Introdução: Injúria renal aguda (IRA) é uma síndrome cuja etiologia mais frequente é isquemia reperfusão. Diversos estudos clínicos e pré-clínicos sobre IRA têm sido desenvolvidos no sentido de esclarecer os seus mecanismos fisiopatológicos e as possíveis intervenções farmacológicas com efeito renoprotetor. Merecem destaque os resultados renoprotetores de alguns fitomedicamentos. Esse estudo avaliou o efeito da Justicia acuminatissima, planta da região amazônica com propriedades anti-inflamatória e antioxidante, sobre o modelo experimental mencionado. Objetivo: Avaliar a função renal, o perfil oxidativo e a histologia renal dos ratos submetidos à isquemia/reperfusão renal, tratados com Justicia acuminatissima (sara tudo). Métodos: ensaio pré-clínico com Ratos Wistar, adultos, machos (250-350g), distribuídos nos grupos SHAM, Isquemia 30 minutos e Isquemia + sara tudo (1,0g/kg, via oral, 1 vez). Foram avaliados os parâmetros hemodinâmicos (pressão arterial média - PAM, frequência cardíaca - FC, resistência vascular renal RVR e fluxo sanguíneo renal FSR), função renal - FR (clearance de creatinina - Clcr), estresse oxidativo (peróxidos urinários PU, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico TBARs, óxido nítrico NO e tióis no tecido renal) e histologia renais. Resultados: O grupo Isquemia demonstrou declínio na FR, associado ao aumento de PU, TBARs e NO, além da redução dos tióis. O pré-tratamento com sara tudo atenuou a lesão funcional, com elevação do Clcr, redução dos marcadores oxidativos (PU, TBARs e NO) e elevação de tióis. Quanto à hemodinâmica renal, o grupo Isquemia demonstrou elevação da RVR e redução do FSR (p<0,05), enquanto que o tratamento com sara tudo induziu melhora significativa desses parâmetros. A análise histológica confirmou edema, infiltrado, achatamento e necrose tubular no grupo Isquemia, enquanto que o grupo tratado com sara tudo apresentou melhora desses parâmetros. Conclusão: A proteção renal da Justicia acuminatissima, na IRA isquêmica, caracterizou-se por melhora significativa da função renal, reduzindo a lesão oxidativa, com impacto positivo na histologia renal. / Introduction: Acute Kidney Injury (AKI) is a syndrome with growing prevalence, which ischemic-reperfusion is most frequent cause. Several clinical and pre-clinical studies about AKI have been developed to verify the pathophysiological mechanisms and the possible pharmacological interventions. The renoprotector effect of some phytomedicine in AKI induced by ischemia in rats model must be highlighted. This study evaluated the effect of Justicia Acuminatissima (sara tudo), plant from the Amazon region with antiinflammatory and antioxidant properties, in experimental model of AKI. Objective: To evaluate renal function, oxidative profile and renal histology in rats submitted to renal ischemia-reperfusion treated with Justicia Acuminatissima. Method: pre-clinical trial with Wistar rats, adult, male (250-350g), divided into groups: SHAM, Ischemia 30 minutes and Ischemia + (sara tudo) (1,0g/Kg, gavage, once). Hemodynamics parameters (medium arterial pressure-MAP; heart rate-HR; renal vascular resistance-RVR and renal blood flow- RBF), renal function - RF (creatinine clearance), oxidative stress (urinary peroxides-UP, thiobarbituric acid reactive substances- TBARS, nitric oxide- NO and thiols in renal tissue) and kidney histological analysis were evaluated. Results: The ischemia group demonstrated a decline on renal function (RF) associated with increase in UP, NO and TBARS and reduction in thiols levels. The pre-treatment with sara tudo resulted in understatement of functional injury, increase of crCl and reduction of oxidative biomarkers (UP, TBARS and NO) and enhancement of thiols levels. Considering renal hemodynamics, the ischemia group demonstrated increase in RVR with the decrease in RBF. The treatment with sara tudo induced significant improvement in these parameters. Histological analysis confirmed edema, infiltrated, flatness and tubular necrosis in ischemia group, while the sara tudo group presented amelioration in these parameters. Conclusion: The renoprotective effect of Justicia Acuminatissima, in ischemic AKI, features significant improvement in renal function, reducing the oxidative damage with positive impact in renal histology.

