (Mizutani et al, Blood 2003) dans un modèle murin comparable. De façon surprenante, nous n’avons observé aucun des effets protecteurs décrits, ni sur l’inflammation ni sur la fonction rénale, et que ce soit avec de l’AT plasmatique, de l’AT recombinante ou encore avec un mélange équimolaire d’AT latente et native. Ce même modèle nous a pourtant permis de mettre en évidence les effets nephroprotecteurs et anti-inflammatoires d’une autre protéine anticoagulante, la protéine C activée. Ces résultats décevants font écho à la rétractation pour fraude de l’article de Mizutani et al. en 2013. Le travail approfondi que nous avons mené nous permet de clarifier la littérature et d’affirmer que l’AT, d’origine plasmatique ou recombinante, ne possèdent pas d’effet protecteur dans l’I/R rénale chez la souris. Dans ces conditions, le variant AT-N135Q-Pro394 n’a pas été testé.Concernant la seconde indication, l’AT-N135Q-Pro394 avait déjà été évaluée in vivo comme antidote aux dérivés hépariniques, HNF, HBPM et fondaparinux, avec d’excellents résultats. Néanmoins, cet effet antidote a été exploré spécifiquement par mesure de l’activité anti-facteur Xa alors que l’AT inhibe plusieurs enzymes de la cascade de coagulation tel que les facteurs VIIa, IXa et IIa. Nous avons donc exploré cet effet antidote dans un test plus global de la coagulation, le test de génération de thrombine (TGT) pour pouvoir le comparer aux autres stratégies non spécifiques utilisées pour antagoniser les dérivés hépariniques (facteur VII activé recombinant, concentré de complexes prothrombiques activés ou protamine). De façon intéressante, dans un plasma mimant un surdosage, notre variant présente un effet antidote supérieur aux agents hémostatiques et au sulfate de protamine vis-à-vis du fondaparinux et des HBPMs, respectivement, et équivalent au sulfate de protamine vis-à-vis de l’HNF. Enfin, dans du plasma en l’absence d’anticoagulant, l’AT-N135Q-Pro394 ne montre aucun effet sur la génération de thrombine contrairement aux agents hémostatiques et au sulfate de protamine qui, ajoutés seuls dans du plasma, modifient significativement le profil des TGT / Our team topic focuses on the structural-function relationship of a natural anticoagulant, antithrombin (AT), in order to develop potential therapeutic agents. AT inhibits several serine proteases of the coagulation cascade and its inhibitory activity is increased when AT binds to a pentasaccharidic motif contained within in the heparin derivatives. At high concentrations (500%), AT also exerts anti-inflammatory and cytoprotective properties through its binding to heparan sulfate proteoglycans, making it a good candidate for supportive therapy in clinical settings associating inflammation and coagulation activation. Indeed, AT has already been evaluated in vivo in various models of ischemia-reperfusion injury (IRI) and AT even reached a large-scale clinical trial in severe sepsis. However, the high concentrations of AT that are needed to exert anti-inflammatory properties are inconsistent with the safety profile of this anticoagulant protein.In this context we have further characterized an AT variant (AT-N135Q-Pro394) with increased affinity to heparin but devoid of anticoagulant activity. Indeed, this variant was described to be able to trap heparin derivatives and our work was to pursue the characterization of this variant as an antidote toward heparin derivatives in clinical situations of overdosing. In addition, this AT variant binds to heparan sulfate proteoglycans with higher affinity, as compared to native AT, and appears as a promising cytoprotective agent whose administration would not be associated with any bleeding risk.To test the latter hypothesis, we developed a murine model of renal IRI in which the renal function was severely impaired, as attested by increased kidney injury markers (urea, creatinine, kim-1) and local kidney inflammation (renal gene expression of il-6 and cxcl-1). Indeed, in 2003, Mizutani et al. reported a protective effect of AT in a similar murine model of renal IRI. Surprisingly, we observed none of the described protective effects, neither on inflammation nor renal function, with plasma AT, recombinant AT and an equimolar mixture of native and latent AT. Nevertheless, the same model enabled us to highlight the nephroprotective and anti-inflammatory properties of another anticoagulant protein, activated protein C (APC), as previously reported. These disappointing results coincided with the withdrawal in 2013 of the study of Mizutani et al., and our work allowed us to