Atherosklerotisch bedingte Herz-Kreislauferkrankungen zählen weltweit zu den häufigsten Todesursachen. Die vorliegende Arbeit befasst sich in einem Mausmodell mit der Identifikation neuer Genorte, welche die Ausprägung der Atherosklerose und deren Kofaktoren beeinflussen. Zu diesem Zweck wurde eine Kopplungsuntersuchung in einer Kreuzung Atherosklerose-empfindlicher C57BL/6 und BALB/c Mäuse auf dem LDL-Rezeptor defizienten Hintergrund durchgeführt. Außer der Größe der atherosklerotischen Läsionen wurden 61 weitere Phänotypen bestimmt. Als Hauptergebnis konnte ein neuer Genlocus auf dem proximalen Chromosom 2 identifiziert werden, welcher einen Einfluss auf die Größe der atherosklerotischen Läsionen an der Aortenwurzel hat. Des Weiteren zeigte sich eine Co-Segregation von Lipoproteinen (Very-Low-Density Lipoprotein (VLDL) Cholesterin und High-Density Lipoprotein (HDL) Cholesterin mit diesem Locus sowie eine Korrelation dieser Lipide mit der Läsionsgrösse. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Effekt des Chromosom 2 Lokus auf die Atherosklerose durch genetische Faktoren des Fettstoffwechsels bedingt ist. Weitere Experimente sind notwendig um den QTL weiter einzuengen und die verantwortlichen Gene zu identifizieren.

Thesis (MSc (Physics))--University of Stellenbosch, 2008. / Experimental double differential cross sections and analyzing powers for the inclusive 93 Nb(p,α) r and 93 Nb(p, 3He) r reactions have been measured at an incident energy of 160 MeV. The results of this experiment, for emission angles ranging from 15º to 60º as well as previously measured data for 93 Nb(p,α) r at 100 MeV and 59Co(p,α) r at 100 and 160 MeV, have been compared with theoretical calculations based on a direct quasi-free α- cluster knockout mechanism. A computer code has been employed which calculates triple differential cross section and analysing power values using the distorted wave impulse approximation (DWIA). Inclusive double differential cross sections and analysing powers were calculated by integrating over the solid angle of the unobserved proton. It was found that the DWIA is limited in its ability to reproduce the experimental data. Some slight agreements have been observed in the region of large emission energies and small angles. This is consistent with the findings of previous studies based on a direct multi-step analysis which indicated that the first step knock-out reaction dominates in this region.

Of the thousands of dividing progenitor cells (PCs) generated daily in the adult brain only a very small proportion survive to become mature neurons through the process of neurogenesis. Identification of the mechanisms that regulate cell death associated with neurogenesis would aid in harnessing the potential therapeutic value of PCs. Apoptosis, or programmed cell death, is suggested to regulate death of PCs in the adult brain as overexpression of B-cell lymphoma 2 (Bcl-2), an anti-apoptotic protein, enhances the survival of new neurons. To directly assess if Bcl-2 is a regulator of apoptosis in PCs, this study examined the outcome of removal of Bcl-2 from the developing PCs in the adult mouse brain. Retroviral mediated gene transfer of Cre into adult floxed Bcl-2 mice eliminated Bcl-2 from developing PCs and resulted in the complete absence of new neurons at 30 days post viral injection. Similarly, Bcl-2 removal through the use of nestin-induced conditional knockout mice resulted in reduced number of mature neurons. The function of Bcl-2 in the PCs was also dependent on Bcl-2-associated X (BAX) protein, as demonstrated by an increase in new neurons formed following viral-mediated removal of Bcl-2 in BAX knockout mice. Together these findings demonstrate that Bcl-2 is an essential regulator of neurogenesis in the adult hippocampus.