As células necessitam do contato com outras células e com a matriz extracelular, para a formação de tecidos. As junções gap são estreitos canais que conectam o citoplasma de células adjacentes, promovendo a passagem de íons orgânicos, aminoácidos, nucleotídeos e outros metabólitos. Estas junções são compostas por dois conexons ou hemicanais, que atravessam a membrana plasmática da célula a que pertencem, e são compostos por seis proteínas integrais de membrana denominadas conexinas (Cxs). A Cx43 é a mais expressa, e é fosforilada ao longo do ciclo de vida, sofrendo mudanças conformacionais, resultando em diferentes isoformas (P0, P1 e P2), apresentando propriedades distintas. A Cx43 apresenta-se distribuída em todo o rim adulto. A injúria renal aguda (IRA) é uma síndrome metabólica em que ocorre redução aguda da função renal e rápida diminuição da taxa de filtração glomerular, sendo hipóxia decorrente da isquemia sua causa principal. A restrição de oxigênio e nutrientes, e o acúmulo de metabólitos, resultam na injúria das células epiteliais tubulares. A depleção dos níveis de ATP, aumento nos níveis de cálcio intracelular, alterações na membrana e deformações no citoesqueleto caracterizam esta injúria. A reoxigenação tecidual atua como agressão adicional devido à liberação de radicais livres. Estudos sugerem que a ativação de hemicanais de Cx43, resultante da desfosforilação da proteína, durante depleção de ATP, esteja envolvida na IRA. Este trabalho verificou o envolvimento da Cx43 em modelo murino desta injúria, ocasionada por isquemia/reperfusão. Foram utilizados camundongos machos da linhagem C57BL/6J. A isquemia foi induzida por clampeamento das artérias renais por 45 minutos. A reperfusão ocorreu durante 24 horas após cirurgia. Foram utilizados 6 animais por grupo (isquêmicos, reperfundidos e controle). Após sacrifício, fragmentos dos rins foram submetidos a ensaios de western blot, PCR em tempo real, imuno-histoquímica e imunofluorescência. O modelo experimental foi validado através da dosagem de uréia e creatinina plasmática. As análises estatísticas foram realizadas pela análise de variância (ANOVA), seguido do teste de Bonferroni. Observou-se aumento significativo dos níveis de uréia e creatinina nos animais isquêmicos e reperfundidos, em relação ao controle. A expressão gênica apresentou aumento significativo apenas nos rins de camundongos reperfundidos (1,9 vezes; P<0,01 vs controle). No western blot verificou-se aumento na quantidade da isoforma hiperfosforilada da Cx43 (P2) em rins isquêmicos (2,73 vezes; P<0,05 vs controle), com diminuição significativa nos reperfundidos (2,37 vezes; P<0,05 vs isquêmico). Nas isoformas menos fosforiladas (P1/P0), observou-se aumento nos rins isquêmicos (2,33 vezes; P<0,05 vs controle), com diminuição nos reperfundidos (10 vezes; P<0,01 vs isquêmico). Nos ensaios imuno-histológicos verificou-se diferentes localizações da Cx43 nas células epiteliais de túbulos corticais nos grupos comparados. Nos controles verificou-se distribuição difusa, e nos isquêmicos observou-se intensa marcação em superfície celular apical. Nos rins reperfundidos, a distribuição da Cx43 foi basolateral. As alterações observadas na expressão gênica, fosforilação protéica e distribuição da Cx43 nos rins foram semelhantes às mudanças observadas na isquemia cardíaca. Este estudo mostrou pela primeira vez a regulação da Cx43 em níveis transcricionais e pós-traducionais, e sua localização celular na IRA ocasionada por isquemia/reperfusão, indicando sua participação neste processo. / The cells require contact with other cells and the extracellular matrix for tissue formation. Gap junctions are narrow channels connecting the cytoplasm of two adjacent cells, promoting the passage of inorganic ions, amino acids, nucleotides and other metabolites. These junctions are composed of two conexons or hemichannels, crossing the cell plasma membrane where they belong, and consist of six integral membrane proteins called connexins (Cxs). The Cx43 is the most expressed, and is phosphorylated throughout the life cycle, undergoing conformational changes, resulting in different isoforms (P0, P1 and P2) that have different properties. The Cx43 is distributed throughout the adult kidney. The acute kidney injury (AKI) is a metabolic syndrome that occurs in acute reduction of renal function and rapid decline in glomerular filtration rate. Hypoxia resulting from ischemia is its principal cause. The restriction of oxygen and nutrients, and accumulation of metabolites, result in the injury of tubular epithelial cells. The depletion of ATP levels, increased levels of intracellular calcium, changes in the membrane and cytoskeleton deformation characterize this injury. Reoxygenation tissue acts as additional injury due to release of free radicals. Studies suggest that activation of Cx43 hemichannels, resulting from dephosphorylation of the protein during ATP depletion, is involved in the AKI. This study investigated the involvement of Cx43 in a murine model of this injury, caused by ischemia/ reperfusion. We used male mice of strain C57BL/6J. Ischemia was induced by clamping the renal arteries for 45 minutes. Reperfusion occurred 24 hours after surgery. We used six animals per group (ischemic, reperfused, and sham). After sacrifice, kidney fragments were tested for western blot, real-time PCR, immunohistochemistry and immunofluorescence. The levels of plasma urea and creatinine were measured to validate the experimental model. Statistical analysis was performed by analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni test. We observed significant increase in serum urea and creatinine in ischemic and reperfused animals compared to sham. Gene expression increased significantly only in the reperfused kidneys (1.9 fold, P <0.01 vs sham). The western blot showed an increase in the amount of hyperphosphorylated isoform of Cx43 (P2) in ischemic kidneys (2.73 times, P <0.05 vs sham), with significant reduction in reperfused (2.37 times, P <0 05 vs ischemic). In the less phosphorylated isoforms (P1/P0), we observed an increase in ischemic kidneys (2.33 times, P <0.05 vs sham), with a decrease in reperfused (10 times, P <0.01 vs ischemic). In immuno-histological tests we verified different locations of Cx43 in the epithelial cells of cortical tubules. In normal kidneys there was patchy distribution, while in ischemic there was intense staining in the apical cell surface. In the reperfused kidney, the distribution of Cx43 was basolateral. The changes in gene expression, protein phosphorylation and distribution of Cx43 in the kidney observed in this study were similar to changes observed in cardiac ischemia. This study showed for the first time the regulation of Cx43 in transcriptional and post-translational levels, and its cellular localization in acute renal failure caused by ischemia/reperfusion, indicating its involvement in this injury.