clarify the literature and to claim that neither recombinant nor plasma-derived native nor latent forms of AT exhibit a protective effect in renal IRI in mice. Under these conditions, AT-N135Q-Pro394 variant has not been tested in our model.AT-N135Q-Pro394 has also been previously shown to efficiently neutralise the anticoagulant activity of heparin derivatives, including unfractionated heparin (UFH), low molecular weight heparins (LMWH) and fondaparinux in vivo. Nevertheless, this reversal effect was only explored by anti-factor Xa assays whereas AT inhibits a number of coagulation proteases, including factors VIIa, IXa and IIa. Therefore, we explored AT-N135Q-Pro394 variant in a more global coagulation assay, the thrombin-generation assay (TGA), in order to compare its activity with non-specific reversal agents used toward heparin derivative overdose (recombinant-activated factor VII, activated prothrombin-complex concentrate or protamine). Interestingly, in plasma mimicking an overdose, our variant demonstrated greater reversal efficiency as compared to hemostatic agents and protamine sulfate toward fondaparinux and LMWH, respectively, and was as efficient as protamine sulfate toward UFH. Finally, when added to native plasma (in the absence of heparin derivative), AT-N135Q-Pro394 showed no effect on thrombin generation unlike hemostatics and protamine sulfate that all significantly affect the TGA profile

Les phénomènes d’ischémie-reperfusion sont rencontrés dans plusieurs situations physiopathologiques. Le seul traitement de l’ischémie repose sur une restauration précoce du flux sanguin. Paradoxalement, la reperfusion génère des lésions supplémentaires, appelées « lésions de reperfusion », dont la mitochondrie est un acteur majeur via l’ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondrial (mPTP). L’ouverture du mPTP est principalement modulée par la cyclophiline D (CypD), une protéine de la matrice mitochondriale, dont l’inhibition pharmacologique par la cyclosporine A (CsA) permet de limiter l’ouverture du pore. Cette inhibition, obtenue in vitro et in vivo, permet de réduire les lésions de reperfusion. Néanmoins, de récents essais cliniques n’ont pas permis de confirmer ce bénéfice dans le cadre de l’infarctus du myocarde, soulignant la nécessité de développer de nouveaux inhibiteurs du mPTP. Dans ce travail, nous avons étudié l’effet de nouveaux ligands de la CypD sur l’ouverture du mPTP. Ces petites molécules innovantes, de structure radicalement différente de la CsA inhibent l’ouverture du mPTP de mitochondries isolées et le dérivé le plus actif, le C31, permet une inhibition plus efficace du mPTP que la CsA. Le C31 inhibe également le mPTP au niveau cellulaire, dans des hépatocytes primaires et dans des cardiomyocytes isolés. In vivo, le C31 atteint les mitochondries hépatiques et protège le foie dans un modèle d’ischémie-reperfusion hépatique. Cependant, la stabilité métabolique du C31 ne lui permet pas d’atteindre le cœur. La poursuite du développement de ces inhibiteurs pourrait aboutir à de nouveaux candidats pour protéger les organes des lésions de reperfusion. / Ischemia-reperfusion can occur in various pathophysiological situations such as myocardial infarction or organ transplantation. The only available treatment of ischemia relies on a timely reperfusion which paradoxically causes additional damage, so-called « reperfusion injury ». Mitochondria play a central role in this phenomenon through the opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) which extends cell death. mPTP opening is modulated by the matrix protein cyclophilin D (CypD). CypD inhibition by cyclosporin A (CsA), the most described CypD inhibitor, limits reperfusion injury in vivo. Nevertheless, recent clinical trials failed to recapitulate such protection in the context of myocardial infarction, emphasizing the urge to develop new mPTP inhibitors. Here, we investigated the effects of new CypD ligands on mPTP opening. We demonstrated that these small molecules unrelated to CsA are potent mPTP inhibitors and that the most active compound, C31, exhibited stronger mPTP-inhibiting properties as compared to CsA. C31 also inhibited mPTP opening in primary hepatocytes and isolated cardiomyocytes. In vivo, C31 reaches liver mitochondria and protects mitochondrial function in a hepatic ischemia-reperfusion model. Nevertheless, C31 metabolic stability hampers cardiac uptake of the compound. Further development of these new inhibitors might lead to interesting candidates to protect organs against ischemia-reperfusion injury.