Hydrogen sulfide (H2S), is a gasotransmitter with several key roles in metabolism and vascular function. The effects of H2S are dependent on concentration and target organ. For example, increased H2S concentrations impair liver metabolic function but protect against vascular dysfunction and atherosclerosis. Thiosulfate sulfurtransferase (TST), a nuclear encoded mitochondrial matrix enzyme, is proposed to be a component of the sulfide oxidising unit (SOU) which metabolises H2S. Preliminary data has shown that Tst deletion in mice (Tst-/-) increases circulating H2S levels measured in whole blood. Therefore, it was hypothesised that Tst-/- mice would exhibit worsened metabolic function in the liver but also protection of vascular function under conditions of vascular stress e.g. atherosclerosis. Liver metabolism was assessed by extensive metabolic phenotyping of Tst-/-mice fed control diet and in conditions of metabolic dysfunction induced by a high fat diet (HFD). Tst deletion altered glucose metabolism in mice; gluconeogenesis was increased in liver from Tst-/-mice fed control diet. Glucose intolerance in HFD-fed Tst-/-mice was also more severe than HFDfed C57BL/6 controls. In vitro metabolic investigations in primary hepatocytes isolated from Tst-/-mice demonstrated that mitochondrial ATP-linked and leak respiration were increased compared to controls. The effect of Tst deletion on vascular function was investigated in Tst- /-mice fed control or HFD using myography. Tst deletion did not alter vessel function when mice were maintained on a normal diet. HFD feeding (20 weeks) reduced maximal vessel constriction in the presence of endothelial nitric oxide synthase and cyclooxygenase inhibitors in C57BL/6 aorta. However, in Tst-/-mice fed HFD there was no reduction in maximal constriction suggesting a protective action of Tst deletion. The effects of Tst deletion on atherosclerotic lesions was investigated by generating double knock-out (DKO) mice by deletion of the Tst gene in ApoE-/- mice and (ApoE-/-Tst-/-). Atherosclerotic lesion formation was accelerated by feeding mice a western diet. Within the brachiocephalic branch lesion volume and total vessel volume were reduced in DKO mice fed western diet for 12 weeks, indicating that Tst deletion reduced lesion formation. Plasma cholesterol was reduced in DKO mice compared to ApoE-/- controls and a trend towards reduced systolic blood pressure was also noted. Overall this work supported the hypothesis that Tst deletion engenders metabolic dysfunction but vascular protection. The findings are consistent with the reported effects of increased H2S signalling. Overall inhibition of TST represents a novel target for treatment of atherosclerosis, with the caveat that glycaemia may be worsened due to hepatic metabolic dysfunction.