Les microARNs (miARN) sont de petits ARN régulant l’expression des gènes au niveau post-transcriptionnel. Ils sont impliqués dans la régulation de nombreux processus biologiques nécessaires au fonctionnement cellulaire, comme le contrôle de la réponse à l’inflammation. Dans ce travail, nous avons évalué l’implication des miARN dans la réponse tubulaire rénale à l’inflammation. Au cours d’un premier travail nous avons étudié par une approche globale le profil d’expression des miARN dans des cellules tubulaires proximales de la lignée HKJ2 exposées à des cytokines pro-inflammatoires. Nous avons ainsi identifié la forte induction de miR-146a en réponse au stimulus inflammatoire. Nous avons ensuite mis en évidence in vitro que l’induction de miR-146a par l’IL-1β dans les cellules HK-2 est secondaire à l’activation de la voie NF-κB, constitue un rétrocontrôle négatif de cette voie et régule l’expression de CXCL8 en aval. In vivo, l’étude du phénotype des souris invalidées pour miR-146a dans un modèle d’agression tubulaire rénale où l’inflammation joue un rôle significatif a mis en évidence une aggravation des lésions tubulaires, de l’infiltrat inflammatoire et de la fibrose interstitielle en réponse à l’ischémie-reperfusion. Le blocage de la signalisation induite par CXCL8 par la réparixine, un inhibiteur du récepteur de CXCL8 (CXCR1), permet de limiter le développement des lésions induites par l’ischémie-reperfusion chez les souris miR-146a-/-. Dans un second travail nous avons exploré le phénotype rénal des souris invalidées pour miR-146a, connues pour développer une auto-immunité. / Independently of its cause, acute kidney injury leads to the development of tubular injury and interstitial inflammation that need to be controlled to avoid fibrosis development. We hypothesized that microRNAs (miRNAs) are involved in the regulation of the balance between lesions and adaptive repair. Using HK2 human proximal tubular epithelial cells, we studied in vitro the response to pro-inflammatory cytokines and the regulation of miR-146a. We explored its targets in HK2 cells after stimulation by IL-1β. In vivo we explored the effect of unilateral renal ischemia-reperfusion injury (IRI) in wild-type or miR-146a invalidated mice. In pro-inflammatory conditions, we identified miR-146a to be transcriptionally upregulated by ligands of the interleukin-1-toll-like receptor signaling in HK2 cells. IL-1β treatment induced miR-146a expression in a time- and concentration-dependent manner through the activation of NF-κB, as confirmed by siRNA and luciferase reporter vector experiments. MiR-146a acted as a negative feedback regulator of this critical pathway by targeting IRAK1, thus decreasing CXCL8/CXCL1 expression by injured tubular cells. In vivo, miR-146a was found to be induced in response to renal IRI in a mouse model of renal unilateral IRI seven days after the injury. In human, miR-146a was found to be induced in the renal allograft of patients who experienced acute tubular necrosis early after transplantation as compared to patients with normal allograft biopsy results (P<0.05). Mir-146a levels were also increased in urine samples collected ten days after renal transplantation in recipients of a deceased donor kidney as compared to recipients of a living donor kidney (P<0.01). In situ hybridization localized up-regulated miR-146a mostly in tubular cells after IRI. Fourteen days after unilateral IRI, miR-146a-/- mice had greater tubular injury, inflammatory infiltrate and fibrosis compared with wild-type mice. Inhibition of the CXCL8/CXCL1 signaling using reparixin, a CXCR2 inhibitor, prevented the development of tubular injury, inflammation and fibrosis after IRI in miR-146a-/- mice. In conclusion, these results highlight miR-146a as a key mediator of the renal response to injury by limiting the consequences of inflammation, a key process in the development of acute and chronic kidney diseases.

As células necessitam do contato com outras células e com a matriz extracelular, para a formação de tecidos. As junções gap são estreitos canais que conectam o citoplasma de células adjacentes, promovendo a passagem de íons orgânicos, aminoácidos, nucleotídeos e outros metabólitos. Estas junções são compostas por dois conexons ou hemicanais, que atravessam a membrana plasmática da célula a que pertencem, e são compostos por seis proteínas integrais de membrana denominadas conexinas (Cxs). A Cx43 é a mais expressa, e é fosforilada ao longo do ciclo de vida, sofrendo mudanças conformacionais, resultando em diferentes isoformas (P0, P1 e P2), apresentando propriedades distintas. A Cx43 apresenta-se distribuída em todo o rim adulto. A injúria renal aguda (IRA) é uma síndrome metabólica em que ocorre redução aguda da função renal e rápida diminuição da taxa de filtração glomerular, sendo hipóxia decorrente da isquemia sua causa principal. A restrição de oxigênio e nutrientes, e o acúmulo de metabólitos, resultam na injúria das células epiteliais tubulares. A depleção dos níveis de ATP, aumento nos níveis de cálcio intracelular, alterações na membrana e deformações no citoesqueleto caracterizam esta injúria. A reoxigenação tecidual atua como agressão adicional devido à liberação de radicais livres. Estudos sugerem que a ativação de hemicanais de Cx43, resultante da desfosforilação da proteína, durante depleção de ATP, esteja envolvida na IRA. Este trabalho verificou o envolvimento da