Ornitina decarboxilase (ODC) (EC 4.1.1.17) é a primeira enzima que desencadeia a síntese das poliaminas putrescina, espermidina e espermina nas células. As poliaminas são cátions alifáticos envolvidos no controle de crescimento e são requeridas para uma variedade de eventos biológicos como síntese de proteína, replicação do DNA e divisão celular. No presente estudo, a atividade da ODC foi medida em ovo, larva, pupa, fêmea jovem e adulta de Anastrepha fraterculus. Durante o desenvolvimento de A. fraterculus, a atividade da ODC apresentou flutuações. Entre os estágios anteriores à emergência, o ovo teve a mais alta atividade específica, provavelmente devido à embriogênese que é caracterizada pela alta taxa de divisão celular. A atividade da ODC foi também altamente significativa em ovários e corpo gorduroso de fêmeas jovens possivelmente devido ao avanço da oogênese e vitelogênese. Parâmetros cinéticos (Km app e Vmax) para atividade da ODC foram determinados em pupa, larva e ovário de fêmeas jovens e apresentaram grande variação. A guanosina trifosfato (GTP) demonstrou afetar grandemente estes parâmetros cinéticos, sugerindo estarem ocorrendo modificações pós-traducionais. Fêmeas jovens (4 dias) de A. fraterculus também foram analisadas quanto ao efeito do estresse de temperatura (6ºC e 20/6ºC) e da aplicação tópica do hormônio juvenil isolados ou em conjunto. . Os principais resultados foram que a concentração de 500 ng e os tempos de incubação de 3, 7 e 18 horas aumentaram a atividade da ODC. As fêmeas mantidas a 6ºC e 20/6ºC tiveram atividade da ODC mais alta do que as fêmeas mantidas a 25ºC. O tempo de incubação de 1 hora com o HJ aumentou a atividade da ODC no tratamento de 6ºC, quando comparado com fêmeas mantidas apenas com o estresse de temperatura sem a adição do hormônio (controle). No entanto, no tratamento das fêmeas mantidas a 20/6ºC, somente os tempos de 3 e 18 horas de incubação com o HJ demonstraram aumento na atividade da ODC quando comparadas com o tempo de incubação de 1 hora e com as fêmeas mantidas sem a adição do hormônio (controle). Os machos não apresentaram diferença na atividade da ODC quando submetidos ao estresse de temperatura de 6ºC, mas as medidas do apódema ejaculatório foram maiores a 25ºC que a 6ºC. Estes resultados podem ser considerados como parte de um processo adaptativo a mudanças ambientais. Por último, observamos que as medidas dos ovários (comprimento e largura) de fêmeas jovens mantidas com o inibidor da ODC, -difluormetilornitina (-DFMO; 50mM) são diferentes significativamente quando comparadas com às medidas das fêmeas controle sem o inibidor. O conjunto desses resultados indica a importância da relação entre ODC, HJ e estresse de temperatura para a A. fraterculus. Como esta mosca é uma das piores pragas para a fruticultura brasileira, estes dados, além de contribuírem para um maior conhecimento de sua biologia básica, poderão também ser usados para a escolha de melhores estratégias de controle populacional.

Ornitina decarboxilase (ODC) (EC 4.1.1.17) é a primeira enzima que desencadeia a síntese das poliaminas putrescina, espermidina e espermina nas células. As poliaminas são cátions alifáticos envolvidos no controle de crescimento e são requeridas para uma variedade de eventos biológicos como síntese de proteína, replicação do DNA e divisão celular. No presente estudo, a atividade da ODC foi medida em ovo, larva, pupa, fêmea jovem e adulta de Anastrepha fraterculus. Durante o desenvolvimento de A. fraterculus, a atividade da ODC apresentou flutuações. Entre os estágios anteriores à emergência, o ovo teve a mais alta atividade específica, provavelmente devido à embriogênese que é caracterizada pela alta taxa de divisão celular. A atividade da ODC foi também altamente significativa em ovários e corpo gorduroso de fêmeas jovens possivelmente devido ao avanço da oogênese e vitelogênese. Parâmetros cinéticos (Km app e Vmax) para atividade da ODC foram determinados em pupa, larva e ovário de fêmeas jovens e apresentaram grande variação. A guanosina trifosfato (GTP) demonstrou afetar grandemente estes parâmetros cinéticos, sugerindo estarem ocorrendo modificações pós-traducionais. Fêmeas jovens (4 dias) de A. fraterculus também foram analisadas quanto ao efeito do estresse de temperatura (6ºC e 20/6ºC) e da aplicação tópica do hormônio juvenil isolados ou em conjunto. . Os principais resultados foram que a concentração de 500 ng e os tempos de incubação de 3, 7 e 18 horas aumentaram a atividade da ODC. As fêmeas mantidas a 6ºC e 20/6ºC tiveram atividade da ODC mais alta do que as fêmeas mantidas a 25ºC. O tempo de incubação de 1 hora com o HJ aumentou a atividade da ODC no tratamento de 6ºC, quando comparado com fêmeas mantidas apenas com o estresse de temperatura sem a adição do hormônio (controle). No entanto, no tratamento das fêmeas mantidas a 20/6ºC, somente os tempos de 3 e 18 horas de incubação com o HJ demonstraram aumento na atividade da ODC quando comparadas com o tempo de incubação de 1 hora e com as fêmeas mantidas sem a adição do hormônio (controle). Os machos não apresentaram diferença na atividade da ODC quando submetidos ao estresse de temperatura de 6ºC, mas as medidas do apódema ejaculatório foram maiores a 25ºC que a 6ºC. Estes resultados podem ser considerados como parte de um processo adaptativo a mudanças ambientais. Por último, observamos que as medidas dos ovários (comprimento e largura) de fêmeas jovens mantidas com o inibidor da ODC, -difluormetilornitina (-DFMO; 50mM) são diferentes significativamente quando comparadas com às medidas das fêmeas controle sem o inibidor. O conjunto desses resultados indica a importância da relação entre ODC, HJ e estresse de temperatura para a A. fraterculus. Como esta mosca é uma das piores pragas para a fruticultura brasileira, estes dados, além de contribuírem para um maior conhecimento de sua biologia básica, poderão também ser usados para a escolha de melhores estratégias de controle populacional.

Ornitina decarboxilase (ODC) (EC 4.1.1.17) é a primeira enzima que desencadeia a síntese das poliaminas putrescina, espermidina e espermina nas células. As poliaminas são cátions alifáticos envolvidos no controle de crescimento e são requeridas para uma variedade de eventos biológicos como síntese de proteína, replicação do DNA e divisão celular. No presente estudo, a atividade da ODC foi medida em ovo, larva, pupa, fêmea jovem e adulta de Anastrepha fraterculus. Durante o desenvolvimento de A. fraterculus, a atividade da ODC apresentou flutuações. Entre os estágios anteriores à emergência, o ovo teve a mais alta atividade específica, provavelmente devido à embriogênese que é caracterizada pela alta taxa de divisão celular. A atividade da ODC foi também altamente significativa em ovários e corpo gorduroso de fêmeas jovens possivelmente devido ao avanço da oogênese e vitelogênese. Parâmetros cinéticos (Km app e Vmax) para atividade da ODC foram determinados em pupa, larva e ovário de fêmeas jovens e apresentaram grande variação. A guanosina trifosfato (GTP) demonstrou afetar grandemente estes parâmetros cinéticos, sugerindo estarem ocorrendo modificações pós-traducionais. Fêmeas jovens (4 dias) de A. fraterculus também foram analisadas quanto ao efeito do estresse de temperatura (6ºC e 20/6ºC) e da aplicação tópica do hormônio juvenil isolados ou em conjunto. . Os principais resultados foram que a concentração de 500 ng e os tempos de incubação de 3, 7 e 18 horas aumentaram a atividade da ODC. As fêmeas mantidas a 6ºC e 20/6ºC tiveram atividade da ODC mais alta do que as fêmeas mantidas a 25ºC. O tempo de incubação de 1 hora com o HJ aumentou a atividade da ODC no tratamento de 6ºC, quando comparado com fêmeas mantidas apenas com o estresse de temperatura sem a adição do hormônio (controle). No entanto, no tratamento das fêmeas mantidas a 20/6ºC, somente os tempos de 3 e 18 horas de incubação com o HJ demonstraram aumento na atividade da ODC quando comparadas com o tempo de incubação de 1 hora e com as fêmeas mantidas sem a adição do hormônio (controle). Os machos não apresentaram diferença na atividade da ODC quando submetidos ao estresse de temperatura de 6ºC, mas as medidas do apódema ejaculatório foram maiores a 25ºC que a 6ºC. Estes resultados podem ser considerados como parte de um processo adaptativo a mudanças ambientais. Por último, observamos que as medidas dos ovários (comprimento e largura) de fêmeas jovens mantidas com o inibidor da ODC, -difluormetilornitina (-DFMO; 50mM) são diferentes significativamente quando comparadas com às medidas das fêmeas controle sem o inibidor. O conjunto desses resultados indica a importância da relação entre ODC, HJ e estresse de temperatura para a A. fraterculus. Como esta mosca é uma das piores pragas para a fruticultura brasileira, estes dados, além de contribuírem para um maior conhecimento de sua biologia básica, poderão também ser usados para a escolha de melhores estratégias de controle populacional.