Le syndrome d'apnées obstructives du sommeil (SAOS) est connu pour être un facteur de risque indépendant de l'insuffisance coronarienne aiguë. Chez le rat, l'hypoxie intermittente (HI) aiguë ou chronique augmente la sensibilité du cœur à l'infarctus. En effet, l'exposition à l'HI (FiO2 5%) de 4 h ou de 14 jours aggrave les lésions myocardiques induites par une ischémie-reperfusion (I/R). Le but de ce travail est de déterminer si des agents connus pour leurs propriétés anti-ischémiques peuvent prévenir les conséquences cardiovasculaires délétères de l'HI chez le rat. Ainsi les effets de l'érythropoïétine (EPO), la trimétazidine (TMZ), le tempol et la mélatonine sur la cardiosensiblisation induite par l'HI ont été étudiés. L'administration d'EPO exogène immédiatement avant ou après une I/R empêche l'aggravation de l'infarctus induite par l'IH aiguë dans le cœur isolé de rat. Le tempol et la mélatonine préviennent également les effets délétères de l'HI via leurs propriétés antioxydantes. L'administration concomitante à une HI chronique de 14 jours de l'un de ces agents permet de réduire significativement l'aggravation de l'infarctus et l'élévation de la pression artérielle moyenne. De plus, le traitement par le tempol abolit la génération d'ion superoxyde (O2.-) et la surexpression de la sous-unité p47-phox de la NADPH oxydase, suggérant le rôle du stress oxydant dans les effets cardiovasculaires délétères de l'HI chez le rat. En revanche, la trimétazidine administrée durant les 14 jours d'HI n'a pas d'effet significatif, suggérant que l'action anti-ischémique de la TMZ ne peut compenser les effets de l'HI. Des études complémentaires sont nécessaires pour explorer les mécanismes impliqués dans la cardiosensibilisation et en particulier le rôle exact du stress oxydant. Ainsi, de nouvelles perspectives cliniques et thérapeutiques basées sur ces études pourraient être envisagées dans le SAOS.

