6 Zusammenfassung Marianne Reinboth Bioverfügbarkeit des Flavonols Quercetin beim Hund Veterinär-Physiologisches Institut der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Eingereicht im Juni 2010 79 Seiten, 20 Abbildungen, 6 Tabellen, 211 Literaturangaben, 1 Anhang Schlüsselwörter: Quercetin, Bioverfügbarkeit, Hund, absolute Bioverfügbarkeit, Isoquercitrin, Rutin, Flavonole Für das pflanzliche Flavonol Quercetin werden vielfältige gesundheitsfördernde Wirkungen postuliert, so auch bei Hunden. Über die Bioverfügbarkeit des Flavonols bei dieser Spezies liegen bislang jedoch keinerlei Daten vor. Daher hatte diese Arbeit das Ziel, Bioverfügbarkeit und pharmakokinetische Parameter von Quercetin und wichtigen Quercetinglycosiden bei Hunden nach deren Verabreichung mit einer Testmahlzeit in einer praxisrelevanten Dosierung von 10 mg/kg Körpermasse zu untersuchen. Dazu erhielten 9 adulte Beagles beiderlei Geschlechts das zuckerfreie \"Aglycon\" Quercetin bzw. seine Glycoside Isoquercitrin (Quercetin-3-O-Glucosid) und Rutin (Quercetin-3-O-Glucorhamnosid) in jeweils äquimolarer Dosierung in einer Testmahlzeit verabreicht. Anschließend wurden Blutproben über einen Zeitraum von bis zu 72 Stunden entnommen und mittels HPLC die Konzentrations-Zeitverläufe der Metaboliten im Blutplasma, die Bioverfügbarkeit sowie weitere pharmakokinetische Parameter bestimmt. Weiterhin wurde die absolute Bioverfügbarkeit von Quercetin aus dem Vergleich einer oralen mit einer intravenösen Applikation bestimmt. Der weitaus größte Teil der Plasmametaboliten von Quercetin sowie seiner beiden Glycoside bestand aus glucuronidierten bzw. sulfatierten Quercetinkonjugaten. Nicht konjugiertes Quercetin-Aglycon kam nur in einem Anteil von etwa 20 % vor. Neben Quercetin machten seine Metaboliten Isorhamnetin und Kämpferol weniger als 10 % aller im Plasma zirkulierenden Flavonole aus. Die absolute Bioverfügbarkeit von Quercetin betrug nur etwa 4 %. Die relative Bioverfügbarkeit aus dem 3-O-Glucosid Isoquercitrin war mehr als doppelt so hoch wie aus dem Aglycon, die maximalen Plasmaspiegel lagen aber auch hier unter 1 µmol/l. Sowohl nach Aufnahme von Quercetin als auch nach Isoquercitrin kam es zu einer relativ schnellen Absorption aus dem Dünndarm mit einem ersten Plasmapeak ungefähr eine Stunde nach der Ingestion. Vier Stunden nach Aufnahme der beiden Flavonole trat ein zweiter Plasmapeak auf, der in der Regel höher als der erste ausfiel. Dies deutet auf einen enterohepatischen Kreislauf der über die Galle ausgeschiedenen Metaboliten hin. Nach Aufnahme von Rutin kam es zu einer verzögerten Absorption, da eine Deglycosylierung durch bakterielle Glycosidasen im Dickdarm Voraussetzung für die Absorption des Flavonols ist. Maximale Plasmakonzentrationen wurden im Mittel erst 11 Stunden nach Ingestion dieses Glycosids erreicht. Die maximalen Plasmakonzentra-tionen nach Rutin waren geringer als nach Quercetin oder Isoquercitrin, jedoch war die mittlere Verweildauer der Plasmametaboliten mit 18 Stunden auch wesentlich länger. Im Unterschied zu anderen Spezies war die relative Bioverfügbarkeit von Rutin gegenüber Quercetin nicht verringert. Obwohl Rutin eine relativ gute Quercetinquelle für Hunde zu sein scheint, muss bei der Einschätzung möglicher In-vivo-Wirkungen die relativ geringe Bioverfügbarkeit sowie die intensive Metabolisierung seines Aglycons Quercetin berücksichtigt werden. / 7 Summary Marianne Reinboth Bioavailability of the Flavonol Quercetin in Dogs Institute of Physiology of the Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig Submitted in June 2010 79 pages, 20 figures, 6 tables, 