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Investigar os efeitos da ornitina &#945;-cetoglutarato (OKG) no sangue e mÃsculo gastrocnÃmio de ratos submetidos à isquemia-reperfusÃo do membro pÃlvico. MÃtodo - Quarenta e dois ratos foram distribuÃdos aleatoriamente em trÃs grupos: Sham (S), Isquemia (I) e Isquemia-reperfusÃo (R). Estes grupos foram distribuÃdos em subgrupos de acordo com o tempo e com o composto utilizado na gavagem. Todos os animais receberam gavagem de caseinato de cÃlcio ou OKG em dose Ãnica, noventa minutos antes da primeira laparotomia exploradora (LE). Os subgrupos S receberam apenas caseinato, os subgrupos I e R receberam caseinato ou OKG na mesma dose, de 5g/kg de peso. As amostras foram colhidas em trÃs momentos: imediatamente apÃs a LE; apÃs 6h da LE com isquemia (6h de isquemia) e sem isquemia e apÃs 6,5h da LE com isquemia-reperfusÃo (0,5h de reperfusÃo) e sem isquemia-reperfusÃo. Para anÃlise dos resultados foram utilizados: mÃdia, desvio padrÃo e teste de normalidade de Korogorov-Smirnov. Caso os resultados fossem normalizÃveis, aplicou-se o teste ANOVA para avaliaÃÃo de diferenÃa significante, no caso dos resultados nÃo serem normalizÃveis utilizou-se o teste de Kurskal-Wallis com o mesmo fim. Em todos os testes fixou-se em 0,05 ou 5%, a significÃncia estatÃstica. Resultados - No grupo S, nos metabÃlitos plasmÃticos, apÃs 6h e 6,5h da LE, quando comparados ao momento da LE (0h), houve aumento de: CPK 6h [141,83  47,88 versus 67,17  21,58 â p<0,004], CPK 6,5h [180,67  70,19 versus 67,17  21,58 â p<0,001]; LDH 6h [248,96  80,62 versus 74,40  33,84 â p<0,001]. Nos metabÃlitos musculares houve aumento de: lactato 6,5h [ 3,52  1,27 versus 1,57  0,76 â p<0,008]. Houve reduÃÃo de: piruvato 6h [0,035  0,024 versus 0,087  0,041 â p<0,004]. No grupo I foram observadas, para o subgrupo submetido à isquemia + caseinato em relaÃÃo ao sham, no plasma, elevaÃÃes em: CPK [635,17  231,71 versus 141,83  47,88 â p<0,001], LDH [551,16  142,63 versus 248,96  80,62 â p<0,002], piruvato [0,390  0,069 versus 0,061  0,045 â p<0,001]. No mÃsculo houve elevaÃÃo de: piruvato [0,127  0,044 versus 0,035  0,024 â p<0,002], lactato [8,158  0,717 versus 2,737  0,499 â p<0,001] e TBARS [0,012  0,004 versus 0,002  0,001 â p<0,001. Neste mesmo grupo comparando-se o subgrupo isquemia + OKG ao subgrupo sham encontrou-se, no plasma, elevaÃÃo em: CPK [868,17  308,30 versus 141,83  47,88 â p<0,001], glutationa [19,545  2,088 versus 6,432  1,062 â p<0,001] e no mÃsculo elevaÃÃo da glutationa [101,85  16,45 versus 14,73  0,87 p<0,001]. Ainda no grupo I, foi observado, para o subgrupo isquemia + OKG versus isquemia + caseinato, no plasma, queda em: LDH [296,26  93,62 versus 551,16  142,62 â p<0,004], glicose [104,16  20,81 versus 160,33  27,47 â p<0,001], piruvato [0,046  0,012 versus 0,390  0,069 â p<0,001], e elevaÃÃo de glutationa [19,54  2,08 versus 5,52  0,92 â p<0,001]. No mÃsculo foi evidenciada diminuiÃÃo do piruvato [0,047  0,031 versus 0,127  0,045 â p<0,004], lactato [2,47  0,74 versus 8,15  0,71 â p<0,001], TBARS [0,004  0,004 versus 0,012  0,004 â p<0,013] e elevaÃÃo glutationa [101,85  16,45 versus 14,44  2,09 â p<0,001]. No grupo R. foi observada, quando comparado o subgrupo reperfusÃo + caseinato ao Sham, no plasma, elevaÃÃo de: CPK [606,33  79,84 versus 180,66  70,19 â p<0,001], No mÃsculo elevaÃÃo do piruvato [0,065  0,027 versus 0,030  0,033 â p<0,047] e lactato [7,16  2,33 versus 3,52  1,27 â p<0,013] alÃm de queda na G6PDH [0,462Â0,22 versus 0,207Â0,22 p<0,04] . No grupo R quando comparado o subgrupo reperfusÃo + OKG ao subgrupo Sham, no plasma, foi evidenciado aumento em: CPK [558,00  102,83 versus 180,66  70,19 â p<0,001] e glicose [232,16  59,76 versus 118,16  24,22 â p<0,001]. No mÃsculo houve diminuiÃÃo de G6PDH [0,182Â0,22 versus 0,462Â0,22]. Ainda no grupo R quando comparado o subgrupo reperfusÃo + OKG ao reperfusÃo + caseinato, no plasma, houve elevaÃÃo da glicose [232,16  59,76 versus 158,00  24,20 â p<0,013]. No mÃsculo foi notada queda no lactato [3,63  1,16 versus 7,16  2,33 â p<0,008] e elevaÃÃo da glutationa [63,18  18,98 versus 16,17  1,96 â p<0,001]. ConclusÃes - O trauma cirÃrgico desencadeou alteraÃÃes significativas em alguns metabÃlitos estudados. O modelo de isquemia-reperfusÃo demonstrou efetividade. A OKG, em dose Ãnica por gavagem, demonstrou aÃÃes prÃ-glicolÃticas aerÃbica a nÃvel muscular e sistÃmico; proteÃÃo contra lesÃo da cÃlula muscular, e efeito antioxidante muscular e sistÃmico durante a lesÃo de isquemia quanto apÃs lesÃo de isquemia/reperfusÃo. / To investigate the effects of the ornitine &#945;-ketoglutarate (OKG) upon metabolites in vivo concentrations in whole blood and gastrocnemic muscle tissue of rats submitted to ischemia-reperfusion of the pelvic limb. Methods - Forty two rats were randomly distributed into three groups: Sham (S), Ischemia (I) and Ischemia-reperfusion (R). These groups were redistributed into subgroups, according to time and to the substance used in the gavage. All animals received via gavage calcium caseinate or OKG as a single dose, ninety minutes before the first laparotomy (L). The subgroup S received only caseinate, whereas subgroups I and R received caseinate or OKG, at the same dose of 5g/kg body weight. Samples were collected at three moments: immediately after L; after 6h with ischemia (ischemia of 6h) or without ischemia; and after 6,5h of L with ischemia-reperfusion (reperfusion of 0,5h) or without ischemia-reperfusion. Data expressed as: mean  standard deviation, normality test of Korogorov-Smirnov. In case of the results went normalized, the test ANOVA was applied for evaluation significant difference, in case of the results was not normalized, the test of Kurskal-Wallis was used. Significant variations were considered when p <0,05.Results - In S group, at the plasmatic samples, after six hours (6h) or six hours and thirty minutes (6,5h) of L, when compared versus at the moment of L (0h), there was increase of: CPK 6h [141,83  47,88 versus 67,17  21,58 - p <0,004], CPK 6,5h [180,67  70,19 versus 67,17  21,58 - p <0,001]; LDH 6h [248,96  80,62 versus 74,40  33,84 - p <0,001]. In muscular samples there was increase of: lactate 6,5h [3,52  1,27 versus 1,57  0,76 - p <0,008]; there were reductions of: pyruvate 6h [0,035  0,024 versus 0,087  0,041 - p <0,004]. In group I it was observed, for the subgroup submitted to ischemia + caseinate in relation to sham, in plasma, elevations of: CPK [635,17  231,71 versus 141,83  47,88 - p <0,001], DHL [551,16  142,63 versus 248,96  80,62 - p <0,002], pyruvate [0,390  0,069 versus 0,061  0,045 - p <0,001]. In muscle there were elevations of: pyruvate [0,127  0,044 versus 0,035  0,024 - p <0,002], lactate [8,15  0,71 versus 2,73  0,49 - p <0,001] and TBARS [0,012  0,004 versus 0,002  0,001 - p <0,001]. In this same group when comparing subgroup ischemia + OKG versus subgroup sham there were, in the plasma, elevations of: CPK [868,17  308,30 versus 141,83  47,88 - p <0,001], glutathione [19,54  2,08 versus 6,43  1,06 - p <0,001]. In muscle there was elevation of glutathione [101,851  16,457 versus 14,737  0,874 p <0,001]. Still in the I group, it was observed, when subgroup ischemia + OKG was compared to ischemia + caseinate, in the plasma, a decrease of: LDH [296,26  93,62 versus 551,16  142,62 - p <0,004], glucose [104,16  20,81 versus 160,33  27,47 - p <0,001], pyruvate [0,046  0,012 versus 0,390  0,069 - p <0,001] and an elevation of glutathione [19,54  2,08 versus 5,52  0,92 - p <0,001]. In muscle there were decreases of pyruvate [0,047  0,031 versus 0,127  0,045 - p <0,004], lactate [2,47  0,74 versus 8,15  0,71 - p <0,001], TBARS [0,004  0,004 versus 0,012  0,004 - p <0,013]. It was observed elevation of glutathione [101,85  16,45 versus 14,44  2,09 - p <0,001]. In R group, it was observed, when comparing subgroup reperfusion + caseinate versus sham at the plasma, elevations of: CPK [606,33  79,84 versus 180,66  70,19 - p <0,001]. In muscle it was observed elevations of lactate [7,16  2,33 versus 3,52  1,27 - p <0,013] and decrease of G6PDH [0,462Â0,22 versus 0,207Â0,22 p<0,04]. In R group, when comparing subgroup reperfusion + OKG to subgroup sham, at the plasma, it was evidenced increase of: CPK [558,00  102,83 versus 180,66  70,19 - p <0,001], glucose [232,16  59,76 versus 118,16  24,22 - p <0,001]. In muscle there was observed decrease of G6PDH [0,182Â0,22 versus 0,462Â0,22]. Still in the group R when comparing the subgroup reperfusion + OKG versus the subgroup reperfusion + caseinate, at the plasma, there were elevations of glucose [232,16  59,76 versus 158,00  24,20 - p <0,013]. In muscle it was noticed a decrease of lactate [3,63  1,16 versus 7,16  2,33 - p <0,008] and elevation of glutathione [63,18  18,98 versus 16,17  1,96 - p <0,001]. Conclusions - Surgical trauma promoted significant alterations in some studied samples. The ischemia-reperfusion model demonstrated to be effective. OKG, as a single dose for gavage demonstrated pro glycolytic aerobic effect. Muscular and systemic protection against muscle cell lesion was also observed as well as an antioxidant effect at the end of ischemia and after ischemia-reperfusion injury

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Objetivo: Avaliar os efeito da ornitina &#945;-cetoglutarato (OKG) no sangue e tecido intestinal de ratos submetidos à isquemia/reperfusÃo intestinal atravÃs da determinaÃÃo das concentraÃÃes in vivo no sangue e no tecido do intestino delgado, submetido a isquemia/reperfusÃo, de glicose, G 6 PDH, piruvato, acetoacetato, lactato, 3 HBDH, glutationa, T-Bars, mieloperoxidase, CPK e LDH. MÃtodo: Sessenta ratos (Rattus norvergicus albinus, Rodentia Mammalia) foram distribuÃdos aleatoriamente em cinco grupos de 12 animais: Sham 0â (s0â), Sham 30â (s30â), Sham 60â (s60â), Isquemia (i30â), ReperfusÃo (r30â). Estes grupos foram distribuÃdos em subgrupos de acordo com o tempo e com o composto utilizado na gavagem. Todos os animais receberam gavagem de caseinato de cÃlcio ou OKG em dose Ãnica, trinta minutos antes da laparotomia exploradora (LE). Os subgrupos s0âCaCa s30âCaCa, s60âc, i30âCaCa e r30âCaCa receberam apenas caseinato, de cÃlcio. Os subgrupos s0âOKG, s30âOKG, s60âOKG, i30âOKG e r30âOKG receberam OKG na dose de 5g/kg de peso. As amostras foram colhidas em cinco momentos: imediatamente apÃs a LE; apÃs 30 minutos da LE; ApÃs 1h da LE; ApÃs 30 minutos de isquemia; ApÃs 30 minutos de reperfusÃo. A estatÃstica discritiva foi expressa atravÃs da mÃdia, erro e desvio padrÃo, acompanhando-se pelo intervalo de confianÃa da mÃdia a 95% . Para comparar os valores prà e pÃs-procedimentos nas concentraÃÃes das variÃveis estudadas foram empregados os teste âtâ de Student pareado (para variÃncia homogÃnea e heterogÃnea) e ANOVA apÃs anÃlise de normalidade atravÃs do teste Kolmogorov-Smirnov. Quando observou a nÃo normalidade aplicou-se o teste de Kruskal-Wallis. Resultados: Os resultados apontaram um aumento significativo na lactacemia (1.186 + 0,18 versus 0,794 + 0,06, p<0,01) nos animais que receberam OKG em relaÃÃo ao controle nos subgrupos isquemia trinta minutos (i30â). No tecido intestinal reperfundido (r30â) ocorreu reduÃÃo significativa da concentraÃÃo de lactato (0,107 + 0,01 versus 0,266 + 0,02, p<0,05) nos animais recipientes de OKG em relaÃÃo ao animais controle, O piruvato plasmÃtico e tecidual se mostrou significantemente reduzido (0,146 + 0,24 versus 0,156 + 0,17 e 0,094 + 0,02 versus 0,248 + 0,03, p<0,05) apÃs o perÃodo de reperfusÃo de trinta minutos nos animais recipientes da OKG em relaÃÃo aos animais controle. Houve reduÃÃo significativa da concentraÃÃo do acetoacetato no tecido intestinal nos tempos pÃs isquemia e pÃs reperfusÃo dos animais recipientes da OKG (0,57 + 0,01 versus 0,0685 + 0,01 e 0,128 + 0,04 versus 0,156 + 0,03,*p<0,05) quando comparados ao animais nÃo tratados. A glicose 6 PDH apresentou reduÃÃo significativa da sua concentraÃÃo plasmÃtica no tempo isquemia trinta minutos dos animais recipientes da OKG em relaÃÃo aos nÃo tratados ( 0,1442 + 0,048 versus 1,1098 + 0,0796, *p<0,05) , ocorrendo o mesmo na concentraÃÃo tecidual, no pÃs isquemia (0,1002 + 0,02 versus 0,147 + 0,0264, p<0,05). A LDH apresentou elevaÃÃo significativa da sua concentraÃÃo nos animais recipientes da OKG em relaÃÃo ao controle (278,01 + 51,52 versus 132,93 + 12,54, *p<0,05) no grupo isquemia (i30â) . Ocorreu reduÃÃo significativa da CPK no grupo reperfusÃo (r30â) dos animais recipientes da OKG em comparaÃÃo aos animais controle (115,13 + 11,77 versus 166,70+6,23,p<0,05). A glutationa tecidual apresentou elevaÃÃo significativa no sham OKG 30 minutos em relaÃÃo ao nimais controle (59,17 + 2,39 versus 25,09 + 1.53, p<0,05) e reduÃÃo significante no tempo isquemia, tanto nos animais OKG quanto CaCa. Durante o perÃodo de reperfusÃo a glutationa nÃo apresentou alteraÃÃes significativas entre os animais tratados e controle. A OKG influenciou de maneira significativa na reduÃÃo da concentraÃÃo da 3HDBH tecidual no tempo i30â (0,062 + 0,01 versus 0,075 + 0,02,p<0,01) Esta diferenÃa significativa foi mantida no sangue dos animais tratados no grupo reperfusÃo 30âOKG em relaÃÃo aos animais r30âCaCa (0,03 + 0,00 versus 0,0615 + 0,01, p<0,01). A T-bars tecidual apresentou reduÃÃo significante no grupo r30âOKG em comparaÃÃo ao r30âCaCa (0,0522 + 0,03 versus 0,0745 + 0,02, p<0,05), com elevaÃÃo significativa no grupo sham 60âCaCa em relaÃÃo aos animais tratados 0,0937 + 0,02 versus 0,020 + 0,01, p<0,01). A oferta exÃgena da alfa-cetoglutarato nÃo ocasionou nenhuma alteraÃÃo significante nas concentraÃÃes de glicose e mieloperoxidase (MPO) entre os animais do subgrupo experimento quando comparados aos do subgrupo controle. ConclusÃes: Os procedimentos realizados foram suficientes para desencadear alteraÃÃes significativas em alguns metabÃlitos estudados. O modelo de isquemia-reperfusÃo demonstrou efetividade. A oferta exÃgena OKG, em dose Ãnica por gavagem, sugere aumento na atividade prÃ-glicolÃticas aerÃbica a nÃvel tecidual e sistÃmico; proteÃÃo contra lesÃo celular do tecido intestinal, e efeito antioxidante tecidual e sistÃmico durante a lesÃo de isquemia e apÃs a lesÃo de reperfusÃo / Objective: To evaluate the effect of ornithine alpha-ketoglutarate (OKG) in the blood and intestinal tissue of rats submitted to intestinal ischemia/reperfusion, using the blood concentrations of glucose, G6PDH, pyruvate, acetoacetate, lactate, 3HBDH, glutathione, T-Bars, myeloperoxydase, CPK and LHD, evaluated in vivo on these tissues. Methods: Sixty rats (Rattus norvergicus albinus, Rodentia Mammalia) were selected and aleatorily distributed in five groups of twelve animals, which were: Sham0â(s0â), Sham30â(s30â), Sham60â(s60â), Isquemia(i30â), ReperfusÃo(r30â). These groups were distributed in subgroups according to the time and the compost used to the âgavagemâ. All de animals received the âgavagemâ with calcium caseinate or okg, only one dosage, thirty minutes before the exploratory laparotomy (EL). The subgroups s0âCa, s30âCa, s60âCa, i30âCa and r30âCa received only calcium caseinate. The subgroups s0âokg, s30âokg, s60âokg, i30âokg and r30âokg received 5g of okg par each kilogram. The samples were taken in five moments: immediately passed the EL; passed 30 minutes of the EL; passed 60 minutes of the EL; passed 30 minutes of the isquemia; passed 30 minutes of the reperfusion. The descriptive statistics were media, error and standard deviation. The values before and after the procedures were compared using the âtâ test (âStudent pareadoâ to homogeny and heterogeny variation) and ANOVA. Then, it was used Kolmogorov-Smirnov to compare the normal results. The results were not normal, it was used the Kruskal-Wallis test. Results: It was shown an improvement on the blood lactate(1.186 + 0,18 versus 0,794 + 0,06, p<0,01) to the animals that received okg from i30â. A reduction on blood lactate lactato (0,107 + 0,01 versus 0,266 + 0,02, p<0,05) was noticed in the group r30â that received okg. It occurred a reduction on plasmatic and tissue pyruvate reduzido (0,146 + 0,24 versus 0,156 + 0,17 and 0,094 + 0,02 versus 0,248 + 0,03, p<0,05) to the group r30â that received okg. The acetoacetate was reduced to both groups, isquemia and reperfusion, that received okg0,57 + 0,01 versus 0,0685 + 0,01 e 0,128 + 0,04 versus 0,156 + 0,03,*p<0,05). The plasmatic glucose was reduced to the group i30â( 0,1442 + 0,048 versus 1,1098 + 0,0796, *p<0,05) treated with okg and the same happened to the tissue glucose after isquemia (0,1002 + 0,02 versus 0,147 + 0,0264, p<0,05). The LDH had an improvement (0,1002 + 0,02 versus 0,147 + 0,0264, p<0,05) to the group i30â treated with okg. CPK was reduced (115,13 + 11,77 versus 166,70+6,23,p<0,05) to the group r30â treated with okg. The tissue glutathione had an improvement to sham okg 30â (59,17 + 2,39 versus 25,09 + 1.53, p<0,05) and a reduction on isquemia period to the animals treated with okg and CaCa . 