Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / La protéine multifonctionnelle p54nrb , enrichie dans un nouveau domaine nucléaire nommé paraspeckles, fait partie de complexes de transcription/épissage comprenant l'ARN polymérase II et son partenaire PSF. Des travaux récents effectués dans notre laboratoire montrent que p54nrb est phosphorylée en mitose (Proteau A., Blier S., Albert A.L., Lavoie S.B., Traish A. M. and Vincent M. (2005) J. Mol. Biol. 346, 1163-1172). La phosphorylation est une modification post-traductionnelle pouvant affecter la localisation cellulaire d'une protéine, ses interactions, sa dégradation et son activité. Pour étudier l'impact de la phosphorylation mitotique de p54nrb , sa localisation cellulaire a été comparée en interphase et en mitose par immunofluorescence indirecte. Les résultats ont montré que la phosphorylation ne semble pas affecter sa localisation aux paraspeckles en mitose. Ensuite, ses interactions dans le complexe transcription/épissage ont été vérifiées en mitose par immunoprécipitation et pulldown. Les résultats ont montré que la phosphorylation ne semble pas affecter le complexe p54nrb-PSF-ARN polymérase II en mitose in vitro. Des analyses biochimiques ont finalement montré que la phosphorylation de p54nrb ne semble pas non plus empêcher son association à la matrice nucléaire. L'étude antérieure, citée précédemment, a également montré que p54nrb est reconnue par la peptidyl-prolyl isomérase Pinl en mitose. La juglone, un inhibiteur enzymatique de Pinl, a été utilisée pour évaluer l'effet de l'interaction de Pinl sur le niveau de phosphorylation de p54nrb . Les résultats ont montré que l'inhibition de Pinl empêche la déphosphorylation de p54nrb à la fin de la mitose ainsi que celle de PSF, nouveau substrat de Pinl. La protéine Pinl pourrait réguler chaque membre du complexe p54nrb-PSF-ARN polymérase II à la reprise du cycle cellulaire.

Dans certaines situations physiologiques et pathologiques, la concentration tissulaire en oxygène diminue grandement, créant ainsi une situation d'hypoxie. Heureusement, les cellules de mammifères possèdent un mécanisme de réponse efficace envers un stress hypoxique assuré par le facteur de transcription inductible par l'hypoxie, HIF-1. Le facteur HIF-1 est constitué de deux sous-unités : HIF-1β et HIF-1α. La sous-unité HIF-1β demeure invariable en fonction des niveaux d'oxygénation. En revanche, la sous-unité HIF-1 a est hautement régulée par les niveaux d'oxygénation. En normoxie, HIF-1α est rapidement hydroxylée par les prolyl-hydroxylases (PHD). L'hydroxylation de HIF-1α mène à sa reconnaissance par la protéine E3-ubiquitine ligase pVHL (von Hippel-Lindau protein), ciblant ainsi la protéine HIF-1 a ubiquitinylée vers la dégradation par le protéasome. À l'inverse, en hypoxie, l'hydroxylation de HIF-la est fortement diminuée, ce qui provoque la stabilisation de HIF-1α et la formation du dimère HIF-1 responsable de l'expression des gènes cibles impliqués dans la réponse adaptatrice des cellules à l'hypoxie. Outre l'hydroxylation et l'ubiquitinylation, la sous-unité a subie également plusieurs autres modifications telles que la phosphorylation, la sumoylation et la S-nitrosylation. Les travaux présentés dans cette thèse visent à démontrer l'impact de nouvelles modifications post-traductionnelles de HIF-1α sur l'activité du facteur HIF-1. Dans un premier temps, des travaux portant sur l'acétylation de la sous-unité HIF-1α par l'acetyltransferase ARD1 (Arrest-defective-1) seront présentés. En 2002, une étude démontrait que la protéine ARD1 était responsable de l'acétylation de HIF-1α, contribuant ainsi à son association avec pVHL et à sa dégradation. Cependant, nos travaux démontrent plutôt qu'ARDl n'est pas impliquée dans la stabilité de HIF-1α. Dans un deuxième temps, nous démontrons un rôle clé de la peptidyl-prolyl isomérase PIN1 sur l'activité transcriptionnelle du facteur HIF-1 et l'expression d'un gène cible important, le facteur de croissance des cellules endothéliales vasculaires (VEGF). Finalement, nous présentons des travaux impliquant la methylation de HIF-1α et le rôle important de cette modification sur l'activité du facteur HIF-1. Bref, l'étude de nouvelles modifications de la protéine HIF-1α s'avère donc fondamentale pour la compréhension de la régulation de HIF-1, tant au niveau des fonctions physiologiques et pathologiques importantes de HIF-1 qu'au niveau du développement de stratégie thérapeutique.