211 references, 1 appendix Keywords: quercetin, bioavailability, dog, absolute bioavailability, isoquercitrin, rutin, flavonols The plant flavonol quercetin is supposed to exert multiple health-related effects in dogs. To date no information on its bioavailability in this particular species is avai-lable. This study intended to investigate bioavailability and pharmacokinetics of quercetin and certain quercetin glycosides in dogs after ingestion of a test meal sup-plemented with a quercetin dose equivalent to 10 mg/kg body weight. Nine adult beagle dogs of both sexes received the aglycon quercetin (sugarfree) or its glycosides isoquercitrin (quercetin-3-O-glucoside) and rutin (quercetin-3-O-glucorhamnoside) in equimolar amounts together with a test meal. Blood samples were taken over a period of up to 72 hours; bioavailability and pharmacokinetics were calculated from the HPLC-derived plasmaconcentration-time-curves. Absolute bioavailability was calculated by comparing an oral to an intravenous administration of quercetin. The majority of analysed plasma metabolites were glucuronidated and sulfated con-jugates of quercetin. Non-conjugated quercetin aglycon comprised only 20 %. Be-sides quercetin, its metabolites isorhamnetin and kaempferol made up less than 10 % of all circulating metabolites. The absolute bioavailability of quercetin was only 4 %. The relative bioavailability of quercetin from isoquercitrin was more than twice as high than from the aglycon, but even there maximal plasma concentrations were generally less than 1 μmol/l. Absorption from the small intestine was rather fast with a first plasma peak after 1 hour after ingestion of quercetin or isoquercitrin. A second, generally higher plasma peak occurred 4 hours after ingestion. This suggests an in-tensive enterohepatic recycling of biliary secreted metabolites. Absorption was significantly delayed after ingestion of rutin due to the necessity of bacterial deglycosilation in the large intestine. Plasma concentrations peaked only after 11 hours. Plasma concentrations after rutin were lower than after quercetin or isoquercitrin, but mean residence time of plasma metabolites was as long as 18 hours after rutin ingestion. Consequently, a once daily feeding of dogs with rutin might lead to relatively constant plasma metabolite concentrations. In contrast to other species, bioavailability from rutin was not smaller than that from quercetin. Although rutin seems to be a relative good quercetin source for dogs, estimations about potential in-vivo-effects of quercetin have to take into consideration its low bioavailabilty and intensive metabolism.

6 Zusammenfassung Marianne Reinboth Bioverfügbarkeit des Flavonols Quercetin beim Hund Veterinär-Physiologisches Institut der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Eingereicht im Juni 2010 79 Seiten, 20 Abbildungen, 6 Tabellen, 211 Literaturangaben, 1 Anhang Schlüsselwörter: Quercetin, Bioverfügbarkeit, Hund, absolute Bioverfügbarkeit, Isoquercitrin, Rutin, Flavonole Für das pflanzliche Flavonol Quercetin werden vielfältige gesundheitsfördernde Wirkungen postuliert, so auch bei Hunden. Über die Bioverfügbarkeit des Flavonols bei dieser Spezies liegen bislang jedoch keinerlei Daten vor. Daher hatte diese Arbeit das Ziel, Bioverfügbarkeit und pharmakokinetische Parameter von Quercetin und wichtigen Quercetinglycosiden bei Hunden nach deren Verabreichung mit einer Testmahlzeit in einer praxisrelevanten Dosierung von 10 mg/kg Körpermasse zu untersuchen. Dazu erhielten 9 adulte Beagles beiderlei Geschlechts das zuckerfreie \"Aglycon\" Quercetin