Cx43 em modelo murino desta injúria, ocasionada por isquemia/reperfusão. Foram utilizados camundongos machos da linhagem C57BL/6J. A isquemia foi induzida por clampeamento das artérias renais por 45 minutos. A reperfusão ocorreu durante 24 horas após cirurgia. Foram utilizados 6 animais por grupo (isquêmicos, reperfundidos e controle). Após sacrifício, fragmentos dos rins foram submetidos a ensaios de western blot, PCR em tempo real, imuno-histoquímica e imunofluorescência. O modelo experimental foi validado através da dosagem de uréia e creatinina plasmática. As análises estatísticas foram realizadas pela análise de variância (ANOVA), seguido do teste de Bonferroni. Observou-se aumento significativo dos níveis de uréia e creatinina nos animais isquêmicos e reperfundidos, em relação ao controle. A expressão gênica apresentou aumento significativo apenas nos rins de camundongos reperfundidos (1,9 vezes; P<0,01 vs controle). No western blot verificou-se aumento na quantidade da isoforma hiperfosforilada da Cx43 (P2) em rins isquêmicos (2,73 vezes; P<0,05 vs controle), com diminuição significativa nos reperfundidos (2,37 vezes; P<0,05 vs isquêmico). Nas isoformas menos fosforiladas (P1/P0), observou-se aumento nos rins isquêmicos (2,33 vezes; P<0,05 vs controle), com diminuição nos reperfundidos (10 vezes; P<0,01 vs isquêmico). Nos ensaios imuno-histológicos verificou-se diferentes localizações da Cx43 nas células epiteliais de túbulos corticais nos grupos comparados. Nos controles verificou-se distribuição difusa, e nos isquêmicos observou-se intensa marcação em superfície celular apical. Nos rins reperfundidos, a distribuição da Cx43 foi basolateral. As alterações observadas na expressão gênica, fosforilação protéica e distribuição da Cx43 nos rins foram semelhantes às mudanças observadas na isquemia cardíaca. Este estudo mostrou pela primeira vez a regulação da Cx43 em níveis transcricionais e pós-traducionais, e sua localização celular na IRA ocasionada por isquemia/reperfusão, indicando sua participação neste processo. / The cells require contact with other cells and the extracellular matrix for tissue formation. Gap junctions are narrow channels connecting the cytoplasm of two adjacent cells, promoting the passage of inorganic ions, amino acids, nucleotides and other metabolites. These junctions are composed of two conexons or hemichannels, crossing the cell plasma membrane where they belong, and consist of six integral membrane proteins called connexins (Cxs). The Cx43 is the most expressed, and is phosphorylated throughout the life cycle, undergoing conformational changes, resulting in different isoforms (P0, P1 and P2) that have different properties. The Cx43 is distributed throughout the adult kidney. The acute kidney injury (AKI) is a metabolic syndrome that occurs in acute reduction of renal function and rapid decline in glomerular filtration rate. Hypoxia resulting from ischemia is its principal cause. The restriction of oxygen and nutrients, and accumulation of metabolites, result in the injury of tubular epithelial cells. The depletion of ATP levels, increased levels of intracellular calcium, changes in the membrane and cytoskeleton deformation characterize this injury. Reoxygenation tissue acts as additional injury due to release of free radicals. Studies suggest that activation of Cx43 hemichannels, resulting from dephosphorylation of the protein during ATP depletion, is involved in the AKI. This study investigated the involvement of Cx43 in a murine model of this injury, caused by ischemia/ reperfusion. We used male mice of strain C57BL/6J. Ischemia was induced by clamping the renal arteries for 45 minutes. Reperfusion occurred 24 hours after surgery. We used six animals per group (ischemic, reperfused, and sham). After sacrifice, kidney fragments were tested for western blot, real-time PCR, immunohistochemistry and immunofluorescence. The levels of plasma urea and creatinine were measured to validate the experimental model. Statistical analysis was performed by analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni test. We observed significant increase in serum urea and creatinine in ischemic and reperfused animals compared to sham. Gene expression increased significantly only in the reperfused kidneys (1.9 fold, P <0.01 vs sham). The western blot showed an increase in the amount of hyperphosphorylated isoform of Cx43 (P2) in ischemic kidneys (2.73 times, P <0.05 vs sham), with significant reduction in reperfused (2.37 times, P <0 05 vs ischemic). In the less phosphorylated isoforms (P1/P0), we observed an increase in ischemic kidneys (2.33 times, P <0.05 vs sham), with a decrease in reperfused (10 times, P <0.01 vs ischemic). In immuno-histological tests we verified different locations of Cx43 in the epithelial cells of cortical tubules. In normal kidneys there was patchy distribution, while in ischemic there was intense staining in the apical cell surface. In the reperfused kidney, the distribution of Cx43 was basolateral. The changes in gene expression, protein phosphorylation and distribution of Cx43 in the kidney observed in this study were similar to changes observed in cardiac ischemia. This study showed for the first time the regulation of Cx43 in transcriptional and post-translational levels, and its cellular localization in acute renal failure caused by ischemia/reperfusion, indicating its involvement in this injury.