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) représentent, dans nos contrées, une cause importante de handicap et de mortalité. Les approches thérapeutiques restent toutefois relativement impuissantes face à ce problème de santé publique. Elles reposent essentiellement sur la prévention ou la suppression de facteurs de risques tels que le tabagisme, l'hypertension ou encore l'hypercholestérolémie. L'AVC peut être hémorragique, mais dans 80% des cas son origine vasculaire est obstructive. Son traitement aigu peut dans ce cas bénéficier d'agents thrombolytiques dont l'administration est cependant soumise à une fenêtre d'intervention immédiate relativement étroite. L'efficacité d'agents neuroprotecteurs, dont la finalité est de protéger le cerveau des conséquences délétères de l'ischémie/reperfusion cérébrale inhérente à l'AVC (lésions irréversibles et handicap), reste aujourd'hui assez décevante.<br>La recherche de nouvelles cibles thérapeutiques s'impose dès lors plus que jamais dans ce domaine. S'intéressant aux protéines dont la concentration peut varier au cours du temps, une étude protéomique préliminaire a mis en évidence l'augmentation de la protéine disulfure isomérase (PDI) au cours de l'ischémie reperfusion cérébrale (IRC), un résultat en accord avec les données de la littérature (Tanaka, S., Uehara, T., Nomura, Y., 2000, J. Biol. Chem. 275, 10388-10393). La PDI est une protéine chaperonne dotée d'une activité oxydoréductase/isomérase et est principalement localisée dans le réticulum endoplasmique. Elle assiste le repliement des protéines par la formation ou le déplacement de ponts disulfures.<br>Les agents modulateurs de la PDI incluent l'alcool 4-hydroxybenzylique<br>(4-HBA) et la bacitracine, respectivement inducteur et inhibiteur de cette protéine. Pour déterminer le rôle potentiellement bénéfique ou délétère de la PDI dans l'IRC, l'impact cérébral des modulateurs précités a été étudié dans un modèle murin d'IRC basé sur l'occlusion unilatérale et transitoire de l'artère cérébrale moyenne chez la souris. Dans ce modèle expérimental, le 4-HBA réduit significativement (respectivement de 22 et 55%). la taille de l'infarctus cérébral touchant le cortex et le striatum. L'implication de la PDI dans cette protection cérébrale est confirmée par la suppression de l'effet protecteur du 4-HBA par la bacitracine, le 4-HBA ne manifestant par ailleurs aucune propriété anti-oedémateuse dans le modèle expérimental d'IRC. L'induction de la PDI par le 4-HBA a elle été démontrée sur le cerveau sain de souris, la protéine étant quantifiée par immuno-chemiluminescence après migration électrophorétique (Western blots). Différents isomères de position (alcool 2-hydroxybenzylique et alcool 3-hydroxybenzylique) ainsi que des analogues aliphatiques (1,4-butanediol et 1,5-pentanediol) du 4-HBA se sont avérés, à l'inverse du dernier, incapables de réduire la taille des lésions cérébrales dans le modèle expérimental d'IRC et d'induire la PDI cérébrale.<br>Le potentiel neuroprotecteur du 4-HBA a été étudié dans un autre modèle d'évaluation, à savoir celui des crises audiogènes chez la souris déficiente en magnésium, connu pour sa réponse aux agents anticonvulsivants mais aussi aux composés antioxydants (Vamecq, J., Maurois, P., Bac, P., Bailly, F., Bernier, J.L., Stables, J.P., Husson, I.,Gressens, P., 2003, Eur. J. Neurosci. 18, 1110-1120). La dose de 4-HBA protégeant 50% des animaux vis-à-vis de la crise audiogène était de 25 mg/kg contre 35mg/kg pour la 6-hydroxyflavanone (6-HFN), une flavone de référence active dans ce test. Ces résultats suggérant un potentiel antioxydant similaire des deux composés ont conduit à une étude comparative de leurs effets protecteurs dans le modèle murin d'IRC. Cette étude tout en confirmant la protection offerte par le 4-HBA dans l'IRC expérimentale a révélé l'incapacité du 6-HFN d'induire une protection significative dans ce modèle. A l'inverse du 4-HBA, le 6-HFN n'induisait pas la PDI cérébrale murine, confortant ici l'hypothèse que la protection du 4-HBA vis-à-vis de l'IRC résulte plus de sa capacité à induire la PDI que d'autres de ses propriétés parmi lesquelles son potentiel antioxydant. Finalement, le 4-HBA, à des doses atteignant 200 mg/kg, s'est avéré dénué de toxicité dans le test de la barre tournante.