Die NO/cGMP-vermittelte Signalkaskade ist im vaskulären System entscheidend an der Regulation des Blutdrucks beteiligt. Innerhalb der Kaskade nimmt die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) eine Schlüsselfunktion als wichtigster Rezeptor für das Signalmolekül Stickstoffmonoxids (NO) ein. NO wird endogen von verschiedenen Isoformen der NO Synthase produziert. Die Bindung von NO an die NO GC führt zur Produktion des sekundären Botenstoffs cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP). Dieser Botenstoff aktiviert verschiedene Effektor-Moleküle und bewirkt letztlich eine Relaxation der glatten Muskulatur. Ein weiterer sekundärer Botenstoff, das Signalmolekül cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP), ist ebenfalls an der Regulation des Tonus der glatten Muskulatur und dadurch an der Blutdruckregulation beteiligt. Unterschiedliche Phosphodiesterasen (PDE) bauen die sekundären Botenstoffe ab und beenden dadurch die Signalkaskaden. Die PDE3 spielt hierbei eine besondere Rolle, da sie eine gemischte Substratspezifität besitzt. Um den Einfluss der NO-GC auf das kardiovaskuläre System zu untersuchen, wurden NO-GC Knockout(KO)-Mäuse mit globaler (GCKO) oder Glattmuskel-spezifischer (SMC-GCKO) Deletion der NO-GC generiert. Um das Zusammenspiel von cAMP und cGMP näher zu beleuchten, wurde im ersten Teil dieser Arbeit die PDE3 genauer untersucht. Im Gefäßsystem wird lediglich die PDE3A und nicht die PDE3B exprimiert. Die Aorten von GCKO- und SMC-GCKO-Tieren reagieren sensitiver auf PDE3A-Blockade als die Kontroll-Tiere. Auch die akute Blockade der NO-GC führt zu diesem Sensitivitätseffekt. Die PDE3A ist in Folge der NO-GC-Deletion sowohl in ihrer Expression, als auch ihrer Aktivität um die Hälfte reduziert. Dies dient vermutlich kompensatorisch dazu, das cAMP-Signal weitgehend zu erhalten und so eine cAMP-induzierte Relaxation der Gefäße zu gewährleisten. Ohne Rückkopplung zwischen den beiden Signalwegen käme es vermutlich zu weiteren negativen Konsequenzen für das Herz-Kreislaufsystem. Diese Daten weisen auf eine direkte Regulation der PDE3 in glatten Muskelzellen durch die NO/cGMP-Signalkaskade und einen PDE3-vermittelten cAMP/cGMP-Crosstalk hin. Der genaue Mechanismus dieser Expressionsregulation ist noch unklar. Denkbar wäre eine cGMP-vermittelte Transkriptionsregulation oder eine Modulation der Translation der PDE3A. Der Verlust der NO-GC führt in GCKO- und SMC-GCKO-Mäusen zu einem erhöhten systolischen Blutdruck von ~30 mmHg. Bei der Entwicklung der arteriellen Hypertonie könnte eine erhöhte Aortensteifigkeit beteiligt sein, die im zweiten Teil dieser Arbeit näher untersucht wurde. In GCKO-Mäusen ist die aortale Steifigkeit und daraus resultierend die Pulswellengeschwindigkeit (PWV) deutlich erhöht. Die Steigerung der PWV wird in den GCKO-Tieren zusätzlich durch den verminderten Aorten-Durchmesser bedingt. Außerdem weisen die Aorten dieser Tiere eine veränderte Wandstruktur auf, die zu einer Verminderung der aortalen Windkesselfunktion führt. Diese Veränderungen könnten die Blutdruckerhöhung in GCKO-Mäusen erklären. In SMC-GCKO-Tieren tritt keine dieser Gefäß-Modifikationen auf. Eine Aortensteifigkeit als mögliche Ursache für den erhöhten systolischen Blutdruck in den SMC-GCKO-Tieren kann somit ausgeschlossen werden. Zur Aufklärung müssen weitere Versuche zum Aufbau der Gefäßwände und zur Bestimmung des peripheren Widerstands gemacht werden. Auch der Einfluss anderer Zelltypen, wie z.B. Perizyten oder Fibroblasten, auf die Blutdruckregulation sollte untersucht werden. / The NO/cGMP-mediated signaling cascade is crucially involved in the regulation of blood pressure. Within the cascade, NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) plays a key role as the most important receptor for the signaling molecule nitric oxide (NO). NO is endogenously produced by three different isoforms of NO synthase. Binding of NO to NO-GC stimulates the production of the second messenger cyclic guanosine monophosphate (cGMP). cGMP, in turn, activates various effector molecules, finally leading to smooth muscle relaxation. Another second messenger, the signalling molecule cyclic adenosine monophosphate (cAMP), also participates in the regulation of smooth muscle tone and is thus also involved in the regulation of blood pressure. Phosphodiesterases (PDE) degrade cyclic nucleotides thereby ending their signalling. In order to investigate the effect of NO-GC on the cardiovascular system, mice with global (GCKO) or smooth muscle-specific (SMC-GCKO) deletion of NO-GC have been generated. To shed light into the interplay of cAMP and cGMP, PDE3 was studied in the first part of this thesis. PDE3 plays a special role in cGMP/cAMP crosstalk based on its mixed substrate specificity. From the two PDE3 isoenzymes (PDE3A and PDE3B), only PDE3A is expressed in the aorta. The aortas of GCKO- and SMC-GCKO animals are more sensitive to PDE3A inhibition than those from control animals. The acute blockade of NO-GC using ODQ also leads to this sensitivity effect. As a result of NO-GC deletion, PDE3A expression and activity are reduced by approx. 50%. This is probably a compensatory response in order to maintain functional cAMP signalling and to guarantee cAMP-induced relaxation of blood vessels. These results indicate a direct regulation of PDE3A in smooth muscle cells by the NO/cGMP-signalling cascade and a PDE3-mediated cAMP/cGMP crosstalk. The exact mechanism how NO-GC/cGMP regulates PDE3A expression remains unclear; conceivable options are a cGMP-mediated regulation of transcription or a modulation of PDE3A translation. Loss of NO-GC in GCKO and SMC-GCKO mice leads to an elevated systolic blood pressure by around 30 mmHg. In the second part of this thesis, stiffness of aortae from these KO animals was examined. In GCKO mice, the pulse wave velocity (PWV) was significantly faster than in control animals indicating an increased aortic stiffness. The increase in PWV in GCKO animals is likely to be explained by a reduced aortic diameter. Even though elastin and collagen content were unchanged, the aortas of these animals have an altered wall structure. SMC-GCKO animals show neither an increase in PWV nor morphological changes of the aorta. Thus, an increased aortic stiffness can be excluded as cause for the elevated systolic blood pressure in GCKO animals.