Le postconditionnement cardiaque est paradoxal chez le rat. Certains auteurs ont montré que cet animal pouvait être protégé par le postconditionnement alors que d'autres ont montré qu'il était inefficace. L'objectif de notre travail était d'éclaircir cette situation et d'établir un lien entre la régulation des fonctions mitochondriales et la réussite ou l'échec du postconditionnement. Nous avons montré sur un modèle in vivo que le rat est sensible au postconditionnement cardiaque sous certaines conditions. Il semble que la réussite de cette thérapie nécessite à la fois une préservation de la phosphorylation oxydative, une inhibition de l'ouverture du mPTP et une diminution de la production de ROS. Nous avons également montré que le complexe I de la chaîne respiratoire régule l'ouverture du mPTP en liaison avec l'état de la Cyp D. L'ensemble de nos résultats montrent que le rat n'est pas réfractaire au postconditionnement, mais pour que celui-ci soit efficace, il est nécessaire de préserver l'intégrité des différentes fonctions mitochondriales. La cardioprotection et la régulation des fonctions mitochondriales sont donc spécifiquement liées au modèle utilisé

Introduction : La prévention de la mort de cellules cardiaques contractiles suite à un épisode d'infarctus du myocarde représente le plus grand défi dans la récupération de la fonction cardiaque. On a démontré à maintes reprises que l'ocytocine (OT), l'hormone bien connue pour ses rôles dans le comportement social et reproductif et couramment utilisée dans l’induction de l’accouchement, diminue la taille de l'infarctus et améliore la récupération fonctionnelle du myocarde blessé. Les mécanismes de cette protection ne sont pas totalement compris. Objectif : Étudier les effets d'un traitement avec de l'ocytocine sur des cardiomyocytes isolés en utilisant un modèle in vitro qui simule les conditions d'un infarctus du myocarde. Méthodes : La lignée cellulaire myoblastique H9c2 a été utilisée comme modèle de cardiomyocyte. Pour simuler le dommage d'ischémie-reperfusion (IR), les cellules ont été placées dans un tampon ischémique et incubées dans une chambre anoxique pendant 2 heures. La reperfusion a été accomplie par la restauration du milieu de culture régulier dans des conditions normales d'oxygène. L'OT a été administrée en présence ou en absence d'inhibiteurs de kinases connues pour être impliquées dans la cardioprotection. La mortalité cellulaire a été évaluée par TUNEL et l'activité mitochondriale par la production de formazan pendant 1 à 4 heures de reperfusion. La microscopie confocale a servie pour localiser les structures cellulaires. Résultats : Le modèle expérimental de l'IR dans les cellules H9c2 a été caractérisé par une diminution dans la production de formazan (aux alentours de 50 à 70 % du groupe témoin, p < 0.001) et par l'augmentation du nombre de noyaux TUNEL-positif (11.7 ± 4.5% contre 1.3 ± 0.7% pour le contrôle). L'addition de l'OT (10-7 a 10-9 M) au commencement de la reperfusion a inversé les effets de l'IR jusqu'aux niveaux du contrôle (p < 0.001). L'effet protecteur de l'OT a été abrogé par : i) un antagoniste de l'OT ; ii) le knockdown de l'expression du récepteur à l'OT induit par le siRNA ; iii) la wortmannin, l'inhibiteur de phosphatidylinositol 3-kinases ; iv) KT5823, l'inhibiteur de la protéine kinase dépendante du cGMP (PKG); v) l'ODQ, un inhibiteur du guanylate cyclase (GC) soluble, et A71915, un antagoniste du GC membranaire. L'analyse confocale des cellules traitées avec OT a révélé la translocation du récepteur à l'OT et la forme phosphorylée de l'Akt (Thr 308, p-Akt) dans le noyau et dans les mitochondries. Conclusions : L'OT protège directement la viabilité des cardiomyocytes, lorsqu'elle est administrée au début de la reperfusion, par le déclenchement de la signalisation du PI3K, la phosphorylation de l'Akt et son trafic cellulaire. La cytoprotection médiée par l'OT implique la production de cGMP par les deux formes de GC. / Introduction: The prevention of the death of contractile cardiac cells following an episode of myocardial infarction represents the largest challenge in the recovery of myocardial function. Oxytocin, the hormone best known for its roles in reproduction and social behaviour and used commonly for the induction of parturition, has been repeatedly demonstrated to decrease the infarct size and to ameliorate the functional recovery of the injured myocardium. The mechanisms for this protection are incompletely understood. Objective: To study the effects of oxytocin treatment on isolated cardiomyocytes using an in vitro model simulating the conditions of a myocardial infarction. Methods: The cardiomyoblastic cell line H9c2 was used as a model of cardiomyocyte. For IR injury, the cells were