<br>En conclusion, le 4-HBA représente un agent neuroprotecteur actif dans plusieurs modèles d'évaluation. Son efficacité vis-à-vis des lésions induites par l'IRC semble étroitement liée à sa capacité à induire la PDI cérébrale, faisant dès lors de cette protéine une cible pharmacologique prometteuse pour le développement pharmacologique de composés actifs dans l'AVC.

Les réactions de phosphorylation / déphosphorylation chez les bactéries régulent plusieurs fonctions cellulaires telles que croissance, différenciation, pathogénie, résistance aux antibiotiques, réponse au stress, formation des biofilms ainsi que plusieurs processus impliqués dans le métabolisme secondaire. Cependant, les signaux qui déclenchent la cascade de signalisation par phosphorylation/déphosphorylation intracellulaire restent encore peu connus. Staphylococcus aureus est une bactérie à Gram-positif pathogène pour l‟homme. Elle est l‟une des principales causes des infections nosocomiales et ce pathogène opportuniste est capable de provoquer de multiples infections allant du furoncle à la septicémie. Nos études se sont basées sur la caractérisation aux niveaux structural et fonctionnel de deux protéines de cette bactérie : une sérine/thréonine kinase nommée Stk1 ainsi que l‟un de ses substrats, la triose phosphate isomérase. Stk1 a déjà été identifiée comme responsable de la phosphorylation de plusieurs enzymes impliquées dans le métabolisme central de la bactérie ainsi que dans les phénomènes de virulence et de résistance à l‟antibiotique phosphomycine. Cependant, à ce jour, aucune caractérisation structurale n‟a été conduite sur cette kinase. Nous avons ainsi mené une étude cristallographique de plusieurs domaines de cette protéine et nous présentons, plus particulièrement, la structure de trois domaines extracellulaires dits « PASTA », ainsi qu‟un modèle tridimensionnel de la protéine entière. Les domaines PASTA sont spécifiques des Ser/Thr kinases et des Penicillin-Binding Proteins et sont impliqués dans la synthèse du peptidoglycane. Par conséquent, la connaissance de la structure de ces domaines chez Stk1 pourrait servir de base à la conception rationnelle de nouveaux inhibiteurs à visée thérapeutique. Enfin, nous avons démontré que l‟activité de l‟un des substrats de Stk1, la triose phosphate isomérase, était régulée par phosphorylation / déphosphorylation, et nous avons décrit le mécanisme qui contrôle son activation/inactivation réversible. / The phosphorylation /dephosphorylation reactions in bacteria regulate various cellular functions such as growth, differentiation, pathogenicity, antibiotic resistance, stress response, biofilm formation as well as several processes involved in secondary metabolism. However, detailed understanding of their complete signaling pathways induced by phosphorylation/dephosphorylation is still unclear. Staphylococcus aureus is a Gram-positive bacterium and a human pathogen. It is one of the primary causes of nosocomial infections and this opportunist pathogen is able to cause multiple infections ranging from furuncle to septicemia. This study is focused on the structural and functional characterizations of two proteins from this bacterium: the serine/threonine kinase Stk1 and one of its substrates, the triose phosphate isomerase. Stk1 has been previously identified as responsible for the phosphorylation of several enzymes involved in the central metabolism of this bacterium as well as virulence and resistance to the antibiotic phosphomycin. However, no structural characterization has been done to date. We have performed a crystallographic study of several domains of this protein. We now present the structure of three extracellular domains designated “PASTA” in addition to the 3D molecular model of the entire protein. PASTA domains are specific to bacterial Ser/Thr kinases and to Penicillin-Binding Proteins which are involved in the peptidoglycan synthesis. Thus, the structural knowledge of PASTA domains from Stk1 could be of particular interest in the rational drug-design of new inhibitors with therapeutic aims. Finally, we have demonstrated that triose phosphate isomerase activity is regulated by phosphorylation/dephosphorylation and we have described the reversible activation/inactivation mechanism.