3HBDH was reduced (0,062 + 0,01 versus 0,075 + 0,02,p<0,01) in the blood and in the tissues from i30â. This difference was kept to animalsâ blood from r30âokg when related to r30âCaCa(0,03 + 0,00 versus 0,0615 + 0,01, p<0,01). There was a reduction on tissue T-BARS to r30âOKG when compared to r30âCaCa(0,0522 + 0,03 versus 0,0745 + 0,02, p<0,05) and an improvement to sham60âCaCa(0,0937 + 0,02 versus 0,020 + 0,01, p<0,01). Glicose and Myeloperoxydase were not affected by the use of okg. All the results were compared to the respective control groups. Conclusion: The used procedures could bring useful results to metabolites in study. The isquemia/reperfusion showed efficiency, offering exogen okg leads to a rising on glicolitic and aerobic activity to tissues and systems. This offer protects yet from the tissue injury and has antioxidant effect during the isquemia/reperfusion injury.

A síndrome hiperornitinemia-hiperamonemia-homocitrulinúria (HHH) é um erro inato do metabolismo do ciclo da ureia, de caráter autossômico recessivo e caracterizada por um defeito no transporte mitocondrial de ornitina (Orn), levando a um acúmulo citosólico desse aminoácido, além do acúmulo de homocitrulina (Hcit) e amônia. Os sinais e sintomas clínicos são variáveis, dentre eles podemos citar coagulopatia, coma, letargia, retardo mental, atrofia cortical e ataxia cerebelar. Embora os sintomas neurológicos sejam frequentes, a fisiopatogenia dessa doença ainda é desconhecida. Nesse trabalho investigamos os efeitos in vitro e ex vivo da Orn e Hcit sobre importantes parâmetros de homeostase redox e energética em cerebelo de ratos de 30 dias de vida. Além disso, também investigamos os efeitos desses metabólitos sobre alguns parâmetros em astrócitos cultivados de córtex cerebral. Primeiramente investigamos os efeitos in vitro da Orn e Hcit sobre importantes parâmetros de homeostase redox e energética em cerebelo de ratos jovens. Ambos metabólitos aumentaram significativamente os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS). Além disso, esses níveis foram totalmente prevenidos pela melatonina e pela glutationa reduzida (GSH). Observamos também que os níveis da produção de nitratos e nitritos não foi alterada por nenhum dos metabólitos utilizados, por outro lado, a Hcit aumentou a produção de peróxido de hidrogênio Ao investigarmos os níves de GSH observamos que tanto a Orn quanto a Hcit reduziram esse parâmetro e que a Orn reduziu o conteúdo de grupamentos sulfidrila, indicando uma dimunioção nas defeas antioxidantes não enzimáticas. Com relação ao metabolism energetic, a Orn e Hcit diminuíram a atividade da enzima aconitase, porém não alteraram outros parâmetros estudados. Além disso, a redução causada pela Orn foi prevenida pela GSH, indicando que essa enzima é suscetível a oxidação causada por exxe aminoácido. Também investigamos os efeitos ex vivo da injeção intracerebelar de Orn e Hcit sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo e sobre a ativdade da Na+, K+ ATPase. A Orn aumentou significativamente os níveis de TBA-RS e atividade da superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase, glutationa redutase e glucose 6-fosfato desidrogenase e diminuiu a ativdade da Na+,K+-ATPase. Por outro lado, as concentrações de GSH não foram alteradas pelo tratamento com ornitina. Por fim, a Hcit não foi capaz de alterar nenhum dos parâmetros avaliados. Os efeitos da Orn e Hcit foram também investigados em astrócitos cultivados a partir de córtex cerebral de ratos neonatos. Observamos que Orn e Hcit diminuíram a viabilidade celular, a função mitocondrial e os níveis de GSH, porém não alteraram a produção de citocinas. Nossos resultados demonstram um prejuízo moderado na homeostase energética, porém, quando observamos a homeostase redox, observamos um dano mais pronunciado. Dessa forma, concluímos que alterações na homeostase energética, mas principalmente na homeostase redox podem estar envolvidos na fisiopatogenia do dano neurológico observado nos pacientes com a síndrome HHH. / Hyperornithinemia-hyperammonemia-homocitrullinuria (HHH) syndrome is an autosomal recessive disorder of urea cycle characterized by a defect in the transport of ornithine (Orn) into mitochondrial matrix leading to accumulation of Orn, homocitrulline (Hcit) and ammonia. The clinical signs and symptoms are variable, ranging from coagulopathy, coma, lethargy, mental retardation, cortical atrophy and cerebellar ataxia. Although neurological symptoms are frequent, the pathophysyology of this disorder is poorly known. In the present study, we investigated the in vitro and ex vivo effects of Orn and Hcit on important parameters of redox and energy homeostasis in cerebellum of 30-day-old rats. Besides that, we also investigated the effects of these metabolites on some parameters in cultured cortical astrocytes. We first studied the in vitro effects of Orn and Hcit on important parameters of redox and energy homeostasis in cerebellum of young rats. Orn and Hcit significantly increased thiobarbituric acid reative species (TBA-RS) levels that was totally prevented by melatonin and reduced glutathione (GSH). We also found that nitrate and nitrite production was not altered by any of the metabolites, in contrast to hydrogen peroxide production, which was significantly enhanced by Hcit. These results suggest that probably reactive nitrogen species were not involved on the observed results Furthermore, GSH concentrations were significantly reduced by Orn and Hcit and sulfhydryl content by Orn, implying an impairment of antioxidant defenses. As regards to energy metabolism, Orn and Hcit provoked a significant reduction of aconitase activity, without altering other parameters of energy metabolism. Furthermore, Orn-elicited reduction of aconitase activity was totally prevented by GSH, indicating that critical groups of this enzyme were susceptible to oxidation caused by this amino acid. We also investigated the ex vivo effects of intracerebellar administration of Orn and Hcit on important parameters of oxidative stress and on Na+, K+ ATPase activity. Similarly with our in vitro results, Orn significantly increased TBA-RS levels and the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR) and glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH), and reduced Na+,K+-ATPase activity. In contrast, GSH concentrations were not changed by Orn treatment. Furthermore, intracerebellar administration of Hcit was not able to alter any of these parameters. The effects of Orn and Hcit were also investigated in cultured cortical astrocytes. We observed that Orn and Hcit diminished cellular viability, mitochondrial function, GSH levels, without altering cytokine production. Our results demonstrate a mild impairment in energy metabolism, but mostly in redox homeostasis in cerebellum and cortical cultured astrocytes. Therefore, we conclude that alterations of energy metabolism and especially redox homeostasis may be involved in the pathophysiology of the neurological damage observed in patients with HHH syndrome.