placed in ischemic buffer and incubated in an anoxic chamber for 2 hours. Reperfusion was achieved by restoring cell media under normoxic conditions. OT was administered in the presence or absence of enzyme inhibitors. Cell death was evaluated by TUNEL and mitochondrial activity by formazan production during 1-4 hours of reperfusion. Confocal microscopy served for localization of cell structures. Results. The experimental model of IR in H9c2 cells was characterized by decreased formazan production (at the range of 50-70% of normoxic control, p < 0.001) and by the increased number of TUNEL-positive nuclei (11.7±4.5 vs. 1.3±0.7% in normoxic control). The addition of OT (10-7 to 10-9 M) at the onset of reperfusion reversed the effects of IR to the control levels (p < 0.001). The protective effect of OT was abrogated by: i) an OT antagonist, OTA and siRNA-mediated OT receptor knockout; ii) the phosphatidylinositol 3-kinases inhibitor wortmannin; iii) the cGMP-dependent protein kinase (PKG) inhibitor, KT5823. Soluble guanylate cyclase (GC) inhibitor ODQ and particulate GC antagonist A71915 only partially blocked the protective effects of OT. Confocal analysis of OT-treated cells revealed translocation of OT receptor and the phosphorylated form of Akt (Thr 308, p-Akt) into the nucleus and mitochondria. Conclusions: OT directly protects cardiomyocyte viability if administered at the onset of reperfusion by triggering signaling of Pi3K, Akt phosphorylation and its cellular trafficking. OT-mediated cytoprotection involves cGMP production by both forms of GC.

Le récepteur éboueur CD36 facilite l’internalisation des acides gras libres non estérifiés (AGNE) au niveau des tissus cardiaque et périphériques. Lors d’une ischémie-reperfusion du myocarde (MI/R), les dommages produits sont en partie liés à l’internalisation des AGNE et à la production d’espèces réactives de l’oxygène, contrairement à ce qui est observé chez des souris déficientes en CD36 (CD36-/-). Nous avons émis l’hypothèse selon laquelle le CP-3(iv), un ligand synthétique du récepteur CD36, exercerait un effet cardioprotecteur en réduisant la taille de la zone myocardique infarcie lors d’une ischémie transitoire du myocarde. Nos objectifs étaient 1) de déterminer l’effet cardioprotecteur du CP-3(iv) et 2) de définir son mécanisme. Pour cela, des études in vivo et ex vivo ont été faites. Des souris de type sauvage ont été traitées avec le CP-3(iv) (289 nmol/kg) par voie sous-cutanée pendant 14 jours avant d’être soumises à 30 minutes d’ischémie suivant la ligature de l’artère coronaire gauche descendante et de sa reperfusion pendant une période de 6 ou 48 heures. De plus, des coeurs isolés de souris ont été perfusés 30 minutes, suivi de 40 minutes à faible débit (10%) et de 30 minutes de reperfusion pendant laquelle le coeur est perfusé avec le CP-3(iv) à une concentration de 10-6 M. Nos travaux ont montré que l’effet cardioprotecteur d’un traitement préventif par le CP-3(iv) permet de diminuer la taille de l’infarctus et préserve l’hémodynamie cardiaque de façon dépendante du CD36 puisque cet effet est non visible chez les souris CD36-/-. De plus, le CP-3(iv) exerce non seulement un effet systémique, mais aussi un effet cardioprotecteur direct sur le coeur isolé. / The scavenger receptor CD36 facilitates the internalization of non-esterified fatty acids (NEFA) on cardiac and peripheral tissues. During myocardial ischemia and reperfusion (MI/R), the damage induced is in part related to the internalization of NEFA and the production of reactive oxygen species, in opposition to what is observed in CD36-deficient mice (CD36-/-). We hypothesized that CP-3(iv), a synthetic ligand of the CD36 receptor, provides a cardioprotective effect by reducing the infarct area during a transient myocardial ischemia. Our objectives were 1) to determine the cardioprotective effect of CP-3(iv) and 2) to define its mechanism. For this, in vivo and ex vivo studies have been done. Wild-type mice were treated with CP-3(iv) (289 nmol/kg) subcutaneously during 14 days before being submitted to 30 minutes of ischemia following left anterior descending coronary artery ligature and reperfusion for a period of 6 to 48 hours. In addition, isolated mouse hearts were perfused 30 minutes, followed by 40 minutes with low flow (10%) and 30 minutes of reperfusion during which the heart is perfused with CP-3(iv) at a concentration of 10-6 M. Our work has shown that the cardioprotective effect of preventive treatment with CP-3(iv) reduces the infarct size and preserves cardiac hemodynamics in a CD36-dependent manner because this effect is not visible in CD36-/- mice. In addition, CP-3(iv) not only exerts a systemic effect, but also a direct cardioprotective effect on the isolated heart.