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La phosphorylation constitue un mécanisme de régulation de la fonction biologique des protéines lié au contrôle des associations inter-moléculaires, de l'activité enzymatique ou de la liaison de ligands. L'isomérisation des liaisons Ser/Thr-Pro après phosphorylation par des kinases spécifiques, souvent impliquées dans le contrôle du cycle cellulaire, se présente comme un nouveau mode de régulation. Ces deux mécanismes de signalisation sont étroitement liés par l'intermédiaire d'enzymes catalysant l'isomérisation cis/trans des prolines au niveau de motifs Ser/Thr-Pro phosphorylés telles que les peptidyl-prolyl cis/trans isomérases de la famille de Pin1. Elles jouent un rôle cellulaire essentiel mais leur rôle moléculaire exact est encore mal connu. Les interactions moléculaires entre Pin1 et de nombreuses phospho-protéines mitotiques indiquent un rôle dans la régulation du cycle cellulaire et dans l'oncogénèse, et font de Pin1 une cible pharmacologique émergente dans le traitement des cancers. Récemment, des interactions avec la protéine microtubulaire Tau dans sa forme pathologique hyperphosphorylée, au niveau d'un site unique centré autour du motif Thr231-Pro232, pourraient impliquer Pin1 dans la régulation de la liaison de Tau aux microtubules et dans les phénomènes de neurodégénérescence observés dans la maladie d'Alzheimer.<br /><br />Nous avons ciblé les interactions entre Pin1 et la protéine Tau comme modèle de substrats pour une étude détaillée des mécanismes intervenant à l'échelle moléculaire, sur base de substrats peptidiques, qui permettraient d'expliquer le rôle fonctionnel de Pin1. L'interaction avec les substrats au travers des motifs Ser/Thr-Pro phosphorylés est double : un domaine de liaison WW permet la liaison du substrat et un domaine catalytique PPIase (peptidyl-prolyl isomérase) catalyse l'isomérisation cis/trans des prolines. Un criblage par RMN des différents motifs phospho-Ser/Thr-Pro au sein de la protéine Tau a permis de déterminer un nouveau site d'interaction centré autour du motif Thr212-Pro213, phosphorylé uniquement dans la forme pathologique de Tau. <br /><br />Nous avons étendu l'investigation des interactions avec Pin1 à l'échelle de la protéine Tau entière. Comme pour la plupart des régions protéiques impliquées dans les interactions avec Pin1, la protéine Tau se caractérise par une absence de structure globale qui limite considérablement les études par RMN. Un fragment peptidique de 40 acides aminés comprenant les sites Thr231 et Thr212 phosphorylés a permis de montrer un rôle régulateur du domaine WW dans l'activité enzymatique. Une première étude avec une protéine mutante mimant l'état phosphorylé de Tau a montré une interaction avec le domaine catalytique de Pin1 et a nécessité la mise au point préalable d'une technique d'attribution de la protéine Tau par RMN que nous avons appelé « mapping peptidique ».<br /><br />La phosphorylation du domaine WW de Pin1 est associée à l'inhibition de la liaison des substrats et joue un rôle dans la régulation de l'activité de Pin1 in vivo. La forme non phosphorylée active de Pin1 est retrouvée majoritairement dans les cellules cancéreuses et la forme phosphorylée inactive dans les cellules saines. Nous avons envisagé de cibler les interactions entre Pin1 et les phospho-peptides avec la synthèse de molécules organiques mimant le dipeptide phosphoThr-Pro et la mise en œuvre d'un test de criblage par RMN pour l'obtention d'inhibiteurs ciblant le domaine WW de Pin1 qui pourraient mimer la forme inactive de la protéine.

