Hantavirus é um gênero na família Hantaviradae, incluindo agentes polimórficos, envelopados e com genoma de RNA fita simples, polaridade negativa e trissegmentado. Os Hantavírus são zoonóticos e mantidos na natureza em reservatórios das ordens Rodentia, Soricomorpha e Chiroptera. No Brasil, foram descritos 8 Hantavírus e destes, 6 causam doença humana grave e de alta letalidade, a Síndrome Pulmonar e Cardiovascular, sendo dentre eles o Araraquara (ARQV) o vírus de ocorrência nas regiões de Cerrado do Sudeste (incluindo Ribeirão Preto) e Planalto Central. ARQV destaca-se por produzir a maior letalidade dentre todos os Hantavírus existentes e possuir como reservatório o roedor silvestre Necromys lasiurus que o transmite ao homem por inalação dos aerossóis contaminados de suas excretas. Neste trabalho, detectamos genoma de Hantavírus em tecidos de Necromys lasiurus e em tecidos de morcego Desmodus rotundus, ambos capturados no Nordeste do Estado de São Paulo. Destes animais, foram feitas tentativas de isolamento de Hantavírus a partir de amostras de tecido de Necromys lasiurus e Desmodus rotundus. Os procedimentos foram realizados em laboratório de nivel de biossegurança 3, onde fizeram-se as inoculações em cultura de células VERO E6, com detecção viral após uma única passagem de 4 dias. Desta forma, foi possível isolar um Hantavírus a partir de sobrenadante do lisado de coração do roedor, o que foi confirmado pela presença do genoma viral do isolado por RT-PCR do sobrenadante de cultura celular e dos antígenos virais nas células Vero E6, por imunofluorescência indireta e western blot. O processo de isolamento mostrou-se reprodutível, por 3 vezes, para o mesmo tecido do roedor. Tais resultados encorajam que esta metodologia para isolamento de Hantavírus deva ser experimentada por mais vezes. O Hantavírus isolado (provavelmente ARQV) deverá fornecer importantes informações sobre seu genoma completo, além de propiciar vários estudos futuros. / Hantavirus is a genus in the Hantaviradae family, including polymorphic agents, it is enveloped and with a single stranded RNA genome, negative and tri-polarity polarity. Hantaviruses are zoonotic and kept in nature in reservoirs of the orders Rodentia, Soricomorpha and Chiroptera. There are 8 hantaviruses recorded in Brazil, 6 of them cause severe human disease and high lethality, a Pulmonary and Cardiovascular Syndrome, among which Araraquara (ARQV) is the virus that occurs in the Southeastern Cerrado (including Ribeirão Preto) and Central Plateau. ARQV stands out for producing higher lethality among all existing hantaviruses and has as reservoir the wild rodent Necromys lasiurus, which transmits to humans by inhalation of the contaminated aerosols of their excreta. In this work, we detected the genome of hantavirus in Necromys lasiurus and Desmodus rotundus, bat tissues, both captured in the Northeast of the State of São Paulo. Of these animals, attempts were made to isolate hantavirus from tissue samples of Necromys lasiurus and Desmodus rotundus. The laboratory tests of biosafety level 3, where inoculations in culture of VERO cells E6 were done, with viral detection after a single passage of 4 days. Thus, it was possible to isolate hantavirus from the rodent heart lysate supernatant, which was confirmed by the presence of the viral genome of the isolate by RT-PCR of the cell culture supernatant and the viral antigens in the Vero E6 cells by Indirect Immunofluorescence and Western Blot. The isolation process was reproducible, 3 times, for the same tissue of the rodent. These results indicate that this methodology for hantavirus isolation should be tested more often. The isolated Hantavirus (ARQV), should provide important information about its complete genome, as well as providing several future studies.