L'ischémie se caractérise par l'obstruction d'une artère coronaire qui prive le tissu d'un apport en oxygène et nutriments. Bien que nécessaire, la reperfusion, c'est-à-dire la réouverture de l'artère, s'accompagne de lésions tissulaires, appelées lésions de reperfusion. Au cours de l'I/R, le TNF-α, cytokine pro-inflammatoire, augmente. Sa liaison sur son récepteur TNFR1 induit le recrutement des protéines FADD et procaspase-8 formant le complexe DISC qui permet l'activation de la caspase-8. La caspase-8 clive une protéine pro-apoptotique, Bid, qui induit une perméabilisation de la membrane mitochondriale entrainant une production excessive de radicaux libres et une libération de cytochrome c. Cette dernière associée à Apaf-1 et procaspase-9 sert de plateforme d'activation à la caspase-9, qui, une fois activée, clive et active la caspase-3. La caspase-2 est une caspase initiatrice, tout comme la caspase-8. Pourtant, son rôle dans l'I/R cardiaque est peu connu. La production de ROS via la voie TNF-α/caspase-8 provoque des dommages à l'ADN. Ceci entraine l'activation de PARP-1, une enzyme impliquée dans la réparation de l'ADN. En fonctionnant, PARP-1 produit de l'ADP-ribose qui peut se fixer sur le canal TRPM2 et ainsi l'activer. L'ouverture de ce canal cationique provoque une entrée de Ca2+ qui contribue à la mort cellulaire et aux lésions de reperfusion. L'objectif de ce travail est de déterminer les mécanismes de mort cellulaire faisant intervenir la caspase-8, la caspase-2 et TRPM2 et d'évaluer les effets d'une inhibition de ces protéines sur les lésions de reperfusion. Un modèle de rat I/R met en évidence une augmentation de TNF-α après seulement 1h de reperfusion suivie d'une activation de la caspase-8. Cette activation entraine une production de ROS qui altère la structure et la fonction du canal RyR2, favorisant la fuite de Ca2+ du reticulum sarcoplasmique vers le cytosol. La caspase-2, exprimée dans le ventricule gauche, est activée avant la caspase-8 et induit une voie apoptotique de type intrinsèque. L'inhibition de la caspase-8 ou de la caspase-2 diminue les lésions de reperfusion. Parallèlement, le TNF-α induit un courant de type TRPM2 via l'activation de la caspase-8 et la production de ROS. In vivo, l'inhibition de TRPM2 par le clotrimazole diminue les lésions de reperfusion chez un modèle de souris I/R. La caspase-8, la caspase-2 et TRPM2 contribuent aux lésions de reperfusion et apparaissent comme de bonnes cibles dans la cardioprotection. / Myocardial ischemia and reperfusion (I/R) lead to repefusion injury. TNF-α, a pro-inflammatory cytokine, increases during reperfusion and contributes to this injury. The binding TNF/TNFR1 leads to the recruitment of FADD, TRADD and procaspase-8 and form a complexe named DISC. This complexe activates caspase-8, which cleaves Bid, a pro-apoptotic member of Bcl-2 family. tBid disrupts the mitochondrial membrane and induces a ROS production and a release of cytochome c, localized in intermembrane space. In cytosol, a complexe named apoptosome is formed with cytochrome c, Apaf-1 and procaspase-9 to activate caspase-9, which cleaves and activates caspase-3. Like caspase-8, caspase-2 is an initiator caspase. But little data exists on the role of this caspase in myocardial I/R.The disruption of mitochondria induces a ROS production which causes DNA damage. The enzyme PARP-1, involved in DNA repair, is then activated. By operating, PARP-1 produces ADP-ribose which can bind on TRPM2, a non selective cationic channel of TRP