A técnica de isquemia-reperfusão tem sido utilizada em cirurgias conservadoras do rim como a nefrectomia parcial e em transplantes renais. Para se realizar a isquemia pode-se fazer o bloqueio do fluxo sanguíneo da artéria renal ou o bloqueio simultâneo da artéria e da veia renal. O evento isquêmico acarreta em dano celular ao rim principalmente pelo estresse oxidativo local e a liberação de radicais livres assim como o aumento da resposta inflamatória. Diversos autores verificaram lesão renal após a isquemia-reperfusão, porém, apenas testes funcionais foram realizados até o momento. Os autores que tentaram avaliar a lesão morfológica do rim apenas fizeram a quantificação de escores subjetivos. O nosso objetivo é avaliar por quantificação estereológica o dano causado pela isquemia-reperfusão comparando o clampeamento somente arterial com o clampeamento arteriovenoso. Utilizamos 24 ratos wistar, machos, de quatro meses de idade. Os animais foram divididos em três grupos: o grupo Sham (n=8), o grupo de clampeamento somente da artéria renal (n=8) e o grupo de clampeamento simultâneo da artéria e da veia renal (n=8). Os animais foram submetidos a laparotomia mediana. Os animais do grupo Sham permaneceram os 60 minutos anestesiados mas sem obstrução do fluxo sanguíneo de seus vasos renais. Os animais do grupo de clampeamento arterial foram submetidos à clampeamento de sua arterial renal esquerda por 60 minutos e os animais do grupo de clampeamento arterial e venoso tiveram seus vasos renais esquerdos clampeados simultaneamente e em bloco pelo mesmo tempo. Após os 60 minutos os animais foram suturados e mantidos por 30 dias em caixas próprias sendo mortos por sobredose anestésica após decorrido esse tempo. Os rins foram coletados e mantidos em solução de formalina tamponada e posteriormente processados para análise histológica e estereológica. Foram analisados a densidade volumétrica (Vv) dos glomérulos, o número de glomérulos/mm3(Nv) e o volume glomerular médio (VGM). A Vv e Nv se encontrou reduzida nos rins esquerdos submetidos à isquemia mas foi somente significativa nos animais do grupo de clampeamento arterial e venoso. Mesmo usando o rato como modelo animal experimental, a partir de nossos resultados recomendamos o uso do clampeamento somente arterial nos casos em que mínina lesão ao rim é imperiosa. / The ischemia-reperfusion has been used in renal surgery such as conservative partial nephrectomy and kidney transplantation. To perform ischemia we can block the blood flow of renal artery or simultaneous blockade of the renal artery and vein. The ischemia leads to cellular damage to the kidney mainly by local oxidative stress and releasing free radicals as well as increased inflammatory response. Several authors related renal injury after ischemia-reperfusion, however; only functional tests were carried out to date. The authors attempted to evaluate the morphological lesion of the kidney using subjective scores. Our goal is assess by stereological quantification of the renal parenchyma after ischemia-reperfusion injury comparing arterial only clamping and arteriovenous clamping. We used 24 Wistar rats, males, four months old. The animals were divided into three groups: Sham group (n = 8), the group of clamping of the renal artery (n = 8) and the group of simultaneous clamping of renal artery and vein (n = 8). The animals underwent laparotomy. Sham group animals remained anesthetized for 60 minutes without blood flow obstruction of their renal vessels. The group animals underwent arterial clamping have had his left renal artery clamped for 60 minutes and the animals in the group of arterial and venous clamping had their left renal vessels clamped simultaneously for the same time. After 60 minutes the animals were sutured and kept for 30 days in their own boxes being killed by anesthetic overdose after that. The kidneys were collected and kept in formaldehyde solution and subsequently processed for histological and stereological analysis. We analyzed the volume density (Vv) of the glomeruli, the number of glomeruli/mm3 (Nv) and mean glomerular volume (MGV). The Vv and Nv was reduced in the ischemic left kidney but was only significant in animals of the group of arterial and venous clamping. Even using the rat as experimental animal model, from our results we recommend the use of arterial clamping only in cases where minimum injury to the kidney is imperative.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-22Bitstream added on 2014-06-13T19:40:58Z : No. of bitstreams: 1 francischetti_i_dr_botfm.pdf: 3036523 bytes, checksum: 16d5951b642a829416e73e1b1c9c6644 (MD5) / O uso da circulação extracorpórea desencadeia uma resposta inflamatória sistêmica, que somada às reações em cadeia relacionadas à isquemia-reperfusão de coração e pulmões pode levar a lesões celulares e até falência de órgãos no pós-operatório de cirurgia cardíaca. Vários estudos foram feitos visando melhor entendimento desses processos inflamatórios associados à circulação extracorpórea. Assim, esta revisão abordará os mecanismos de isquemia-reperfusão cardiopulmonar a ativação da cascata inflamatória por esse processo e o papel dos leucócitos na fisiopatologia destas lesões. Serão consideradas as interações de proteínas imunomoduladoras na resposta leucocitária e o bloqueio das mesmas por meio de filtros biológicos, do uso de anticorpos monoclonais e do estímulo à apoptose. / The use of extracorporeal circulation starts a whole body inflammatory response that when added with a chain reactions related to heart and lung ischemia-reperfusion may cause cellular injuries and organ failures in the cardiac surgery pos-operative period. Many studies were made to achieve better comprehension of the inflammatory process that occur with use of extracorporeal circulation. So, this review discusses the ischemia- reperfusion events, their large activated inflammatory cascade as well as the leukocytes role on the pathophysiology of their associated injuries. The interactions of immunomodulatory proteins with the leukocitary response and their blockade through leukocytes filters, the monoclonal antibody use and the apoptosis stimuli will be approached too.