Hantavirus é um gênero na família Hantaviradae, incluindo agentes polimórficos, envelopados e com genoma de RNA fita simples, polaridade negativa e trissegmentado. Os Hantavírus são zoonóticos e mantidos na natureza em reservatórios das ordens Rodentia, Soricomorpha e Chiroptera. No Brasil, foram descritos 8 Hantavírus e destes, 6 causam doença humana grave e de alta letalidade, a Síndrome Pulmonar e Cardiovascular, sendo dentre eles o Araraquara (ARQV) o vírus de ocorrência nas regiões de Cerrado do Sudeste (incluindo Ribeirão Preto) e Planalto Central. ARQV destaca-se por produzir a maior letalidade dentre todos os Hantavírus existentes e possuir como reservatório o roedor silvestre Necromys lasiurus que o transmite ao homem por inalação dos aerossóis contaminados de suas excretas. Neste trabalho, detectamos genoma de Hantavírus em tecidos de Necromys lasiurus e em tecidos de morcego Desmodus rotundus, ambos capturados no Nordeste do Estado de São Paulo. Destes animais, foram feitas tentativas de isolamento de Hantavírus a partir de amostras de tecido de Necromys lasiurus e Desmodus rotundus. Os procedimentos foram realizados em laboratório de nivel de biossegurança 3, onde fizeram-se as inoculações em cultura de células VERO E6, com detecção viral após uma única passagem de 4 dias. Desta forma, foi possível isolar um Hantavírus a partir de sobrenadante do lisado de coração do roedor, o que foi confirmado pela presença do genoma viral do isolado por RT-PCR do sobrenadante de cultura celular e dos antígenos virais nas células Vero E6, por imunofluorescência indireta e western blot. O processo de isolamento mostrou-se reprodutível, por 3 vezes, para o mesmo tecido do roedor. Tais resultados encorajam que esta metodologia para isolamento de Hantavírus deva ser experimentada por mais vezes. O Hantavírus isolado (provavelmente ARQV) deverá fornecer importantes informações sobre seu genoma completo, além de propiciar vários estudos futuros. / Hantavirus is a genus in the Hantaviradae family, including polymorphic agents, it is enveloped and with a single stranded RNA genome, negative and tri-polarity polarity. Hantaviruses are zoonotic and kept in nature in reservoirs of the orders Rodentia, Soricomorpha and Chiroptera. There are 8 hantaviruses recorded in Brazil, 6 of them cause severe human disease and high lethality, a Pulmonary and Cardiovascular Syndrome, among which Araraquara (ARQV) is the virus that occurs in the Southeastern Cerrado (including Ribeirão Preto) and Central Plateau. ARQV stands out for producing higher lethality among all existing hantaviruses and has as reservoir the wild rodent Necromys lasiurus, which transmits to humans by inhalation of the contaminated aerosols of their excreta. In this work, we detected the genome of hantavirus in Necromys lasiurus and Desmodus rotundus, bat tissues, both captured in the Northeast of the State of São Paulo. Of these animals, attempts were made to isolate hantavirus from tissue samples of Necromys lasiurus and Desmodus rotundus. The laboratory tests of biosafety level 3, where inoculations in culture of VERO cells E6 were done, with viral detection after a single passage of 4 days. Thus, it was possible to isolate hantavirus from the rodent heart lysate supernatant, which was confirmed by the presence of the viral genome of the isolate by RT-PCR of the cell culture supernatant and the viral antigens in the Vero E6 cells by Indirect Immunofluorescence and Western Blot. The isolation process was reproducible, 3 times, for the same tissue of the rodent. These results indicate that this methodology for hantavirus isolation should be tested more often. The isolated Hantavirus (ARQV), should provide important information about its complete genome, as well as providing several future studies.

O presente trabalho descreve o desenvolvimento de uma técnica de nested-PCR para a detecção de ADN do vírus da laringotraqueíte infecciosa (VLTI) utilizando primers que amplificam uma região do gene que codifica a glicoproteína E viral. A técnica padronizada amplificou amostras isoladas e de campo, mostrando alta sensibilidade e especificidade tomando o isolamento em ovos embrionados SPF como técnica de referência. O seqüenciamento de uma amostra positiva por nested-PCR confirmou a identidade do produto amplificado. Foram submetidas a nested-PCR padronizada amostras de traquéia, pulmão e conjuntiva de 51 granjas de poedeiras comerciais procedentes da região de Bastos, Estado de São Paulo, que apresentou um surto caracterizado por sinais respiratórios, queda na produção de ovos e aumento da mortalidade. Vinte e três granjas foram positivas a nested-PCR e vinte e duas amostras foram isoladas. Considerando os resultados das duas técnicas, vinte e quatro granjas resultaram positivas. Não foram detectados os vírus das doenças de Newcastle, pneumovirose aviaria, nem Mycoplasma gallisepticum. O vírus da bronquite infecciosa das galinhas foi detectado em uma granja, e Mycoplasma synoviae em oito. A alta freqüência de ocorrência do VLTI, a alta concordância entre o quadro clínico observado e detecção do VLTI e o resultados do diagnóstico diferencial demonstram que o VLTI foi o agente etiológico causador de um surto de doença respiratória observado na região de Bastos, Estado de São Paulo. / The present work describes the development of a nested-PCR technique for the detection of Infectious laryngotracheitis virus (ILTV) DNA using primers to amplify a region that encodes the glycoprotein E. The standardized technique amplified isolated and from clinical strains, offering high sensitivity and specificity, using the isolation in SPF chicken embryos such as reference test. The identity of the amplified product of the nested-PCR was confirmed by DNA sequencing. Trachea, lung and conjunctiva samples from fifty-one commercial layer farms from Bastos region, São Paulo State, which showed an outbreak characterized by respiratory signs, decreased egg production and increased mortality, were tested by the standardized nested-PCR. Twenty-three farms were positive by nested-PCR and samples of twenty-two farms were isolated. Twenty-four farms were positives when the results of both techniques were considered. Newcastle disease virus, Avian Pneumovirus and Mycoplasma gallisepticum were not detected. Infectious bronchitis virus was detected in one farm and Mycoplasma synoviae was detected in eight farms. The high frequency of occurrence of ILTV, the high agreement between clinical signs observed and ILTV detection and the results of differential diagnosis demonstrate that ILTV was the etiological agent of an outbreak respiratory disease observed in Bastos region, São Paulo State.