Les aldose-cétose isomérases sont des enzymes catalysant l’isomérisation réversible entre un aldose et un cétose. Nous avons étudiés trois d’entre-elles : les phosphoribose isomérases (RPI), les phosphomannose isomérases (PMI) et les phosphoglucose isomérases (PGI). Ces enzymes interviennent dans différentes voies métaboliques comme la glycolyse, la néoglucogenèse, la voie des pentoses phosphates ou le métabolisme du mannose. Il a été montré qu’elles jouent un rôle important pour assurer la survie et le développement de plusieurs parasites responsables de maladies comme la leishmaniose, la mucoviscidose, la tuberculose, le paludisme ou la maladie du sommeil. Ces enzymes sont donc des cibles thérapeutiques potentielles. Ainsi, les puissants inhibiteurs de ces enzymes peuvent donc être des agents thérapeutiques efficaces pour combattre ces maladies. Les réactions catalysées par ces enzymes impliquent des intermédiaires de haute énergie (IHE) de type 1,2-cis-ènediol(ate). La synthèse d’analogues de ces intermédiaires a permis d’obtenir au laboratoire, les meilleurs inhibiteurs connus de ces enzymes, l’acide 5-phospho-D-arabononohydroxamique (5PAH, meilleur inhibiteur des PMI et PGI) et le 5-phospho-D-ribonate (5PRA, meilleur inhibiteur des RPI). Cependant, ces inhibiteurs possèdent une fonction phosphate facilement hydrolysable en milieu physiologique. Ce qui les rend inactifs in vivo. Au cours de ce travail de thèse, des phosphoanalogues du 5PAH, du 5-phospho-D-ribose (R5P, le substrat des RPI) et du 5PRA possédant une fonction malonate, phosphonate, phosphorothiate, sulfate et sulfonate à la place de la fonction phosphate ont été obtenus par des voies de synthèse multi-étapes faisant intervenir le D-arabinose ou le D-ribose comme produit de départ. Les propriétés inhibitrices de ces composés ont ensuite été déterminées et leur stabilité en milieu physiologique évaluée. Le phosphoanalogue du 5PAH de type malonate, l’acide 5-désoxy-5-dicarboxyméthyl-D-arabinonohydroxamique (5DCAH) est un inhibiteur moyen et stable de la PMI d’Escherichia Coli. Parmi les phosphoanalogues du R5P, les composés de type sulfate et sulfonate, respectivement, le 5-sulfate-D-ribose (5SR) et 5-désoxy-5-sulfonométhyl-D-ribose (5SMR) sont de bons inhibiteurs de trois RPI (la RPI d’épinard, la RPI d’Escherichia Coli et la RPI de Micobacterium tuberculosis). Seul le composé de type sulfonate est stable en milieu physiologique. Le phosphoanalogue de type malonate, le 5-désoxy-5-dicarboxyméthyl-D-ribose (5DCR) est un inhibiteur moyen de ces trois RPI. En revanche, les phosphoanalogues de type phosphorothioate et phosphonate, respectivement, le 5-désoxy-5-phosphorothioate-D-ribose (5PTR) et 5-désoxy-5-phosphonométhyl-D-ribose (5PMR) sont de mauvais inhibiteurs. Le phosphoanalogue de type phosphonate du 5PRA, le 5-désoxy-5-phosphonométhyl-D-ribonate (5PMRA) est un bon inhibiteur de la RPI de Micobacterium tuberculosis. De plus, ce composé est stable en milieu physiologique. Il est en revanche un mauvais inhibiteur de la RPI d’épinard et d’Escherichia Coli. Ces résultats sont particulièrement prometteurs puisque le 5PMRA est à ce jour le meilleur inhibiteur