A síndrome hiperornitinemia-hiperamonemia-homocitrulinúria (HHH) é um erro inato do metabolismo do ciclo da ureia, de caráter autossômico recessivo e caracterizada por um defeito no transporte mitocondrial de ornitina (Orn), levando a um acúmulo citosólico desse aminoácido, além do acúmulo de homocitrulina (Hcit) e amônia. Os sinais e sintomas clínicos são variáveis, dentre eles podemos citar coagulopatia, coma, letargia, retardo mental, atrofia cortical e ataxia cerebelar. Embora os sintomas neurológicos sejam frequentes, a fisiopatogenia dessa doença ainda é desconhecida. Nesse trabalho investigamos os efeitos in vitro e ex vivo da Orn e Hcit sobre importantes parâmetros de homeostase redox e energética em cerebelo de ratos de 30 dias de vida. Além disso, também investigamos os efeitos desses metabólitos sobre alguns parâmetros em astrócitos cultivados de córtex cerebral. Primeiramente investigamos os efeitos in vitro da Orn e Hcit sobre importantes parâmetros de homeostase redox e energética em cerebelo de ratos jovens. Ambos metabólitos aumentaram significativamente os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS). Além disso, esses níveis foram totalmente prevenidos pela melatonina e pela glutationa reduzida (GSH). Observamos também que os níveis da produção de nitratos e nitritos não foi alterada por nenhum dos metabólitos utilizados, por outro lado, a Hcit aumentou a produção de peróxido de hidrogênio Ao investigarmos os níves de GSH observamos que tanto a Orn quanto a Hcit reduziram esse parâmetro e que a Orn reduziu o conteúdo de grupamentos sulfidrila, indicando uma dimunioção nas defeas antioxidantes não enzimáticas. Com relação ao metabolism energetic, a Orn e Hcit diminuíram a atividade da enzima aconitase, porém não alteraram outros parâmetros estudados. Além disso, a redução causada pela Orn foi prevenida pela GSH, indicando que essa enzima é suscetível a oxidação causada por exxe aminoácido. Também investigamos os efeitos ex vivo da injeção intracerebelar de Orn e Hcit sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo e sobre a ativdade da Na+, K+ ATPase. A Orn aumentou significativamente os níveis de TBA-RS e atividade da superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase, glutationa redutase e glucose 6-fosfato desidrogenase e diminuiu a ativdade da Na+,K+-ATPase. Por outro lado, as concentrações de GSH não foram alteradas pelo tratamento com ornitina. Por fim, a Hcit não foi capaz de alterar nenhum dos parâmetros avaliados. Os efeitos da Orn e Hcit foram também investigados em astrócitos cultivados a partir de córtex cerebral de ratos neonatos. Observamos que Orn e Hcit diminuíram a viabilidade celular, a função mitocondrial e os níveis de GSH, porém não alteraram a produção de citocinas. Nossos resultados demonstram um prejuízo moderado na homeostase energética, porém, quando observamos a homeostase redox, observamos um dano mais pronunciado. Dessa forma, concluímos que alterações na homeostase energética, mas principalmente na homeostase redox podem estar envolvidos na fisiopatogenia do dano neurológico observado nos pacientes com a síndrome HHH. / Hyperornithinemia-hyperammonemia-homocitrullinuria (HHH) syndrome is an autosomal recessive disorder of urea cycle characterized by a defect in the transport of ornithine (Orn) into mitochondrial matrix leading to accumulation of Orn, homocitrulline (Hcit) and ammonia. The clinical signs and symptoms are variable, ranging from coagulopathy, coma, lethargy, mental retardation, cortical atrophy and cerebellar ataxia. Although neurological symptoms are frequent, the pathophysyology of this disorder is poorly known. In the present study, we investigated the in vitro and ex vivo effects of Orn and Hcit on important parameters of redox and energy homeostasis in cerebellum of 30-day-old rats. Besides that, we also investigated the effects of these metabolites on some parameters in cultured cortical astrocytes. We first studied the in vitro effects of Orn and Hcit on important parameters of redox and energy homeostasis in cerebellum of young rats. Orn and Hcit significantly increased thiobarbituric acid reative species (TBA-RS) levels that was totally prevented by melatonin and reduced glutathione (GSH). We also found that nitrate and nitrite production was not altered by any of the metabolites, in contrast to hydrogen peroxide production, which was significantly enhanced by Hcit. These results suggest that probably reactive nitrogen species were not involved on the observed results Furthermore, GSH concentrations were significantly reduced by Orn and Hcit and sulfhydryl content by Orn, implying an impairment of antioxidant defenses. As regards to energy metabolism, Orn and Hcit provoked a significant reduction of aconitase activity, without altering other parameters of energy metabolism. Furthermore, Orn-elicited reduction of aconitase activity was totally prevented by GSH, indicating that critical groups of this enzyme were susceptible to oxidation caused by this amino acid. We also investigated the ex vivo effects of intracerebellar administration of Orn and Hcit on important parameters of oxidative stress and on Na+, K+ ATPase activity. Similarly with our in vitro results, Orn significantly increased TBA-RS levels and the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR) and glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH), and reduced Na+,K+-ATPase activity. In contrast, GSH concentrations were not changed by Orn treatment. Furthermore, intracerebellar administration of Hcit was not able to alter any of these parameters. The effects of Orn and Hcit were also investigated in cultured cortical astrocytes. We observed that Orn and Hcit diminished cellular viability, mitochondrial function, GSH levels, without altering cytokine production. Our results demonstrate a mild impairment in energy metabolism, but mostly in redox homeostasis in cerebellum and cortical cultured astrocytes. Therefore, we conclude that alterations of energy metabolism and especially redox homeostasis may be involved in the pathophysiology of the neurological damage observed in patients with HHH syndrome.