O presente trabalho descreve o desenvolvimento de uma técnica de nested-PCR para a detecção de ADN do vírus da laringotraqueíte infecciosa (VLTI) utilizando primers que amplificam uma região do gene que codifica a glicoproteína E viral. A técnica padronizada amplificou amostras isoladas e de campo, mostrando alta sensibilidade e especificidade tomando o isolamento em ovos embrionados SPF como técnica de referência. O seqüenciamento de uma amostra positiva por nested-PCR confirmou a identidade do produto amplificado. Foram submetidas a nested-PCR padronizada amostras de traquéia, pulmão e conjuntiva de 51 granjas de poedeiras comerciais procedentes da região de Bastos, Estado de São Paulo, que apresentou um surto caracterizado por sinais respiratórios, queda na produção de ovos e aumento da mortalidade. Vinte e três granjas foram positivas a nested-PCR e vinte e duas amostras foram isoladas. Considerando os resultados das duas técnicas, vinte e quatro granjas resultaram positivas. Não foram detectados os vírus das doenças de Newcastle, pneumovirose aviaria, nem Mycoplasma gallisepticum. O vírus da bronquite infecciosa das galinhas foi detectado em uma granja, e Mycoplasma synoviae em oito. A alta freqüência de ocorrência do VLTI, a alta concordância entre o quadro clínico observado e detecção do VLTI e o resultados do diagnóstico diferencial demonstram que o VLTI foi o agente etiológico causador de um surto de doença respiratória observado na região de Bastos, Estado de São Paulo. / The present work describes the development of a nested-PCR technique for the detection of Infectious laryngotracheitis virus (ILTV) DNA using primers to amplify a region that encodes the glycoprotein E. The standardized technique amplified isolated and from clinical strains, offering high sensitivity and specificity, using the isolation in SPF chicken embryos such as reference test. The identity of the amplified product of the nested-PCR was confirmed by DNA sequencing. Trachea, lung and conjunctiva samples from fifty-one commercial layer farms from Bastos region, São Paulo State, which showed an outbreak characterized by respiratory signs, decreased egg production and increased mortality, were tested by the standardized nested-PCR. Twenty-three farms were positive by nested-PCR and samples of twenty-two farms were isolated. Twenty-four farms were positives when the results of both techniques were considered. Newcastle disease virus, Avian Pneumovirus and Mycoplasma gallisepticum were not detected. Infectious bronchitis virus was detected in one farm and Mycoplasma synoviae was detected in eight farms. The high frequency of occurrence of ILTV, the high agreement between clinical signs observed and ILTV detection and the results of differential diagnosis demonstrate that ILTV was the etiological agent of an outbreak respiratory disease observed in Bastos region, São Paulo State.