stable et spécifique de la RPI de Micobacterium tuberculosis. / Aldose-ketose isomerases are enzymes which catalyze the interconversion of an aldose and a ketose. We have studied three of them: phosphoribose isomerase (RPI), phosphomannose isomerase (PMI) and phosphoglucose isomerase (PGI). These enzymes play a major role in various metabolic pathways as glycolysis, neoglucogenesis, the pentoses phosphates pathways or the mannose metabolism. It has been shown to have a crucial role for the survival and development of several microorganisms responsible for diseases as the leishmaniose, the cystic fibrosis, the tuberculosis, the malaria or the insomnia. These enzymes are thus potential therapeutic targets. Consequently, strong inhibitors of these enzymes could provide efficient therapeutic tools against these deseases. The reactions catalyzed by these enzymes involve intermediaries of high energy (IHE) of 1,2-cis-enediol(ate) type. The synthesis of analogues of these intermediaries allowed to obtain in the laboratory, the best inhibitors known for these enzymes, the acid 5-phospho-D-arabononohydroxamique (5PAH, the best inhibitor of the PMI and PGI) and the 5-phospho-D-ribonate (5PRA, the best inhibitor of the RPI). However, these inhibitors possess a phosphate group which is easily hydrolysable in physiological environment, what makes them inactive in vivo. During this work of thesis, phosphoanalogues of the 5PAH, the 5-phospho-D-ribose (R5P, the substrate of the RPI) and of the 5PRA possessing a malonate, phosphonate, phosphorothiate, sulphate and sulfonate were obtained by multi-steps synthesis bringing in D-arabinose or D-ribose as starting product. The inhibitive properties of these compounds were then determined and their stability in physiological environment evaluated. The phosphoanalogue of the 5PAH of malonate type, the acid 5-desoxy-5-dicarboxyméthyl-D-arabinonohydroxamique (5DCAH) is a modest and stable inhibitor of the PMI of Escherichia Coli. Among the phosphoanalogues of the R5P, the compounds of sulphate and sulfonate types, respectively, the 5-sulfate-D-ribose (5SR) and 5-desoxy-sulfonomethyl-D-ribose (5SMR), are good inhibitors of three RPI (the RPI of spinach, the RPI of Escherichia Coli and the RPI of Micobacterium tuberculosis). Only the compound of sulfonate type is stable in physiological environment. The phosphoanalogue of malonate type, the 5-desoxy-5-dicarboxymethyl-D-ribose (5DCR) is a modest inhibitor of this three RPI. On the other hand, the phosphoanalogues of phosphorothioate and phosphonate types, respectively, the 5-desoxy-5-phosphorothioate-D-ribose (5PTR) and the 5-desoxy-5-phosphonomethyl-D-ribose (5PMR), are bad inhibitors. The phosphoanalogue of phosphonate type of the 5PRA, the 5-desoxy-5-phosphonomethyl-D-ribonate (5PMRA), is a good inhibitor of the RPI of Micobacterium tuberculosis. Furthermore, this compound is stable in physiological environment. It is on the other hand a bad inhibitor of the RPI of spinach and Escherichia Coli. These results are particularly promising because the 5PMRA is this day the best stable and specific inhibitor of the RPI of Micobacterium tuberculosis.