doença metabólica hereditária bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de ornitina (Orn), homocitrulina (Hcit), amônia e ácido orótico (Oro) no sangue e outros tecidos dos pacientes afetados. Os sintomas neurológicos desse distúrbio são comuns, incluindo retardo mental, convulsões e ataxia, porém os mecanismos que levam ao dano cerebral são praticamente desconhecidos. O presente estudo teve o objetivo de avaliar o efeito dos metabólitos acumulados nesta doença sobre a homeostase energética e redox em cérebro de ratos, bem como sobre o desempenho de animais submetidos à hiperornitinemia em tarefas comportamentais. Inicialmente avaliamos o efeito in vitro da Orn, Hcit e Oro sobre parâmetros do metabolismo energético em cérebro de ratos jovens. Verificamos que a Orn e a Hcit inibem o ciclo dos ácidos tricarboxílicos, (inibição da produção de CO2 a partir de acetato e das enzimas aconitase e α-cetoglutarato desidrogenase), bem como a via glicolítica aeróbica (redução na síntese de CO2 a partir de glicose), além de comprometer o fluxo de elétrons pela cadeia respiratória (inibição do complexo I-III). A Hcit, mas não a Orn, também foi capaz de inibir a atividade da enzima creatina quinase, sendo que essa inibição foi prevenida por GSH, sugerindo um possível papel de espécies reativas oxidando grupamentos tióis, essenciais para a atividade desta enzima. Em contraste, a atividade das outras enzimas do ciclo dos ácidos tricarboxílicos e da cadeia respiratória, bem como a Na+,K+- ATPase não foram alteradas in vitro pela Orn e pela Hcit nas doses testadas (0,1 a 5 mM). Do mesmo modo, o Oro não interferiu em nenhum dos parâmetros testados. O próximo passo deste estudo foi avaliar o efeito in vivo da administração intracerebroventricular (ICV) de Orn e Hcit sobre parâmetros de estresse oxidativo e metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens. A Orn e a Hcit aumentaram os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e a formação de grupamentos carbonilas, indicativos de peroxidação lipídica e dano oxidativo a proteínas, respectivamente. Além do mais, a N-acetilcisteína e a combinação de ácido ascórbico mais α-tocoferol atenuaram a oxidação lipídica e preveniram totalmente o dano oxidativo protéico provocado pela Orn e pela Hcit, sugerindo que espécies reativas estejam envolvidas nestes efeitos. A administração ICV de Hcit, mas não de Orn, também diminuiu os níveis de glutationa reduzida (GSH), bem como a atividade das enzimas catalase e glutationa peroxidase, indicando que a Hcit provoca uma redução nas defesas antioxidantes cerebrais. Quanto aos parâmetros de metabolismo energético avaliados após a administração ICV de Orn e Hcit, verificamos que a Orn e a Hcit inibem o funcionamento do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (inibição da síntese de CO2 a partir de acetato), a via glicolítica (redução na produção de CO2 a partir de glicose) e a atividade do complexo I-III da cadeia respiratória. A Hcit in vivo também inibiu a atividade da aconitase, uma enzima muito susceptível ao ataque de radicais livres. Investigamos também os efeitos da administração ICV de Orn e Hcit na presença ou ausência de hiperamonemia, induzida pela administração intraperitoneal de urease, sobre parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens. A Orn aumentou os níveis de TBA-RS e a formação de carbonilas, sem alterar o conteúdo de grupamentos sulfidrilas e os níveis de GSH. Além disso, a combinação de hiperamonemia com Orn resultou em uma diminuição no conteúdo de sulfidrilas e GSH, indicando um efeito sinérgico da Orn com a amônia. Além disso, a Hcit causou um aumento nos valores de TBA-RS e da formação de carbonilas, bem como uma diminuição na concentração de GSH sem alterar o conteúdo de sulfidrilas. Em relação ao tratamento com urease, a indução de hiperamonemia pela urease foi capaz de aumentar os níveis de TBA-RS, indicando que hiperamonemia causa dano oxidativo a lipídeos. Finalmente, produzimos um modelo animal quimicamente induzido de hiperornitinemia através da administração subcutânea de Orn (2-5 μmol/g de peso corporal). Altas concentrações cerebrais de Orn foram alcançadas nesse modelo, indicando que a Orn é permeável a barreira hemato-encefálica. Investigamos, então, o efeito da administração crônica de Orn do 5° ao 28° dia pós-natal sobre o desenvolvimento físico, motor e sobre o desempenho dos ratos adultos nas tarefas de campo aberto e no labirinto aquático de Morris. A administração crônica de Orn não afetou o aparecimento de pelos, a abertura dos olhos, a erupção dos incisivos e o reflexo de queda livre, sugerindo que o desenvolvimento físico e neuromotor não foram comprometidos pela administração crônica de Orn. Similarmente, o desempenho dos ratos no labirinto aquático de Morris na idade adulta não foi alterado pelo tratamento crônico dos mesmos com Orn, indicando que a memória espacial não foi afetada. Entretanto, os animais tratados com Orn não apresentaram habituação ao campo aberto, sugerindo um déficit de aprendizado/memória nesta tarefa. A atividade motora, avaliada pelo número de cruzamentos na tarefa do campo aberto, e pela velocidade de natação no labirinto aquático de Morris foram similares para os animais injetados com Orn e salina, indicando que os animais com hiperornitinemia não apresentaram déficit na atividade locomotora que pudesse atrapalhar seu desempenho nos testes de comportamento. De maneira similar, o número de bolos fecais, o número de grooming e o tempo gasto na área central na tarefa de campo aberto foram iguais em ambos os grupos, indicando que não houve alteração na ansiedade dos animais com o tratamento com Orn. A presente investigação demonstrou pela primeira vez que a Orn e especialmente a Hcit comprometem a homeostase energética e redox celular e que hiperornitinemia crônica durante o período pós-natal prejudica o desempenho de animais adultos na tarefa de campo aberto. É provável, portanto, que as concentrações cerebrais aumentadas de Orn tenham provocado um dano cerebral, possivelmente através do comprometimento do metabolismo energético e da indução de dano oxidativo, alterando vias do metabolismo necessárias para um aprendizado/memória normais. Concluindo, postulamos que alterações na bioenergética e no estado redox cerebral induzido pelos metabólitos acumulados na síndrome HHH, como demonstrado in vitro e in vivo na presente investigação, possam representar mecanismos patogênicos, contribuindo, ao menos em parte, para os sintomas neurológicos dos pacientes afetados por este transtorno. / Tissue accumulation of ornithine (Orn), homocitrulline (Hcit), ammonia and orotic acid (Oro) is the biochemical hallmark of patients affected by hyperornithinemia–hyperammonemia– homocitrullinuria (HHH) syndrome, a disorder clinically characterized by neurological symptoms, whose pathophysiology is practically unknown. The aim of this study was to evaluate the effect of the accumulating metabolite in the HHH syndrome on energetic and redox homeostasis in brain of rats, as well as the rat performance in behavioural tasks when submitted to hiperornithinemia. We first investigated the in vitro effect of Orn, Hcit and Oro on parameters of energy metabolism in brain of young rats. We verified that Orn and Hcit inhibited the citric acid cycle (inhibition of CO2 synthesis from acetate, as well as aconitase and α- ketoglutarate dehydrogenase activities), the aerobic glycolytic pathway (reduced CO2 production from glucose) and moderately the electron transfer flow (inhibitory effect on complex I–III). Hcit, but not Orn, was also able to inhibit the mitochondrial creatine kinase activity. Furthermore, this inhibition was prevented by glutathione, suggesting a possible role of reactive species oxidizing critical thiol groups of the enzyme. In contrast, the other enzyme activities of the citric acid cycle and of the electron transfer chain, as well as synaptic Na+,K+-ATPase were not altered by either Orn or Hcit at concentrations as high as 5.0 mM. Similarly, Oro did not interfere with any of the tested parameters. The next step of this study was to investigate the in vivo effects of intracerebroventricular (ICV) administration of Orn and Hcit on parameters of oxidative stress and energy metabolism in cerebral cortex from young rats. Orn and Hcit increased thiobarbituric acid-reactive substances values and carbonyl formation, indicators of lipid and protein oxidative damage, respectively. Furthermore, N-acetylcysteine and the combination of ascorbic acid plus α- tocopherol attenuated the lipid oxidation and totally prevented the protein oxidative damage provoked by Orn and Hcit, suggesting that reactive species were involved in these effects. The ICV Hcit administration, but not Orn administration, also decreased reduced glutathione (GSH) concentrations, as well as the activity of catalase and glutathione peroxidase, indicating that Hcit provokes a reduction of brain antioxidant defenses. As regards to the parameters of energy metabolism, we verified that Orn and Hcit inhibited the citric acid cycle function (inhibition of CO2 synthesis from acetate), the aerobic glycolytic pathway (reduced CO2 production from glucose) and complex I–III activity of the respiratory chain. Hcit also inhibited the activity of aconitase, an enzyme very susceptible to free radical attack. We also investigated the in vivo effects of ICV administration of Orn and Hcit in the presence or absence of hyperammonemia induced by intraperitoneal urease treatment on important parameters of oxidative stress in cerebral cortex from young. Orn increased thiobarbituric acid-reactive substances levels and carbonyl formation, without altering sulfhydryl content and GSH levels. We also observed that the combination of hyperammonemia with Orn resulted in a decrease of sulfhydryl levels and GSH concentrations, highlighting a synergistic effect of ornithine and ammonia. Furthermore, homocitrulline caused increases of thiobarbituric acid-reactive substances values and carbonyl formation, as well as a decrease of GSH concentrations without altering sulfhydryl content. We also observed that urease treatment per se was able to enhance thiobarbituric acid-reactive substances levels indicating that hiperamonemia induce lipid peroxidation. Finally, we produced a chemical animal model of hiperornithinemia induced by a subcutaneous injection of saline-buffered Orn (2-5 μmol/g body weight) to rats. High brain Orn concentrations were achieved, indicating that Orn is permeable to the blood brain barrier. We then investigated the effect of early chronic postnatal administration of Orn (from the 5th to the 28th day of life) on physical and motor development and on the performance of adult rats in the open field and in the Morris water maze tasks. Chronic postnatal Orn treatment had no effect on the appearance of coat, eye opening or upper incisor eruption, nor on the free-fall righting task, suggesting that physical and motor development were not changed by Orn. However, Orn-treated rats did not habituate to the open field apparatus, implying a deficit of learning/memory. Motor activity was the same for Orn- and saline- injected animals. Motor activity, evaluated by the number of crossings in the open field and by the swimming speed in the Morris water maze, was the same for Orn- and saline- injected animals, indicating no deficit of locomotor activity in rats injected with Orn. Similarly, the number of fecal boli and grooming and the time spent in the central area in the open field task were the same in both groups, implying no alteration of emotionality. The current investigation shows for the first time that Orn and especially Hcit compromise energetic and redox homeostasis and that chronic hyperornithinemia during postnatal period impairs the adult rat performance in the open field task, where the animals did not habituate to the apparatus. It is possible, however, that high sustained cerebral Orn level could provoke a brain damage, possibly through induction of oxidative stress and/or compromising energy metabolism, altering some metabolic pathways essential for normal learning/memory. In conclusion, we postulate that alterations in the cerebral bioenergetic and redox state induced by metabolites accumulated in HHH syndrome, as demonstrated in vitro and in vivo in the present study, may represent pathogenic mechanisms contributing, at least in part, to the neurological symptoms of patients affected by this disorder.