bzw. seine Glycoside Isoquercitrin (Quercetin-3-O-Glucosid) und Rutin (Quercetin-3-O-Glucorhamnosid) in jeweils äquimolarer Dosierung in einer Testmahlzeit verabreicht. Anschließend wurden Blutproben über einen Zeitraum von bis zu 72 Stunden entnommen und mittels HPLC die Konzentrations-Zeitverläufe der Metaboliten im Blutplasma, die Bioverfügbarkeit sowie weitere pharmakokinetische Parameter bestimmt. Weiterhin wurde die absolute Bioverfügbarkeit von Quercetin aus dem Vergleich einer oralen mit einer intravenösen Applikation bestimmt. Der weitaus größte Teil der Plasmametaboliten von Quercetin sowie seiner beiden Glycoside bestand aus glucuronidierten bzw. sulfatierten Quercetinkonjugaten. Nicht konjugiertes Quercetin-Aglycon kam nur in einem Anteil von etwa 20 % vor. Neben Quercetin machten seine Metaboliten Isorhamnetin und Kämpferol weniger als 10 % aller im Plasma zirkulierenden Flavonole aus. Die absolute Bioverfügbarkeit von Quercetin betrug nur etwa 4 %. Die relative Bioverfügbarkeit aus dem 3-O-Glucosid Isoquercitrin war mehr als doppelt so hoch wie aus dem Aglycon, die maximalen Plasmaspiegel lagen aber auch hier unter 1 µmol/l. Sowohl nach Aufnahme von Quercetin als auch nach Isoquercitrin kam es zu einer relativ schnellen Absorption aus dem Dünndarm mit einem ersten Plasmapeak ungefähr eine Stunde nach der Ingestion. Vier Stunden nach Aufnahme der beiden Flavonole trat ein zweiter Plasmapeak auf, der in der Regel höher als der erste ausfiel. Dies deutet auf einen enterohepatischen Kreislauf der über die Galle ausgeschiedenen Metaboliten hin. Nach Aufnahme von Rutin kam es zu einer verzögerten Absorption, da eine Deglycosylierung durch bakterielle Glycosidasen im Dickdarm Voraussetzung für die Absorption des Flavonols ist. Maximale Plasmakonzentrationen wurden im Mittel erst 11 Stunden nach Ingestion dieses Glycosids erreicht. Die maximalen Plasmakonzentra-tionen nach Rutin waren geringer als nach Quercetin oder Isoquercitrin, jedoch war die mittlere Verweildauer der Plasmametaboliten mit 18 Stunden auch wesentlich länger. Im Unterschied zu anderen Spezies war die relative Bioverfügbarkeit von Rutin gegenüber Quercetin nicht verringert. Obwohl Rutin eine relativ gute Quercetinquelle für Hunde zu sein scheint, muss bei der Einschätzung möglicher In-vivo-Wirkungen die relativ geringe Bioverfügbarkeit sowie die intensive Metabolisierung seines Aglycons Quercetin berücksichtigt werden.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Funktionen von Flavonoiden in Pflanzen 3 2.2 Biosynthese und Struktur von Flavonoiden 4 2.3 Flavonoidwirkungen im menschlichen und tierischen Organismus 7 2.3.1 Antioxidative Eigenschaften 10 2.3.2 Wirkungen auf Enzyme und Transportproteine des Arzneistoffwechsels 12 2.4 Bioverfügbarkeit und Stoffwechsel des Flavonols Quercetin 13 2.4.1 Bioverfügbarkeit von Quercetin 13 2.4.2 Einfluss des Futters 15 2.4.3 Einfluss des Glycosylierungsmusters 16 2.4.4 Intestinale Absorption und Metabolismus 18 2.4.5 Einfluss der intestinalen Mikroflora 21 2.4.6 Bindung an Plasmaproteine 22 2.4.7 Gewebeverteilung 23 2.4.8 Exkretion 24 2.5 Zielsetzung 25 3 Tiere, Material und Methoden 26 3.1 Versuchstiere und Haltungsbedingungen 26 3.2 Verwendete Flavonole 27 3.3 Durchführung des Tierversuchs 28 3.3.1 Allgemeine Durchführung der Versuche 28 3.3.2 Bioverfügbarkeit von Quercetin und Rutin (je 30 mg/kg KM) 29 3.3.3 Absolute Bioverfügbarkeit von Quercetin 30 3.3.4 Relative Bioverfügbarkeit verschiedener Quercetinglycoside 31 3.4 Probenaufarbeitung 31 3.5 HPLC 33 3.5.1 Methodenvalidierung und -kalibrierung 34 3.5.2 Berechnung der pharmakokinetischen