La formation de ponts disulfure constitue une modification post-traductionnelle des protéines importante pour de nombreux processus physiologiques, jouant un rôle particulier dans le repliement, la catalyse et la régulation de leur activité. Ce travail concerne l'étude des relations structure-fonction d'oxydoréductases de peuplier appartenant à deux familles de la superfamille des thiorédoxines, les glutathion peroxydases (Gpxs) et les protéine disulfure isomérases (PDIs).L'étude biochimique fine de la Gpx5 a permis de montrer que cette peroxydase réduit le peroxynitrite, propriété inconnue pour ce type de Gpx et de détailler plusieurs étapes du mécanisme catalytique (formation de l'acide sulfénique, changement structural entre formes réduites et oxydées, régénération par les Trxs). La dimérisation de la Gpx5 n'est pas requise pour son activité mais pourrait jouer un rôle dans la reconnaissance de certains substrats. Enfin, l'inactivation de la cystéine peroxydatique par suroxydation suggère que les Gpxs pourraient également avoir une fonction dans la signalisation en réponse aux peroxydes.Concernant les PDIs, suite à une analyse phylogénétique détaillée amenant à proposer une nouvelle classification en 9 classes chez les organismes photosynthétiques, la caractérisation biochimique de plusieurs isoformes présentant des organisations modulaires distinctes et appartenant à trois classes de PDIs a été entreprise. Aucune activité enzymatique typique n'a été identifiée pour la PDI-A, alors que les PDI-L1a et -M possèdent à la fois une activité oxydase et réductase. Les deux modules a de la PDI-M catalysent des réactions spécifiques, de réduction ou d'oxydation. / Protein activity and folding can be regulated by post-translational modifications that can impact on their physiological functions. One of these is the formation/reduction of disulfide bridges. The aim of the present work is to study the structure-function relationship of protein members of the thioredoxin superfamily, the protein disulfide isomerases (PDI) and the glutathione peroxidases (Gpx).A precise biochemical study has allowed us to demonstrate that this enzyme is an efficient peroxynitrite scavenger, a new finding for this type of protein and allowed investigating several steps of the Gpx5 catalytic mechanism (i.e. sulfenic acid formation, structural changes between reduce dand oxidized forms, Trx-mediated recycling). We also demonstrate that the dimer form of Gpx5 is not absolutely required for peroxide reduction but probably involved in peroxide specificity. Finally, the capability of the peroxidatic cysteine to be overoxidized brings some new clues in favor of an additional signaling function for Gpx5.Concerning PDIs, a detailed phylogenetic analysis of photosynthetic organisms allowed us to identify 9 classes of PDIs and to propose a new nomenclature that fits all these organisms. The biochemical characterization of isoforms of interest has allowed us to highlight some specificity of PDI-L1a and PDI-M in terms of reduction or oxidation reactions catalyzed. A detailed analysis of PDI-M isoform also indicates that the two Trx modules of this protein show differential oxidation or reduction capacities. We could not detect any activity for PDI-A isoforms, leaving us to wonder whether this enzyme is simply active or possesses highly specific protein partners.