Orientador: Winston Bonetti Yoshida / Banca: Carlos Eli Piccinato / Banca: Marcone Lima Sobreira / Banca: Ana Terezinha Guilaumon / Banca: Valter Castelli / Resumo: O uso da circulação extracorpórea desencadeia uma resposta inflamatória sistêmica, que somada às reações em cadeia relacionadas à isquemia-reperfusão de coração e pulmões pode levar a lesões celulares e até falência de órgãos no pós-operatório de cirurgia cardíaca. Vários estudos foram feitos visando melhor entendimento desses processos inflamatórios associados à circulação extracorpórea. Assim, esta revisão abordará os mecanismos de isquemia-reperfusão cardiopulmonar a ativação da cascata inflamatória por esse processo e o papel dos leucócitos na fisiopatologia destas lesões. Serão consideradas as interações de proteínas imunomoduladoras na resposta leucocitária e o bloqueio das mesmas por meio de filtros biológicos, do uso de anticorpos monoclonais e do estímulo à apoptose. / Abstract: The use of extracorporeal circulation starts a whole body inflammatory response that when added with a chain reactions related to heart and lung ischemia-reperfusion may cause cellular injuries and organ failures in the cardiac surgery pos-operative period. Many studies were made to achieve better comprehension of the inflammatory process that occur with use of extracorporeal circulation. So, this review discusses the ischemia- reperfusion events, their large activated inflammatory cascade as well as the leukocytes role on the pathophysiology of their associated injuries. The interactions of immunomodulatory proteins with the leukocitary response and their blockade through leukocytes filters, the monoclonal antibody use and the apoptosis stimuli will be approached too. / Doutor

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Objetivo: Avaliar os efeito da ornitina &#945;-cetoglutarato (OKG) no sangue e tecido intestinal de ratos submetidos à isquemia/reperfusÃo intestinal atravÃs da determinaÃÃo das concentraÃÃes in vivo no sangue e no tecido do intestino delgado, submetido a isquemia/reperfusÃo, de glicose, G 6 PDH, piruvato, acetoacetato, lactato, 3 HBDH, glutationa, T-Bars, mieloperoxidase, CPK e LDH. MÃtodo: Sessenta ratos (Rattus norvergicus albinus, Rodentia Mammalia) foram distribuÃdos aleatoriamente em cinco grupos de 12 animais: Sham 0â (s0â), Sham 30â (s30â), Sham 60â (s60â), Isquemia (i30â), ReperfusÃo (r30â). Estes grupos foram distribuÃdos em subgrupos de acordo com o tempo e com o composto utilizado na gavagem. Todos os animais receberam gavagem de caseinato de cÃlcio ou OKG em dose Ãnica, trinta minutos antes da laparotomia exploradora (LE). Os subgrupos s0âCaCa s30âCaCa, s60âc, i30âCaCa e r30âCaCa receberam apenas caseinato, de cÃlcio. Os subgrupos s0âOKG, s30âOKG, s60âOKG, i30âOKG e r30âOKG receberam OKG na dose de 5g/kg de peso. As amostras foram colhidas em cinco momentos: imediatamente apÃs a LE; apÃs 30 minutos da LE; ApÃs 1h da LE; ApÃs 30 minutos de isquemia; ApÃs 30 minutos de reperfusÃo. A estatÃstica discritiva foi expressa atravÃs da mÃdia, erro e desvio padrÃo, acompanhando-se pelo intervalo de confianÃa da mÃdia a 95% . Para comparar os valores prà e pÃs-procedimentos nas concentraÃÃes das variÃveis estudadas foram empregados os teste âtâ de Student pareado (para variÃncia homogÃnea e heterogÃnea) e ANOVA apÃs anÃlise de normalidade atravÃs do teste Kolmogorov-Smirnov. Quando observou a nÃo normalidade aplicou-se o teste de Kruskal-Wallis. Resultados: Os resultados apontaram um aumento significativo na lactacemia (1.186 + 0,18 versus 0,794 + 0,06, p<0,01) nos animais que receberam OKG em relaÃÃo ao controle nos subgrupos isquemia trinta minutos (i30â). No tecido intestinal reperfundido (r30â) ocorreu reduÃÃo significativa da concentraÃÃo de lactato (0,107 + 0,01 versus 0,266 + 0,02, p<0,05) nos animais recipientes de OKG em relaÃÃo ao animais controle, O piruvato plasmÃtico e tecidual se mostrou significantemente reduzido (0,146 + 0,24 versus 0,156 + 0,17 e 0,094 + 0,02 versus 0,248 + 0,03, p<0,05) apÃs o perÃodo de reperfusÃo de trinta minutos nos animais recipientes da OKG em relaÃÃo aos animais controle. Houve reduÃÃo significativa da concentraÃÃo do acetoacetato no tecido intestinal nos tempos pÃs isquemia e pÃs reperfusÃo dos animais recipientes da OKG (0,57 + 0,01 versus 0,0685 + 0,01 e 0,128 + 0,04 versus 0,156 + 0,03,*p<0,05) quando comparados ao animais nÃo tratados. A glicose 6 PDH apresentou reduÃÃo significativa da sua concentraÃÃo plasmÃtica no tempo isquemia trinta minutos dos animais recipientes da OKG em relaÃÃo aos nÃo tratados ( 0,1442 + 0,048 versus 1,1098 + 0,0796, *p<0,05) , ocorrendo o mesmo na concentraÃÃo tecidual, no pÃs isquemia (0,1002 + 0,02 versus 0,147 + 0,0264, p<0,05). A LDH apresentou elevaÃÃo significativa da sua concentraÃÃo nos animais recipientes da OKG em relaÃÃo ao controle (278,01 + 51,52 versus 132,93 + 12,54, *p<0,05) no grupo isquemia (i30â) . Ocorreu reduÃÃo significativa da CPK no grupo reperfusÃo (r30â) dos animais recipientes da OKG em comparaÃÃo aos animais controle (115,13 + 11,77 versus 166,70+6,23,p<0,05). A glutationa tecidual apresentou elevaÃÃo significativa no sham OKG 30 minutos em