Parameter 40 3.5.3 Statistische Auswertung 41 4 Ergebnisse 42 4.1 Bioverfügbarkeit von Quercetin und Rutin (je 30 mg/kg KM) 42 4.1.1 Quercetin-Aglycon 42 4.1.2 Rutin 46 4.2 Absolute Bioverfügbarkeit Quercetin 48 4.3 Relative Bioverfügbarkeit verschiedener Quercetinglycoside 52 4.3.1 Quercetin-Aglycon 53 4.3.2 Rutin 56 4.3.3 Isoquercitrin 57 5 Diskussion 62 5.1 Zielsetzung der Studie 62 5.2 Methodische Aspekte 62 5.2.1 Auswahl der Versuchstiere und Versuchsanordnung 62 5.2.2 Wahl der Testmahlzeit 63 5.2.3 Einfluss der Zeitpunkte für die Probennahme auf die Berechnung der Verfügbarkeit 64 5.2.4 Analysemethode 65 5.3 Plasmametaboliten von Quercetin 66 5.4 Absolute Bioverfügbarkeit von Quercetin 69 5.5 Relative Bioverfügbarkeit verschiedener Quercetinglycoside 70 5.5.1 Isoquercitrin 70 5.5.2 Rutin 71 5.6 Bezug der pharmakokinetischen Daten zu potentiellen In-vivo-Wirkungen 73 5.7 Schlussfolgerungen 75 6 Zusammenfassung 76 7 Summary 78 8 Literaturverzeichnis 80 9 Anhang 102 9.1 HPLC-Chemikaien 102 9.2 Validierung der HPLC-Methode 103 Danksagung 109 / 7 Summary Marianne Reinboth Bioavailability of the Flavonol Quercetin in Dogs Institute of Physiology of the Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig Submitted in June 2010 79 pages, 20 figures, 6 tables, 211 references, 1 appendix Keywords: quercetin, bioavailability, dog, absolute bioavailability, isoquercitrin, rutin, flavonols The plant flavonol quercetin is supposed to exert multiple health-related effects in dogs. To date no information on its bioavailability in this particular species is avai-lable. This study intended to investigate bioavailability and pharmacokinetics of quercetin and certain quercetin glycosides in dogs after ingestion of a test meal sup-plemented with a quercetin dose equivalent to 10 mg/kg body weight. Nine adult beagle dogs of both sexes received the aglycon quercetin (sugarfree) or its glycosides isoquercitrin (quercetin-3-O-glucoside) and rutin (quercetin-3-O-glucorhamnoside) in equimolar amounts together with a test meal. Blood samples were taken over a period of up to 72 hours; bioavailability and pharmacokinetics were calculated from the HPLC-derived plasmaconcentration-time-curves. Absolute bioavailability was calculated by comparing an oral to an intravenous administration of quercetin. The majority of analysed plasma metabolites were glucuronidated and sulfated con-jugates of quercetin. Non-conjugated quercetin aglycon comprised only 20 %. Be-sides quercetin, its metabolites isorhamnetin and kaempferol made up less than 10 % of all circulating metabolites. The absolute bioavailability of quercetin was only 4 %. The relative bioavailability of quercetin from isoquercitrin was more than twice as high than from the aglycon, but even there maximal plasma concentrations were generally less than 1 μmol/l. Absorption from the small intestine was rather fast with a first plasma peak after 1 hour after ingestion of quercetin or isoquercitrin. A second, generally higher plasma peak occurred 4 hours after ingestion. This suggests an in-tensive enterohepatic recycling of biliary secreted metabolites. Absorption was significantly delayed after ingestion of rutin due to the necessity of bacterial deglycosilation in the large intestine. Plasma concentrations peaked only after 11 hours. Plasma concentrations after rutin were lower than after quercetin or isoquercitrin, but mean residence time of plasma metabolites was as long as 18 hours after rutin ingestion. Consequently, a once daily feeding of dogs with rutin might lead to relatively constant plasma metabolite concentrations. In contrast to other species, bioavailability from rutin was not smaller than that from quercetin. Although rutin seems to be a relative good quercetin source for dogs, estimations about potential in-vivo-effects of quercetin have to take into consideration its low bioavailabilty and intensive metabolism.