La phophomannose isomérase de type I (PMI), une métalloenzyme à zinc, et la phosphoglucose isomérase (PGI), catalysent l’isomérisation réversible du β-D-fructose-6-phosphate (F6P), respectivement en β-D-mannose-6-phosphate (M6P) et en α-D-glucose-6-phosphate (G6P). Ces deux enzymes sont des cibles thérapeutiques potentielles. La phosphoglucose isomérase humaine (hPGI), connu également sous le nom de facteur de motilité autocrine (AMF), stimule, en plus de son activité glycolytique intracellulaire, la migration des cellules in vitro et le développement de métastases in vivo. D'autre part, Candida albicans est la principale levure impliquée en pathologie humaine. Ces dernières années, un problème de résistance du germe aux antifongiques classiques est apparu. En conséquence, la recherche se dirige vers de nouvelles cibles thérapeutiques, dont la PMI de C. albicans (CaPMI) qui joue un rôle important dans la biosynthèse de structures mannosylées nécessaires à la survie du pathogène. Les réactions catalysées par ces deux enzymes mettent en jeu le même intermédiaire de haute énergie (IHE) de type 1,2-cis-ènediolate, sauf qu’il est coordiné au zinc dans le cas de la PMI. La surexpression ainsi que la purification de CaPMI et de hPGI ont été réalisées au laboratoire. Une petite chimiothèque a été créée à partir du 5-phospho-D-arabinono-1,4-lactone (5-PAL) en modulant la partie tête de l’IHE. Un groupe chélatant du zinc (zinc binding group, ZBG) a été introduit dans plusieurs composés dans le but d’inhiber sélectivement CaPMI. De plus, deux composés possédant en partie tête une fonction amine terminale ont été synthétisés pour inhiber spécifiquement la PGI humaine en ciblant un résidu glutamate du site actif de l'enzyme (Glu357). Toutes ces molécules ont d’abord été testées sur la PGI du muscle de lapin et la PMI de E. coli commerciales, et par la suite sur la CaPMI et la hPGI surexprimées. Une série de bons voire très bons inhibiteurs de hPGI, et donc potentiellement anti-métastatiques, a été découverte. Ces composés ne sont cependant pas inhibiteurs de la CaPMI. Deux structures tridimensionnelles à haute résolution de complexes enzyme-inhibiteur ont été obtenues. Au delà des aspects thérapeutiques, mécanistiques et structuraux, un biocapteur électrochimique à base d'un des inhibiteurs synthétisés a été réalisé pour la détection de hPGI qui est un biomarqueur validé de cancers métastatiques. Ce biocapteur a démontré une limite de détection de 43 fM dans du tampon phosphate (PBS). / Phosphoglucose isomerase (PGI) and type I phosphomannose isomerase (PMI), a zinc metalloenzyme, catalyze the reversible isomerization of β-D-fructose 6-phosphate (F6P) to α-D-glucose 6-phosphate (G6P) and β-D-mannose 6-phosphate (M6P), respectively. These two enzymes are potential therapeutic targets. Human PGI (hPGI) often called as AMF-PGI (autocrine motility factor-PGI), in addition to its intracellular glycolytic activity, stimulates cell migration in vitro and metastasis in vivo. Inhibition of its extracellular activity is obviously interesting in oncology. On the other hand, Candida albicans is the main yeast involved in human pathology. During recent years, resistance of this pathogenic fungus to conventional antifungal drugs appeared. Consequently, research is moving towards new therapeutic targets, including C. albicans PMI (CaPMI) that plays an important role in the biosynthesis of mannosylated structures required for pathogen survival. The reactions catalyzed by these two enzymes involve the same high energy intermediate (HEI) type 1,2-cis-enediolate, except that it is coordinated to the zinc active site in the case of PMI. Overexpression and purification of both CaPMI and hPGI were performed in our laboratory. A small chemical library was created from the synthon 5-phospho-D-arabinono-1,4-lactone (5-PAL) by modulating the head part of the HEI. A zinc binding group (ZBG) was introduced in several compounds in order to selectively inhibit the CaPMI enzyme. Moreover, two compounds with a terminal amine function were designed to selectively inhibit hPGI by targeting a glutamate residue of the enzyme (Glu357). All these molecules were first tested on rabbit muscle PGI and PMI from E. coli, and later on CaPMI and hPGI. None of these compounds are good inhibitors of CaPMI. However, a series of strong inhibitors of hPGI, and therefore potentially anti-metastatic drugs, was discovered. High-resolved 3D structures of the two enzymes complexed with inhibitors have been successfully obtained. Beyond the therapeutic, mechanistic and structural aspects, an electrochemical biosensor based on one of the synthesized inhibitors was carried out for the detection of hPGI, which is a validated biomarker of metastatic cancers. This biosensor demonstrated a detection limit of 43 fM in phosphate buffer (PBS).

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