relaÃÃo ao nimais controle (59,17 + 2,39 versus 25,09 + 1.53, p<0,05) e reduÃÃo significante no tempo isquemia, tanto nos animais OKG quanto CaCa. Durante o perÃodo de reperfusÃo a glutationa nÃo apresentou alteraÃÃes significativas entre os animais tratados e controle. A OKG influenciou de maneira significativa na reduÃÃo da concentraÃÃo da 3HDBH tecidual no tempo i30â (0,062 + 0,01 versus 0,075 + 0,02,p<0,01) Esta diferenÃa significativa foi mantida no sangue dos animais tratados no grupo reperfusÃo 30âOKG em relaÃÃo aos animais r30âCaCa (0,03 + 0,00 versus 0,0615 + 0,01, p<0,01). A T-bars tecidual apresentou reduÃÃo significante no grupo r30âOKG em comparaÃÃo ao r30âCaCa (0,0522 + 0,03 versus 0,0745 + 0,02, p<0,05), com elevaÃÃo significativa no grupo sham 60âCaCa em relaÃÃo aos animais tratados 0,0937 + 0,02 versus 0,020 + 0,01, p<0,01). A oferta exÃgena da alfa-cetoglutarato nÃo ocasionou nenhuma alteraÃÃo significante nas concentraÃÃes de glicose e mieloperoxidase (MPO) entre os animais do subgrupo experimento quando comparados aos do subgrupo controle. ConclusÃes: Os procedimentos realizados foram suficientes para desencadear alteraÃÃes significativas em alguns metabÃlitos estudados. O modelo de isquemia-reperfusÃo demonstrou efetividade. A oferta exÃgena OKG, em dose Ãnica por gavagem, sugere aumento na atividade prÃ-glicolÃticas aerÃbica a nÃvel tecidual e sistÃmico; proteÃÃo contra lesÃo celular do tecido intestinal, e efeito antioxidante tecidual e sistÃmico durante a lesÃo de isquemia e apÃs a lesÃo de reperfusÃo / Objective: To evaluate the effect of ornithine alpha-ketoglutarate (OKG) in the blood and intestinal tissue of rats submitted to intestinal ischemia/reperfusion, using the blood concentrations of glucose, G6PDH, pyruvate, acetoacetate, lactate, 3HBDH, glutathione, T-Bars, myeloperoxydase, CPK and LHD, evaluated in vivo on these tissues. Methods: Sixty rats (Rattus norvergicus albinus, Rodentia Mammalia) were selected and aleatorily distributed in five groups of twelve animals, which were: Sham0â(s0â), Sham30â(s30â), Sham60â(s60â), Isquemia(i30â), ReperfusÃo(r30â). These groups were distributed in subgroups according to the time and the compost used to the âgavagemâ. All de animals received the âgavagemâ with calcium caseinate or okg, only one dosage, thirty minutes before the exploratory laparotomy (EL). The subgroups s0âCa, s30âCa, s60âCa, i30âCa and r30âCa received only calcium caseinate. The subgroups s0âokg, s30âokg, s60âokg, i30âokg and r30âokg received 5g of okg par each kilogram. The samples were taken in five moments: immediately passed the EL; passed 30 minutes of the EL; passed 60 minutes of the EL; passed 30 minutes of the isquemia; passed 30 minutes of the reperfusion. The descriptive statistics were media, error and standard deviation. The values before and after the procedures were compared using the âtâ test (âStudent pareadoâ to homogeny and heterogeny variation) and ANOVA. Then, it was used Kolmogorov-Smirnov to compare the normal results. The results were not normal, it was used the Kruskal-Wallis test. Results: It was shown an improvement on the blood lactate(1.186 + 0,18 versus 0,794 + 0,06, p<0,01) to the animals that received okg from i30â. A reduction on blood lactate lactato (0,107 + 0,01 versus 0,266 + 0,02, p<0,05) was noticed in the group r30â that received okg. It occurred a reduction on plasmatic and tissue pyruvate reduzido (0,146 + 0,24 versus 0,156 + 0,17 and 0,094 + 0,02 versus 0,248 + 0,03, p<0,05) to the group r30â that received okg. The acetoacetate was reduced to both groups, isquemia and reperfusion, that received okg0,57 + 0,01 versus 0,0685 + 0,01 e 0,128 + 0,04 versus 0,156 + 0,03,*p<0,05). The plasmatic glucose was reduced to the group i30â( 0,1442 + 0,048 versus 1,1098 + 0,0796, *p<0,05) treated with okg and the same happened to the tissue glucose after isquemia (0,1002 + 0,02 versus 0,147 + 0,0264, p<0,05). The LDH had an improvement (0,1002 + 0,02 versus 0,147 + 0,0264, p<0,05) to the group i30â treated with okg. CPK was reduced (115,13 + 11,77 versus 166,70+6,23,p<0,05) to the group r30â treated with okg. The tissue glutathione had an improvement to sham okg 30â (59,17 + 2,39 versus 25,09 + 1.53, p<0,05) and a reduction on isquemia period to the animals treated with okg and CaCa . 3HBDH was reduced (0,062 + 0,01 versus 0,075 + 0,02,p<0,01) in the blood and in the tissues from i30â. This difference was kept to animalsâ blood from r30âokg when related to r30âCaCa(0,03 + 0,00 versus 0,0615 + 0,01, p<0,01). There was a reduction on tissue T-BARS to r30âOKG when compared to r30âCaCa(0,0522 + 0,03 versus 0,0745 + 0,02, p<0,05) and an improvement to sham60âCaCa(0,0937 + 0,02 versus 0,020 + 0,01, p<0,01). Glicose and Myeloperoxydase were not affected by the use of okg. All the results were compared to the respective control groups. Conclusion: The used procedures could bring useful results to metabolites in study. The isquemia/reperfusion showed efficiency, offering exogen okg leads to a rising on glicolitic and aerobic activity to tissues and systems. This offer protects yet from the tissue injury and has antioxidant effect during the isquemia/reperfusion injury.