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Funktionen von Flavonoiden in Pflanzen 3 2.2 Biosynthese und Struktur von Flavonoiden 4 2.3 Flavonoidwirkungen im menschlichen und tierischen Organismus 7 2.3.1 Antioxidative Eigenschaften 10 2.3.2 Wirkungen auf Enzyme und Transportproteine des Arzneistoffwechsels 12 2.4 Bioverfügbarkeit und Stoffwechsel des Flavonols Quercetin 13 2.4.1 Bioverfügbarkeit von Quercetin 13 2.4.2 Einfluss des Futters 15 2.4.3 Einfluss des Glycosylierungsmusters 16 2.4.4 Intestinale Absorption und Metabolismus 18 2.4.5 Einfluss der intestinalen Mikroflora 21 2.4.6 Bindung an Plasmaproteine 22 2.4.7 Gewebeverteilung 23 2.4.8 Exkretion 24 2.5 Zielsetzung 25 3 Tiere, Material und Methoden 26 3.1 Versuchstiere und Haltungsbedingungen 26 3.2 Verwendete Flavonole 27 3.3 Durchführung des Tierversuchs 28 3.3.1 Allgemeine Durchführung der Versuche 28 3.3.2 Bioverfügbarkeit von Quercetin und Rutin (je 30 mg/kg KM) 29 3.3.3 Absolute Bioverfügbarkeit von Quercetin 30 3.3.4 Relative Bioverfügbarkeit verschiedener Quercetinglycoside 31 3.4 Probenaufarbeitung 31 3.5 HPLC 33 3.5.1 Methodenvalidierung und -kalibrierung 34 3.5.2 Berechnung der pharmakokinetischen Parameter 40 3.5.3 Statistische Auswertung 41 4 Ergebnisse 42 4.1 Bioverfügbarkeit von Quercetin und Rutin (je 30 mg/kg KM) 42 4.1.1 Quercetin-Aglycon 42 4.1.2 Rutin 46 4.2 Absolute Bioverfügbarkeit Quercetin 48 4.3 Relative Bioverfügbarkeit verschiedener Quercetinglycoside 52 4.3.1 Quercetin-Aglycon 53 4.3.2 Rutin 56 4.3.3 Isoquercitrin 57 5 Diskussion 62 5.1 Zielsetzung der Studie 62 5.2 Methodische Aspekte 62 5.2.1 Auswahl der Versuchstiere und Versuchsanordnung 62 5.2.2 Wahl der Testmahlzeit 63 5.2.3 Einfluss der Zeitpunkte für die Probennahme auf die Berechnung der Verfügbarkeit 64 5.2.4 Analysemethode 65 5.3 Plasmametaboliten von Quercetin 66 5.4 Absolute Bioverfügbarkeit von Quercetin 69 5.5 Relative Bioverfügbarkeit verschiedener Quercetinglycoside 70 5.5.1 Isoquercitrin 70 5.5.2 Rutin 71 5.6 Bezug der pharmakokinetischen Daten zu potentiellen In-vivo-Wirkungen 73 5.7 Schlussfolgerungen 75 6 Zusammenfassung 76 7 Summary 78 8 Literaturverzeichnis 80 9 Anhang 102 9.1 HPLC-Chemikaien 102 9.2 Validierung der HPLC-Methode 103 Danksagung 109

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No. of bitstreams: 1 Dissertação - Priscila Moraes dos Santos.pdf: 3531569 bytes, checksum: 1addf55099b28e0cfbe42b2e94a1e935 (MD5) Previous issue date: 2013-07-13 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Species of the genus Bauhinia are used in various parts of the world to treat various diseases, especially for the treatment of diabetes due to hypoglycemic activity has proven to Bauhinia forficata species, which is associated with the presence of the flavonoid kaempferitrina. However, other species also have the same effect and this is associated with the presence of other flavonoids glycosides. In this study we sought to prepare the phytochemical profile of four species of Bauhinia Amazon region from their crude extracts, alkaloid and flavonoics fractions in order to promote an initial scan for more specific biotechnology projects. Furthermore, Bauhinia coronata (Manaus-AM), B. purpurea (Manaus-AM), B. acreana (Manacapuru-AM) and B. purpurea (S. Gabriel da Cachoeira) were analyzed for antioxidant activity front free radicals DPPH., ABTS.