doença metabólica hereditária bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de ornitina (Orn), homocitrulina (Hcit), amônia e ácido orótico (Oro) no sangue e outros tecidos dos pacientes afetados. Os sintomas neurológicos desse distúrbio são comuns, incluindo retardo mental, convulsões e ataxia, porém os mecanismos que levam ao dano cerebral são praticamente desconhecidos. O presente estudo teve o objetivo de avaliar o efeito dos metabólitos acumulados nesta doença sobre a homeostase energética e redox em cérebro de ratos, bem como sobre o desempenho de animais submetidos à hiperornitinemia em tarefas comportamentais. Inicialmente avaliamos o efeito in vitro da Orn, Hcit e Oro sobre parâmetros do metabolismo energético em cérebro de ratos jovens. Verificamos que a Orn e a Hcit inibem o ciclo dos ácidos tricarboxílicos, (inibição da produção de CO2 a partir de acetato e das enzimas aconitase e α-cetoglutarato desidrogenase), bem como a via glicolítica aeróbica (redução na síntese de CO2 a partir de glicose), além de comprometer o fluxo de elétrons pela cadeia respiratória (inibição do complexo I-III). A Hcit, mas não a Orn, também foi capaz de inibir a atividade da enzima creatina quinase, sendo que essa inibição foi prevenida por GSH, sugerindo um possível papel de espécies reativas oxidando grupamentos tióis, essenciais para a atividade desta enzima. Em contraste, a atividade das outras enzimas do ciclo dos ácidos tricarboxílicos e da cadeia respiratória, bem como a Na+,K+- ATPase não foram alteradas in vitro pela Orn e pela Hcit nas doses testadas (0,1 a 5 mM). Do mesmo modo, o Oro não interferiu em nenhum dos parâmetros testados. O próximo passo deste estudo foi avaliar o efeito in vivo da administração intracerebroventricular (ICV) de Orn e Hcit sobre parâmetros de estresse oxidativo e metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens. A Orn e a Hcit aumentaram os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e a formação de grupamentos carbonilas, indicativos de peroxidação lipídica e dano oxidativo a proteínas, respectivamente. Além do mais, a N-acetilcisteína e a combinação de ácido ascórbico mais α-tocoferol atenuaram a oxidação lipídica e preveniram totalmente o dano oxidativo protéico provocado pela Orn e pela Hcit, sugerindo que espécies reativas estejam envolvidas nestes efeitos. A administração ICV de Hcit, mas não de Orn, também diminuiu os níveis de glutationa reduzida (GSH), bem como a atividade das enzimas catalase e glutationa peroxidase, indicando que a Hcit provoca uma redução nas defesas antioxidantes cerebrais. Quanto aos parâmetros de metabolismo energético avaliados após a administração ICV de Orn e Hcit, verificamos que a Orn e a Hcit inibem o funcionamento do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (inibição da síntese de CO2 a partir de acetato), a via glicolítica (redução na produção de CO2 a partir de glicose) e a atividade do complexo I-III da cadeia respiratória. A Hcit in vivo também inibiu a atividade da aconitase, uma enzima muito susceptível ao ataque de radicais livres. Investigamos também os efeitos da administração ICV de Orn e Hcit na presença ou ausência de hiperamonemia, induzida pela administração intraperitoneal de urease, sobre parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens. A Orn aumentou os níveis de TBA-RS e a formação de carbonilas, sem alterar o conteúdo de grupamentos sulfidrilas e os níveis de GSH. Além disso, a combinação de hiperamonemia com Orn resultou em uma diminuição no conteúdo de sulfidrilas e GSH, indicando um efeito sinérgico da Orn com a amônia. Além disso, a Hcit causou um aumento nos valores de TBA-RS e da formação de carbonilas, bem como uma diminuição na concentração de GSH sem alterar o conteúdo de sulfidrilas. Em relação ao tratamento com urease, a indução de hiperamonemia pela urease foi capaz de aumentar os níveis de TBA-RS, indicando que hiperamonemia causa dano oxidativo a lipídeos. Finalmente, produzimos um modelo animal quimicamente induzido de hiperornitinemia através da administração subcutânea de Orn (2-5 μmol/g de peso corporal). Altas concentrações cerebrais de Orn foram alcançadas nesse modelo, indicando que a Orn é permeável a barreira hemato-encefálica. Investigamos, então, o efeito da administração crônica de Orn do 5° ao 28° dia pós-natal sobre o desenvolvimento físico, motor e sobre o desempenho dos ratos adultos nas tarefas de campo aberto e no labirinto aquático de Morris. A administração crônica de Orn não afetou o aparecimento de pelos, a abertura dos olhos, a erupção dos incisivos e o reflexo de queda livre, sugerindo que o desenvolvimento físico e neuromotor não foram comprometidos pela administração crônica de Orn. Similarmente, o desempenho dos ratos no labirinto aquático de Morris na idade adulta não foi alterado pelo tratamento crônico dos mesmos com Orn, indicando que a memória espacial não foi afetada. Entretanto, os animais tratados com Orn não apresentaram habituação ao campo aberto, sugerindo um déficit de aprendizado/memória nesta tarefa. A atividade motora, avaliada pelo número de cruzamentos na tarefa do campo aberto, e pela velocidade de natação no labirinto aquático de Morris foram similares para os animais injetados com Orn e salina, indicando que os animais com hiperornitinemia não apresentaram déficit na atividade locomotora que pudesse atrapalhar seu desempenho nos testes de comportamento. De maneira similar, o número de bolos fecais, o número de grooming e o tempo gasto na área central na tarefa de campo aberto foram iguais em ambos os grupos, indicando que não houve alteração na ansiedade dos animais com o tratamento com Orn. A presente investigação demonstrou pela primeira vez que a Orn e especialmente a Hcit comprometem a homeostase energética e redox celular e que hiperornitinemia crônica durante o período pós-natal prejudica o desempenho de animais adultos na tarefa de campo aberto. É provável, portanto, que as concentrações cerebrais aumentadas de Orn tenham provocado um dano cerebral, possivelmente através do comprometimento do metabolismo energético e da indução de dano oxidativo, alterando vias do metabolismo necessárias para um aprendizado/memória normais. Concluindo, postulamos que alterações na bioenergética e no estado redox cerebral induzido pelos metabólitos acumulados na síndrome HHH, como demonstrado in vitro e in vivo na presente investigação, possam representar mecanismos patogênicos, contribuindo, ao menos em parte, para os sintomas neurológicos dos pacientes afetados por este transtorno. / Tissue accumulation of ornithine (Orn), homocitrulline (Hcit), ammonia and orotic acid (Oro) is the biochemical hallmark of patients affected by hyperornithinemia–hyperammonemia– homocitrullinuria (HHH) syndrome, a disorder clinically characterized by neurological symptoms, whose pathophysiology is practically unknown. The aim of this study was to evaluate the effect of the accumulating metabolite in the HHH syndrome on energetic and redox homeostasis in brain of rats, as well as the rat performance in behavioural tasks when submitted to hiperornithinemia. We first investigated the in vitro effect of Orn, Hcit and Oro on parameters of energy metabolism in brain of young rats. We verified that Orn and Hcit inhibited the citric acid cycle (inhibition of CO2 synthesis from acetate, as well as aconitase and α- ketoglutarate dehydrogenase activities), the aerobic glycolytic pathway (reduced CO2 production from glucose) and moderately the electron transfer flow (inhibitory effect on complex I–III). Hcit, but not Orn, was also able to inhibit the mitochondrial creatine kinase activity. Furthermore, this inhibition was prevented by glutathione, suggesting a possible role of reactive species oxidizing critical thiol groups of the enzyme. In contrast, the other enzyme activities of the citric acid cycle and of the electron transfer chain, as well as synaptic Na+,K+-ATPase were not altered by either Orn or Hcit at concentrations as high as 5.0 mM. Similarly, Oro did not interfere with any of the tested parameters. The next step of this study was to investigate the in vivo effects of intracerebroventricular (ICV) administration of Orn and Hcit on parameters of oxidative stress and energy metabolism in cerebral cortex from young rats. Orn and Hcit increased thiobarbituric acid-reactive substances values and carbonyl formation, indicators of lipid and protein oxidative damage, respectively. Furthermore, N-acetylcysteine and the combination of ascorbic acid plus α- tocopherol attenuated the lipid oxidation and totally prevented the protein oxidative damage provoked by Orn and Hcit, suggesting that reactive species were involved in these effects. The ICV Hcit administration, but not Orn administration, also decreased reduced glutathione (GSH) concentrations, as well as the activity of catalase and glutathione peroxidase, indicating that Hcit provokes a reduction of brain antioxidant defenses. As regards to the parameters of energy metabolism, we verified that Orn and Hcit inhibited the citric acid cycle function (inhibition of CO2 synthesis from acetate), the aerobic glycolytic pathway (reduced CO2 production from glucose) and complex I–III activity of the respiratory chain. Hcit also inhibited the activity of aconitase, an enzyme very susceptible