A rubéola é uma doença infecciosa aguda, normalmente com um curso clínico suave. Porém quando adquirida nas primeiras 12 semanas de gestação, pode causar severos defeitos de nascimento, conhecida como Síndrome da Rubéola Congênita (SRC). A caracterização genética do vírus da rubéola é feita analisando a seqüência da região hipervariável do gene da glicoproteína E1. Este estudo, apresenta a primeira caracterização molecular de do vírus da rubéola isolados no estado de São Paulo, Brasil. As amostras (sangue, urina, swab de orofaringe, explante de fígado, produto de aborto e fluido cerebrospinal) foram coletados entre 1997 e 2004 de pacientes com sintomas clínicos de rubéola. O gene E1 vírus da rubéola foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase em cadeia diretamente de espécimes clínicos e isolados, e os fragmentos de DNA obtidos foram seqüenciados. As seqüências foram alinhadas para a analise filogenética, com seqüências representativas dos diferentes genótipos do vírus da rubéola. Vinte e nove isolados foram obtidos, incluindo isolados relacionados com insuficiência hepática aguda, encefalite e infecções congênitas. A análise filogenética mostrou que 19 dos 29 virus da rubéola isolados pertencem ao genótipo 1a, e 10 pertencem ao genótipo 1G. Este trabalho demonstrou dois genótipos do vírus da rubéola circularam simultaneamente entre os anos de 1997-2004. / Rubella is an acute infectious disease with normally a mild clinical course. However, infections during pregnancy, especially before week 12 of gestation (WG), can cause severe birth defects known as congenital rubella syndrome (CRS). Genetic characterization of wild-type rubella virus is based on sequence analysis of a hypervariable region of the glycoprotein E1 gene. This study presents the first molecular characterization of isolates from São Paulo, Brazil. Samples (blood, urine, oropharyngeal swab, explanted liver, product of conception and cerebrospinal fluid) were collected between 1997 and 2004 from patients with clinical symptoms of rubella. The rubella virus E1 gene coding region was amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction directly from clinical specimens and isolates, and the resulting DNA fragments were sequenced. Sequences were assigned to genotypes by phylogenetic analysis with rubella virus reference sequences. Twenty-nine isolates were obtained, including isolates from acute liver failure, encephalitis and congenital infections. Phylogenetic analysis showed that 19 out of 29 isolated in the São Paulo strains of rubella virus belonged to genotype 1a, and 10 strains to genotype 1G. This work demonstrated two genotypes of RV circulated simultaneously between years 1997 and 2004 in the state of São Paulo. The information reported in this paper may be useful for contributes to understand better the molecular epidemiology of RV in São Paulo, Brazil.

A rubéola é uma doença infecciosa aguda, normalmente com um curso clínico suave. Porém quando adquirida nas primeiras 12 semanas de gestação, pode causar severos defeitos de nascimento, conhecida como Síndrome da Rubéola Congênita (SRC). A caracterização genética do vírus da rubéola é feita analisando a seqüência da região hipervariável do gene da glicoproteína E1. Este estudo, apresenta a primeira caracterização molecular de do vírus da rubéola isolados no estado de São Paulo, Brasil. As amostras (sangue, urina, swab de orofaringe, explante de fígado, produto de aborto e fluido cerebrospinal) foram coletados entre 1997 e 2004 de pacientes com sintomas clínicos de rubéola. O gene E1 vírus da rubéola foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase em cadeia diretamente de espécimes clínicos e isolados, e os fragmentos de DNA obtidos foram seqüenciados. As seqüências foram alinhadas para a analise filogenética, com seqüências representativas dos diferentes genótipos do vírus da rubéola. Vinte e nove isolados foram obtidos, incluindo isolados relacionados com insuficiência hepática aguda, encefalite e infecções congênitas. A análise filogenética mostrou que 19 dos 29 virus da rubéola isolados pertencem ao genótipo 1a, e 10 pertencem ao genótipo 1G. Este trabalho demonstrou dois genótipos do vírus da rubéola circularam simultaneamente entre os anos de 1997-2004. / Rubella is an acute infectious disease with normally a mild clinical course. However, infections during pregnancy, especially before week 12 of gestation (WG), can cause severe birth defects known as congenital rubella syndrome (CRS). Genetic characterization of wild-type rubella virus is based on sequence analysis of a hypervariable region of the glycoprotein E1 gene. This study presents the first molecular characterization of isolates from São Paulo, Brazil. Samples (blood, urine, oropharyngeal swab, explanted liver, product of conception and cerebrospinal fluid) were collected between 1997 and 2004 from patients with clinical symptoms of rubella. The rubella virus E1 gene coding region was amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction directly from clinical specimens and isolates, and the resulting DNA fragments were sequenced. Sequences were assigned to genotypes by phylogenetic analysis with rubella virus reference sequences. Twenty-nine isolates were obtained, including isolates from acute liver failure, encephalitis and congenital infections. Phylogenetic analysis showed that 19 out of 29 isolated in the São Paulo strains of rubella virus belonged to genotype 1a, and 10 strains to genotype 1G. This work demonstrated two genotypes of RV circulated simultaneously between years 1997 and 2004 in the state of São Paulo. The information reported in this paper may be useful for contributes to understand better the molecular epidemiology of RV in São Paulo, Brazil.