+ and O2-, as well as the inhibition of enzymes lipoxygenase, α-amylase, lypase, α-glycosidase and tyrosinase. Among these assays as biological antioxidants and tyrosinase and α-glycosidase, stood the species B. coronata and B. purpurea with lower values for IC50 (IC50 of B. coronata leaf’s crude extract: 1.91 ± 0.55 μg / mL). The toxicity of crude extracts was also tested against Artemia salina, with LD50 values of greater than 250 μg/mL, indicating the low toxicity of them. However, the analysis of their potential cytotoxic and antibacterial no species has been active, which is contrary to reports in the literature that Bauhinia purpurea was mentioned with these potentials. The profile of flavonoids were identified, using TLC, HPLC-DAD-UV and mass spectrometry, and the rutin and isoquercitrin flavonoids in the species B. coronata and B. purpurea, the latter being related to the flavonoid has hypoglycemic activity of other species of Bauhinia, and anti-inflammatory action. The kaempferitrin flavonoid wasn’t found in any species, as no substance of the alkaloidal class. The results from the antioxidant activity, low toxicity and the presence of flavonoids with potential herbal stimulate future research for specific biotechnological purposes. / Espécies do gênero Bauhinia são utilizadas em diversas partes do mundo para tratamento de diversas doenças, principalmente para o tratamento da diabetes, devido a atividade hipoglicemiante já comprovada para a espécie Bauhinia forficata, a qual é associada à presença do flavonoide kaempferitrina. Entretanto, outras espécies também apresentam o mesmo efeito e a este é associada a presença de outros flavonoides glicosilados. Neste trabalho buscou-se elaborar o perfil fitoquímico de quatro espécies de Bauhinia da Região Amazônica a partir de seus extratos brutos, frações flavonoídicas e alcaloídicas, a fim de promover uma varredura inicial para projetos biotecnológicos mais específicos. Além disso, Bauhinia coronata (Manaus-AM), B. purpurea (Manaus-AM), B. acreana (Manacapuru- AM) e B. purpurea (S. Gabriel da Cachoeira) foram analisadas para determinação do potencial antioxidante frente os radicais livres DPPH., ABTS.+ e O2-, assim como a inibição de enzimas lipoxigenase, α-amilase, lipase, α-glicosidase e tirosinase. Dentre estes ensaios antioxidantes e biológicos como tirosinase e α-glicosidase, destacaram-se as espécies B. coronata e B. purpurea com os valores mais baixos para CI50 (CI50 do extrato bruto de folha de B. coronata: 1,91±0,55 μg/mL) . A toxicidade dos extratos brutos também foi testada frente ao microcrustáceo Artemia salina, com valores de DL50 superiores a 250 μg/mL, indicando a baixa toxicidade dos mesmos. Entretanto, na análise do seu potencial citotóxico e antibacteriano nenhuma espécie foi ativa, o que é contrário aos relatos da literatura em que a Bauhinia purpurea já foi mencionada com estes potenciais. No perfil de flavonoides foram identificados, utilizando CCD, CLAE-DAD-UV e espectrometria de massas, os flavonoides rutina e isoquercitrina nas espécies B. coronata e B. purpurea, sendo este último flavonoide já relacionado à atividade hipoglicemiante de outras espécies de Bauhinia, além de ação antiinflamatória. O flavonoide kaempferitrina não foi encontrado em nenhuma espécie, como nenhuma substância relativa à classe alcaloídica. Os resultados obtidos a partir da atividade antioxidante, baixa toxicidade e a presença de flavonoides com potencial fitoterápico estimulam futuras pesquisas específicas para fins biotecnológicos.