to free radical attack. We also investigated the in vivo effects of ICV administration of Orn and Hcit in the presence or absence of hyperammonemia induced by intraperitoneal urease treatment on important parameters of oxidative stress in cerebral cortex from young. Orn increased thiobarbituric acid-reactive substances levels and carbonyl formation, without altering sulfhydryl content and GSH levels. We also observed that the combination of hyperammonemia with Orn resulted in a decrease of sulfhydryl levels and GSH concentrations, highlighting a synergistic effect of ornithine and ammonia. Furthermore, homocitrulline caused increases of thiobarbituric acid-reactive substances values and carbonyl formation, as well as a decrease of GSH concentrations without altering sulfhydryl content. We also observed that urease treatment per se was able to enhance thiobarbituric acid-reactive substances levels indicating that hiperamonemia induce lipid peroxidation. Finally, we produced a chemical animal model of hiperornithinemia induced by a subcutaneous injection of saline-buffered Orn (2-5 μmol/g body weight) to rats. High brain Orn concentrations were achieved, indicating that Orn is permeable to the blood brain barrier. We then investigated the effect of early chronic postnatal administration of Orn (from the 5th to the 28th day of life) on physical and motor development and on the performance of adult rats in the open field and in the Morris water maze tasks. Chronic postnatal Orn treatment had no effect on the appearance of coat, eye opening or upper incisor eruption, nor on the free-fall righting task, suggesting that physical and motor development were not changed by Orn. However, Orn-treated rats did not habituate to the open field apparatus, implying a deficit of learning/memory. Motor activity was the same for Orn- and saline- injected animals. Motor activity, evaluated by the number of crossings in the open field and by the swimming speed in the Morris water maze, was the same for Orn- and saline- injected animals, indicating no deficit of locomotor activity in rats injected with Orn. Similarly, the number of fecal boli and grooming and the time spent in the central area in the open field task were the same in both groups, implying no alteration of emotionality. The current investigation shows for the first time that Orn and especially Hcit compromise energetic and redox homeostasis and that chronic hyperornithinemia during postnatal period impairs the adult rat performance in the open field task, where the animals did not habituate to the apparatus. It is possible, however, that high sustained cerebral Orn level could provoke a brain damage, possibly through induction of oxidative stress and/or compromising energy metabolism, altering some metabolic pathways essential for normal learning/memory. In conclusion, we postulate that alterations in the cerebral bioenergetic and redox state induced by metabolites accumulated in HHH syndrome, as demonstrated in vitro and in vivo in the present study, may represent pathogenic mechanisms contributing, at least in part, to the neurological symptoms of patients affected by this disorder.

A síndrome hiperornitinemia-hiperamonemia-homocitrulinúria (HHH) é um erro inato do metabolismo do ciclo da ureia, de caráter autossômico recessivo e caracterizada por um defeito no transporte mitocondrial de ornitina (Orn), levando a um acúmulo citosólico desse aminoácido, além do acúmulo de homocitrulina (Hcit) e amônia. Os sinais e sintomas clínicos são variáveis, dentre eles podemos citar coagulopatia, coma, letargia, retardo mental, atrofia cortical e ataxia cerebelar. Embora os sintomas neurológicos sejam frequentes, a fisiopatogenia dessa doença ainda é desconhecida. Nesse trabalho investigamos os efeitos in vitro e ex vivo da Orn e Hcit sobre importantes parâmetros de homeostase redox e energética em cerebelo de ratos de 30 dias de vida. Além disso, também investigamos os efeitos desses metabólitos sobre alguns parâmetros em astrócitos cultivados de córtex cerebral. Primeiramente investigamos os efeitos in vitro da Orn e Hcit sobre importantes parâmetros de homeostase redox e energética em cerebelo de ratos jovens. Ambos metabólitos aumentaram significativamente os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS). Além disso, esses níveis foram totalmente prevenidos pela melatonina e pela glutationa reduzida (GSH). Observamos também que os níveis da produção de nitratos e nitritos não foi alterada por nenhum dos metabólitos utilizados, por outro lado, a Hcit aumentou a produção de peróxido de hidrogênio Ao investigarmos os níves de GSH observamos que tanto a Orn quanto a Hcit reduziram esse parâmetro e que a Orn reduziu o conteúdo de grupamentos sulfidrila, indicando uma dimunioção nas defeas antioxidantes não enzimáticas. Com relação ao metabolism energetic, a Orn e Hcit diminuíram a atividade da enzima aconitase, porém não alteraram outros parâmetros estudados. Além disso, a redução causada pela Orn foi prevenida pela GSH, indicando que essa enzima é suscetível a oxidação causada por exxe aminoácido. Também investigamos os efeitos ex vivo da injeção intracerebelar de Orn e Hcit sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo e sobre a ativdade da Na+, K+ ATPase. A Orn aumentou significativamente os níveis de TBA-RS e atividade da superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase, glutationa redutase e glucose 6-fosfato desidrogenase e diminuiu a ativdade da Na+,K+-ATPase. Por outro lado, as concentrações de GSH não foram alteradas pelo tratamento com ornitina. Por fim, a Hcit não foi capaz de alterar nenhum dos parâmetros avaliados. Os efeitos da Orn e Hcit foram também investigados em astrócitos cultivados a partir de córtex cerebral de ratos neonatos. Observamos que Orn e Hcit diminuíram a viabilidade celular, a função mitocondrial e os níveis de GSH, porém não alteraram a produção de citocinas. Nossos resultados demonstram um prejuízo moderado na homeostase energética, porém, quando observamos a homeostase redox, observamos um dano mais pronunciado. Dessa forma, concluímos que alterações na homeostase energética, mas principalmente na homeostase redox podem estar envolvidos na fisiopatogenia do dano neurológico observado nos pacientes com a síndrome HHH. / Hyperornithinemia-hyperammonemia-homocitrullinuria (HHH) syndrome is an autosomal recessive disorder of urea cycle characterized by a defect in the transport of ornithine (Orn) into mitochondrial matrix leading to accumulation of Orn, homocitrulline (Hcit) and ammonia. The clinical signs and symptoms are variable, ranging from coagulopathy, coma, lethargy, mental retardation, cortical atrophy and cerebellar ataxia. Although neurological symptoms are frequent, the pathophysyology of this disorder is poorly known. In the present study, we investigated the in vitro and ex vivo effects of Orn and Hcit on important parameters of redox and energy homeostasis in cerebellum of 30-day-old rats. Besides that, we also investigated the effects of these metabolites on some parameters in cultured cortical astrocytes. We first studied the in vitro effects of Orn and Hcit on important parameters of redox and energy homeostasis in cerebellum of young rats. Orn and Hcit significantly increased thiobarbituric acid reative species (TBA-RS) levels that was totally prevented by melatonin and reduced glutathione (GSH). We also found that nitrate and nitrite production was not altered by any of the metabolites, in contrast to hydrogen peroxide production, which was significantly enhanced by Hcit. These results suggest that probably reactive nitrogen species were not involved on the observed results Furthermore, GSH concentrations were significantly reduced by Orn and Hcit and sulfhydryl content by Orn, implying an impairment of antioxidant defenses. As regards to energy metabolism, Orn and Hcit provoked a significant reduction of aconitase activity, without altering other parameters of energy metabolism. Furthermore, Orn-elicited reduction of aconitase activity was totally prevented by GSH, indicating that critical groups of this enzyme were susceptible to oxidation caused by this amino acid. We also investigated the ex vivo effects of intracerebellar administration of Orn and Hcit on important parameters of oxidative stress and on Na+, K+ ATPase activity. Similarly with our in vitro results, Orn significantly increased TBA-RS levels and the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR) and glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH), and reduced Na+,K+-ATPase activity. In contrast, GSH concentrations were not changed by Orn treatment. Furthermore, intracerebellar administration of Hcit was not able to alter any of these parameters. The effects of Orn and Hcit were also investigated in cultured cortical astrocytes. We observed that Orn and Hcit diminished cellular viability, mitochondrial function, GSH levels, without altering cytokine production. Our results demonstrate a mild impairment in energy metabolism, but mostly in redox homeostasis in cerebellum and cortical cultured astrocytes. Therefore, we conclude that alterations of energy metabolism and especially redox homeostasis may be involved in the pathophysiology of the neurological damage observed in patients with HHH syndrome.