Lasthme est une pathologie inflammatoire caractérisée par une inflammation, une hyperréactivité et un remodelage bronchique. Des études menées sur des souris déficientes en MMP-8 et en MMP-19 nous ont permis de démontrer que ces deux protéases jouaient un rôle protecteur vis-à-vis du développement de l'inflammation dans la pathologie asthmatique. En effet, suite à la sensibilisation et à l'exposition par inhalation à lallergène (Ovalbumine),les souris déficientes en MMP-8 en MMP-19 développent respectivement une inflammation neutrophilique et éosinophilique significativement plus importante comparativement aux souris wild-type. Dans une seconde partie de ce travail, nous avons évalué les effets de deux inhibiteurs synthétiques des MMPs administrés en inhalation sous une formulation adéquate dans notre modèle murin dasthme. Suite à ladministration de ces deux inhibiteurs, nous avons observé une diminution de linflammation au sein du lavage bronchoalvéolaire. De plus, nous observons une diminution de linfiltration du tissu pulmonaire par les cellules inflammatoires. Lhyperréactivité bronchique observée suite à linhalation de doses croissantes de méthacholine est également significativement diminuée. Ces résultats sont comparables à ceux obtenus après linhalation de Fluticasone, stéroïde inhalé utilisé très largement en clinique humaine et utilisé dans nos expériences comme médicament de référence. Afin dobserver les modifications morphologiques bronchiques, nous avons mis au point un modèle murin dasthme permettant une exposition de longue durée (90 jours) aux allergènes. En plus de développer une inflammation pulmonaire, les souris traitées vont voir la structure de leurs bronches se modifier. L'inhalation de doxycycline diminue significativement l'inflammation, la réactivité bronchique et diverses caractéristiques du remodelage bronchique telles que l'hyperplasie des cellules à mucus, le dépôt de collagène péribronchique, l'épaisseur de la membrane basale sous-épithéliale et l'épaisseur de la couche de cellules musculaires lisses. Au cours de ces travaux, nous avons caractérisé des modèles murins dasthme. Nous avons démontré que linhibition de certaines MMPs est délétère, nous incitant à les considérer comme des « anti targets ». Nous avons, dans une seconde partie, pu apporter la démonstration que linhibition de certaines MMPs précises (MMP-2, -9 et -14) par des inhibiteurs relativement spécifiques administrés en inhalation améliore le phénotype asthmatique. Par ces travaux, nous avons contribué à la compréhension globale des mécanismes impliquant les MMPs dans la pathologie asthmatique et nous suggérons que de nouvelles voies thérapeutiques, basées sur linhibition de certaines MMPs, pourraient faire lobjet de développements futurs.

Of the thousands of dividing progenitor cells (PCs) generated daily in the adult brain only a very small proportion survive to become mature neurons through the process of neurogenesis. Identification of the mechanisms that regulate cell death associated with neurogenesis would aid in harnessing the potential therapeutic value of PCs. Apoptosis, or programmed cell death, is suggested to regulate death of PCs in the adult brain as overexpression of B-cell lymphoma 2 (Bcl-2), an anti-apoptotic protein, enhances the survival of new neurons. To directly assess if Bcl-2 is a regulator of apoptosis in PCs, this study examined the outcome of removal of Bcl-2 from the developing PCs in the adult mouse brain. Retroviral mediated gene transfer of Cre into adult floxed Bcl-2 mice eliminated Bcl-2 from developing PCs and resulted in the complete absence of new neurons at 30 days post viral injection. Similarly, Bcl-2 removal through the use of nestin-induced conditional knockout mice resulted in reduced number of mature neurons. The function of Bcl-2 in the PCs was also dependent on Bcl-2-associated X (BAX) protein, as demonstrated by an increase in new neurons formed following viral-mediated removal of Bcl-2 in BAX knockout mice. Together these findings demonstrate that Bcl-2 is an essential regulator of neurogenesis in the adult hippocampus.

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Sleep disturbances are common in patients with schizophrenia. Mice lacking the cytoskeletal-associated protein Stable Tubule Only Polypeptide (STOP) display cognitive, behavioural and neurobiological deficits that mimic those seen in schizophrenia, but there is little evidence of sleep changes in these mice. To investigate their sleep patterns, electroencephalogram (EEG) and electromyogram were recorded under a 12:12 light:dark cycle in adult male STOP-null (KO; n=7) and wild-type (WT; n=8) mice, during a 24 h baseline period, followed by 6 h of sleep deprivation, and a 24 h recovery period. In the baseline period, KO mice spent more time awake and less time in non-rapid eye movement (NREM) and REM sleep compared to WT mice. Particularly in the dark phase, KO mice had more wake and NREM sleep episodes, and shorter NREM and REM sleep episodes relative to WT mice. Following sleep deprivation, during the first 12 h of recovery (i.e. dark phase), both groups showed similar increases in NREM and REM sleep amounts and NREM EEG delta power relative to corresponding baseline periods. These findings indicate that the STOP-null mice sleep less and their sleep is more fragmented compared to WT mice. These features are consistent with the sleep abnormalities found in individuals with schizophrenia.

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