Natural flavonoids and flavonolignans feature beneficial properties for living organisms such as antioxidant and hepatoprotective effects, anticancer, chemoprotective, dermatoprotective and hypocholesterolemic activities. Their metabolism in mammals is complex, the exact structure of their metabolites still remains partly unclear and the standards are usually not commercially available. Hence, this project focused on the preparation of potential and defined biotransformation Phase II sulfated metabolites of silymarin flavonolignans: silybin, 2,3-dehydrosilybin, isosilybin, silychristin, silydianin and flavonoids quercetin, taxifolin, rutin and isoquercitrin. Pure sulfated derivatives were prepared using aryl sulfotransferase from Desulfitobacterium hafniense and aryl sulfotransferase from rat liver. Using heterologously expressed PAPS (3'-phosphoadenosine-5'-phosophosulfate) - independent arylsulfotransferase from Desulfitobacterium hafniense and cheap p-nitrophenyl sulfate as sulfate donor, sulfated flavonolignans and flavonoids were obtained in high yields. Silymarin flavonolignans afforded exclusively monosulfates at the position C-20 (C-19 in the case of silychristin), except 2,3-dehydrosilybin that yielded also the 7,20-O-disulfated derivative. Isoquercitrin and rutin were selectively sulfated...

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CHAPTER I - The aqueous extract prepared from Schizolobium parahyba (Sp) leaves, a native plant from Mata Atlantica forest (Brazil), was tested to analyze its ability to inhibit some biological and enzymatic activities induced by Bothrops alternatus and Bothrops moojeni snake venoms. Sp chromatography in Sephadex LH 20 resulted in 3 fractions: F1 (methanolic fraction); F2 (methanol:water fraction, 1:1 v/v); and F3 (aqueous fraction). These fractions were analyzed in terms of its capacity of inhibit the venoms fibrinogenolytic activity. Sp inhibited 100% of lethality, blood incoagulability, hemorrhagic and indirect hemolytic activities for a 1:10 ratio (venom/extract, w/w), and coagulant activity in a 1:5 ratio (venom/extract, w/w) induced by venoms. Venoms fibrinogenolytic activity were also neutralized by Sp in a 1:10 ratio, resulting in total protection of Bβ chain and partial protection for the fibrinogen Aα chain. However, larger ratios of extract/proteins have caused a complete vanishing of all fibrinogen chains possibly caused by Sp precipitation. Interaction tests have demonstrated that for certain extract/proteins ratios Sp precipitates proteins non-specifically suggesting the presence of tannins, which are very likely responsible for the excellent inhibiting effects of the analyzed ophidian activities. Therefore, the fractioning of Sp was carried out aiming at separating these compounds that mask the obtained results. F1 inhibited 100% the venom fibrinogenolytic activity without presenting protein precipitation effect; F2 demonstrated only partial inhibition of these venoms activities. Finally, F3 did not inhibit fibrinogen proteolysis, but presented strong protein precipitating action. We conclude that Sp, together with tannins, also contains other compounds which can present specific toxin inhibition action of snake venoms. CHAPTER II - Do extrato aquoso liofilizado das folhas de Schizolobium parahyba foram isolados quatro compostos ativos, isoquercitrina, miricetina-3-O-glicosídeo, catequina e galocatequina, por cromatografia em Sephadex LH 20 seguido de HPLC semipreparativo em coluna C-18 e identificados por RMN do 1H e 13C. Essa é a primeira vez que estas substâncias são relatadas nesta espécie assim como suas atividades antiofídicas. Após isolamento foram todas testadas frente a atividade hemorrágica e fibrinogenolítica da peçonha de Bothrops alternatus (Bal). Na proporção 1:30 (Peçonha/fração, m/m) a isoquercitrina inibiu parcialmente a atividade hemorrágica; a miricetina-3-O-glicosideo e a catequina não foram capazes de inibir a hemorragia induzida pela Bal e a galocatequina, por sua vez, apresentou uma eficiente neutralização desta atividade da peçonha. Na proporção de 1:100 (Peçonha/fração, m/m) ficou evidenciado o efeito de inibição total da ação fibrinogenolítica da peçonha pela miricetina-3-O-glicosideo; a isoquercitrina não protegeu a proteólise da cadeia Aα do fibrinogênio e inibiu parcialmente a