family. The opening of TRPM2 causes an increase of cytosolic calcium promoting cell death and reperfusion injury. The goal of this study was to determine the mechanisms of cell death after I/R involving caspase-8, caspase-2 and TRPM2 and to test an inhibitor of each protein on reperfusion injury. With a model of rat I/R, we demonstrated that TNF-α increases after only 1h of reperfusion following by a caspase-8 activation and a ROS production. Oxidative stress causes a modification of RyR2 with a leak of calcium in cytosol. Caspase-2, also expressed in ventricles, is activated before caspase-8 and induces an intrinsic apoptotic pathway until caspase-3 activation. An inhibition of caspase-8 or caspase-2 decreases the reperfusion injury.In mouse cardiomyocytes, TNF-α induces a TRPM2-like current through caspase-8 activation and ROS production. TRPM2 inhibition by clotrimazole decreases cell death and reperfusion injury in vivo.In conclusion, caspase-2, caspase-8 and TRPM2 play an important role in cell death pathway ans should be good therapeutical tools.

L’ischémie/reperfusion (I/R) induit des lésions impliquées dans la physiopathologie de la transplantation cardiaque où elles contribuent à augmenter le rejet de greffe. Le stress induit par l’ischémie entraîne la libération d’ATP conduisant à l’activation de récepteurs purinergiques (P2R) dont l’expression est établie au niveau cardiaque et immunitaire. L’objectif de ce travail a été d’explorer l’effet de la signalisation P2R sur le phénotype des cellules dendritiques (DCs) et la réponse des cardiomyocytes (CM) à l’I/R. Nous avons montré que la récepteur P2Y11 (P2Y11R) avait une action immunomodulatrice sur les DCs en diminuant la sécrétion d’IL-6 et IL-12 et en inhibant la polarisation de la réponse adaptative vers Th1. Le post-conditionnement pharmacologique ciblant P2Y11R a apporté une protection efficace sur les CM en limitant le stress oxydant et en activant la PKCe connue pour inhiber l’ouverture du mPTP. Les effets protecteurs et immunomodulateurs de P2Y11R se sont confirmés in vivo en diminuant le rejet allogénique dans un modèle murin de transplantation cardiaque hétérotopique. Nos résultats suggèrent que P2Y11R pourrait être une cible thérapeutique apportant des effets bénéfiques en transplantation cardiaque. / Ischemia/reperfusion (I/R) injuries are involved in the pathophysiology of heart transplantation where they will increase graft rejection. Ischemia generates cellular stress leading to ATP release in the extracellular medium that may activate purinergic receptors (P2R) expressed by cardiomyocytes and immune cells. Therefore, these receptors may play important regulatory roles. The aim of this study was to investigate the effect of P2R signaling on dendritic cells phenotype (DCs) and cardiomyocyte (CM) response to I/R. We showed that P2Y11 receptor (P2Y11R) exhibited an immunomodulatory role in DCs by decreasing release of IL-6 and IL-12 and inhibiting polarization of the adaptive response towards Th1. Pharmacological post-conditioning targeting P2Y11R provided effective protection to CM by limiting oxidative stress and activating PKCe known to inhibit the opening of the mPTP. The protective and immunomodulatory effects of P2Y11R stimulation were confirmed in vivo by the decrease of allogeneic acute rejection in a murine model of heterotopic heart transplantation. In conclusion, our results strongly suggest that P2Y11R may be a promising therapeutic target providing beneficial effects in cardiac transplantation.