Activation of sympathetic nervous system is a key component of myocardial remodeling that generally occurs following ischemia/reperfusion (I/R) injury and myocardial infarction. It induces cardiac myocyte apoptosis and myocardial fibrosis, leading to myocardial dysfunction. Intracellular ubiquitin (UB) regulates protein turnover by the UB-proteosome pathway. The biological functions of extracellular UB in the heart remain largely unexplored. Previously, our lab has shown that β-adrenergic receptor (β-AR) stimulation increases extracellular UB levels, and extracellular UB inhibits β-AR-stimulated apoptosis in adult rat ventricular myocytes (ARVMs). This study explores the role of extracellular UB in myocyte apoptosis, fibroblast phenotype and function, and myocardial remodeling following β-AR stimulation and I/R injury. First, left ventricular (LV) structural and functional remodeling was studied 7 days after chronic β-AR-stimulation in the presence or absence of UB infusion. Echocardiographic analyses showed UB infusion decreases β-AR-stimulated increases in percent fractional shortening and ejection fraction. It decreased cardiac myocyte apoptosis and myocardial fibrosis. UB activated Akt, and inhibition of Akt inhibited β-AR-stimulated increases in matrix metalloproteinase-2 expression. Second, using cardiac fibroblasts, we provide evidence that extracellular UB interacts with the cell surface and co-immunoprecipitates with CXCR4. UB treatment increased expression of α-smooth muscle actin (myofibroblast marker), and induced rearrangement of actin into stress fibers. It inhibited lamellopodia and filopodia formation, and cell migration into the wound. Third, using isolated mouse heart and I/R injury as a model, we provide evidence that UB treatment decreases I/R-mediated increases in infarct size. UB treatment improved functional recovery of the heart as measured by increased % LV developed pressure. Activation of proapoptotic proteins, p-STAT-1 and caspase-9, was significantly lower in UB I/R hearts versus I/R alone. In ARVMs, UB treatment decreased simulated I/R-induced apoptosis. It activated Akt (anti-apoptotic kinase) and inhibited activation of GSK-3β (pro-apoptotic kinase). It decreased I/R-induced oxidative stress and protected anoxia-induced mitochondrial polarization. In fibroblast and ARVMs, CXCR4 antagonism negated the effects of UB, while mutated UBs (unable to interact with CXCR4) had no effect. Thus, extracellular UB, most likely acting via CXCR4, modulates myocardial remodeling with effects on heart function, fibroblast phenotype and function and myocyte apoptosis.

β-Adrenergic receptor (β-AR) stimulation increases extracellular levels of ubiquitin (UB) in myocytes, and exogenous UB decreases β-AR-stimulated myocyte apoptosis and myocardial fibrosis. Here, we hypothesized that exogenous UB modulates the inflammatory response, thereby playing a protective role in cardiac remodeling after ischemia-reperfusion (I/R) injury. C57BL/6 mice infused with vehicle or UB (1 μg·g−1·h−1) were subjected to myocardial I/R injury. Functional and biochemical parameters of the heart were examined 3 days post-I/R. Heart weight-to-body weight ratios were similarly increased in I/R and UB + I/R groups. The area at risk and infarct size were significantly lower in UB + I/R versus I/R groups. Measurement of heart function using echocardiography revealed that I/R decreases percent fractional shortening and percent ejection fraction. However, the decrease in fractional shortening and ejection fraction was significantly lower in the UB + I/R group. The UB + I/R group displayed a significant decrease in inflammatory infiltrates, neutrophils, and macrophages versus the I/R group. Neutrophil activity was significantly lower in the UB + I/R group. Analysis of the concentration of a panel of 23 cytokines/chemokines in the serum using a Bio-Plex assay revealed a significantly lower concentration of IL-12 subunit p40 in the UB + I/R versus I/R group. The concentration of monocyte chemotactic protein-1 was lower, whereas the concentration of macrophage inflammatory protein-1α was significantly higher, in the UB+I/R group versus the sham group. Expression of matrix metalloproteinase (MMP)-2 and activity of MMP-9 were higher in the UB + I/R group versus the I/R group. Levels of ubiquitinated proteins and tissue inhibitor of metalloproteinase 2 expression were increased to a similar extent in both I/R groups. Thus, exogenous UB plays a protective role in myocardial remodeling post-I/R with effects on cardiac function, area at risk/infarct size, the inflammatory response, levels of serum cytokines/chemokines, and MMP expression and activity.