degradação da cadeia Bβ enquanto a catequina e a galocatequina inibiram parcialmente a degradação da cadeia Aα e totalmente a da cadeia Bβ. Dessa forma concluímos que a galocatequina e a miricetina-3-O-glicosideo são excelentes inibidores de toxinas hemorrágicas e fibrinogenolíticas respectivamente. Estudos vindouros como o de modelagem molecular e cristalização de raio-X usando toxinas isoladas e estas substâncias poderão ser de grande importância para o desenho de novas drogas auxiliares do tratamento com soro antiofídico ou para melhor elucidação da relação estruturafunção das toxinas destes venenos. / CAPÍTULO I - O extrato aquoso preparado das folhas de Schizolobium parahyba (Sp), uma planta nativa da Mata Atlântica (Brasil), foi testado para avaliar sua habilidade de inibir algumas atividades biológicas e enzimáticas induzidas pelas peçonhas brutas de Bothrops alternatus e Bothrops moojeni. Cromatografia de Sp em coluna de Sephadex LH 20 resultou em 3 frações: F1 (fração metanólica); F2 (fração metanol : água, 1:1 v/v) e F3 (fração aquosa). Estas frações foram analisadas quanto a capacidade de inibir a atividade Fibrinogenolítica das peçonhas. Sp inibiu em 100% a letalidade, a incoagulabilidade sanguínea, a atividade hemorrágica e hemolítica indireta na proporção de 1:10 (peçonha/extrato, m/m) e atividade coagulante na proporção de 1:5 (peçonha/extrato, m/m) induzidas pelas peçonhas. A atividade fibrinogenolítica das peçonhas também foi neutralizada por Sp na proporção de 1:10, resultando em proteção total da cadeia Bβ e parcial da Aα do fibrinogênio. No entanto, proporções maiores de peçonha/extrato mostraram desaparecimento de todas as cadeias do fibrinogênio numa possível precipitação causada por Sp. Os testes de interação extrato/proteínas demonstraram que em determinadas proporções de extrato/proteínas Sp precipita proteínas inespecificamente, sugerindo a presença de taninos, os quais muito provavelmente são os responsáveis pelo excelente efeito inibidor das atividades ofídicas analisadas. Assim, com o intuito de separar estes componentes que mascaram os resultados obtidos, foi realizado o fracionamento de Sp. F1 inibiu em 100% a atividade fibrinogenolítica das peçonhas e não apresentou efeito de precipitação de proteínas; F2 demonstrou inibição parcial desta atividade das peçonhas e F3 não inibiu a proteólise do fibrinogênio, mas apresentou forte ação precipitante de proteínas. Concluímos, assim que Sp, além de taninos, também contém outros compostos e que estes podem apresentar ação específica de inibição de toxinas de peçonhas de serpentes. CAPÍTULO II - Do extrato aquoso liofilizado das folhas de Schizolobium parahyba foram isolados quatro compostos ativos, isoquercitrina, miricetina-3-O-glicosídeo, catequina e galocatequina, por cromatografia em Sephadex LH 20 seguido de HPLC semipreparativo em coluna C-18 e identificados por RMN do 1H e 13C. Essa é a primeira vez que estas substâncias são relatadas nesta espécie assim como suas atividades antiofídicas. Após isolamento foram todas testadas frente a atividade hemorrágica e fibrinogenolítica da peçonha de Bothrops alternatus (Bal). Na proporção 1:30 (Peçonha/fração, m/m) a isoquercitrina inibiu parcialmente a atividade hemorrágica; a miricetina-3-O-glicosideo e a catequina não foram capazes de inibir a hemorragia induzida pela Bal e a galocatequina, por sua vez, apresentou uma eficiente neutralização desta atividade da peçonha. Na proporção de 1:100 (Peçonha/fração, m/m) ficou evidenciado o efeito de inibição total da ação fibrinogenolítica da peçonha pela miricetina-3-O-glicosideo; a isoquercitrina não protegeu a proteólise da cadeia Aα do fibrinogênio e inibiu parcialmente a degradação da cadeia Bβ enquanto a catequina e a galocatequina inibiram parcialmente a degradação da cadeia Aα e totalmente a da cadeia Bβ. Dessa forma concluímos que a galocatequina e a miricetina-3-O-glicosideo são excelentes inibidores de toxinas hemorrágicas e fibrinogenolíticas respectivamente. Estudos vindouros como o de modelagem molecular e cristalização de raio-X usando toxinas isoladas e estas substâncias poderão ser de grande importância para o desenho de novas drogas auxiliares do tratamento com soro antiofídico ou para melhor elucidação da relação estruturafunção das toxinas destes venenos. / Mestre em Genética e Bioquímica