Les cardiofibroblastes (CF) possèdent des rôles clés dans la régulation de la structure et du fonctionnement myocardique. Leurs implications physiopathologiques, notamment dans le remodelage et la fibrose, ont été largement décrites dans les maladies cardiovasculaires chroniques. Cependant, leurs rôles au cours de la phase aigüe d'ischémie-reperfusion (l/R) restent encore à élucider. Nous avons donc émis l'hypothèse que les CF pouvaient participer à la protection des cardiomyocytes (CM) face aux lésions d'l/R. Le but de ce travail a donc consisté en l'exploration et l'identification des mécanismes de cette protection. Un modèle cellulaire de CM et CF de rats nouveau-nés in vitro et un modèle d'l/R in vivo chez la souris ont été utilisés. Nos résultats montrent que la présence des CF, en co-culture avec les CM, augmente de façon paracrine leur viabilité, face aux lésions d'l/R. Cette action paracrine a été confirmée par l'utilisation du sécrétome de CF hypoxiques capable, à lui seul, d'augmenter la viabilité des CM. Ces résultats ont été corroborés par des expériences d'l/R in vivo, dans lesquelles les souris traitées avec le sécrétome de CF présentent une diminution de la taille d'infarctus. De plus, nous avons montré que TlMP-1, un facteur fortement détecté dans le sécrétome de CF, est capable de diminuer à la fois la mortalité cellulaire in vitro des CM et la taille de l'infarctus in vivo. L'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques nous a permis de mettre en évidence que cette protection paracrine était médiée en partie par l'activation des voies de signalisation Pl3K/Akt et ERK1/2. En conclusion cette étude démontre pour la première fois que les CF participent, de façon paracrine, à la protection des CM au cours la phase aigüe d'ischémie reperfusion. TlMP-1 semble être un des facteurs clé de cette cardioprotection par les CF. En parallèle de ce travail, plusieurs études collaboratives ont été réalisées, sur une cible majeure d'investigation dans la cardioprotection : le pore de transition de perméabilité mitochondriale et notamment sa régulation par le complexe l de la chaîne respiratoire et les échanges calciques, ainsi que son implication dans la défaillance multi-organe face à l'arrêt cardiaque / Roles of cardiac fibroblasts (CF) in the regulation of myocardial structure and function have been emphasized in the last decade. Their implications in pathophysiological aspects of chronic heart diseases such as myocardial remodelling and fibrosis is now well established. However their contribution to the acute phase of ischemia reperfusion injury still remains elusive. We hypothesized that CF may contribute to cardiomyocytes (CM) protection against ischemia reperfusion (l/R) injuries. This study was designed to investigate this protection and identify some of its mechanisms. Experiments were performed both on isolated neonatal rat CF and CM in vitro and in vivo mice model of myocardial infarction. We demonstrated that the presence of CF increases CM viability in co-cultures and that CF protect CM against l/R injuries in a paracrine manner. lt was confirmed by a similar effect of hypoxic CF secretome alone on CM viability. These findings were corroborated by in vivo experiments in which an infarct size reduction was observed in CF secretome treated mice. Furthermore, experiments with Tissue lnhibitor of Metalloproteinases-1 (TlMP-1), abundantly detected in CF secretome, was able to both decrease CM cell death and infarct size. Experiments with pharmacological inhibitors provided more evidence that this paracrine protection is partly mediated by Pl3K/Akt and ERK signalling pathways. Our data demonstrated for the first time that CF participate in cardioprotection during the acute phase of ischemia reperfusion, via a paracrine pathway, involving TlMP-1. Besides this first work, other collaborative studies have been performed, to investigate a major target in cardioprotection research : the mitochondrial permeability transition pore and its regulation by chain respiratory complex l and Ca2+ transfers and finally its implication in multiple organ failure in cardiac arrest