Les pathologies valvulaires aortiques sont des pathologies plurifactorielles, comportant un déterminisme génétique indiscutable mais peu caractérisé. Ma thèse a pour but d’étudier le rôle du facteur de transcription Krox20 au cours du développement et de la maturation valvulaire à travers l’analyse de modèles murins. Nous avons montré que ce gène est nécessaire au développement et à la maturation de la valve aortique. L’invalidation de Krox20 chez la souris conduit à une hypertrophie des feuillets aortiques dès les stades fœtaux et à des insuffisances aortiques chez l’adulte. Ces anomalies sont associées à des défauts d’organisation de la matrice extracellulaire en partie liée à une régulation directe de l’expression des collagènes de type I et III. 25% des souris déficientes pour Krox20 présentent une bicuspidie de la valve aortique. Nous avons observé une diminution de l’expression de eNos chez ces mutants et pu mettre en évidence une interaction génétique entre Krox20 et eNos. De plus, nous avons identifié une sous population de cellules des crêtes neurales cardiaques impliquées dans l’apparition de la bicuspidie chez les mutants Krox20. Afin d’explorer le rôle de Krox20 dans la calcification de la valve aortique, nous avons étudié les conséquences de la surexpression de ce gène dans un modèle et montré que lcela induisait une activation de gènes pro-fibrotiques et pro-ostéogénique sans conduire à des dépôts calciques. Krox20 est donc un facteur de transcription important pour la valvulogenèse et à l’homéostasie valvulaire chez l’adulte. Mes travaux ont contribué à l’identification de Krox20 comme gène candidat potentiel aux valvulopathies rencontrées chez l’homme. / Long seen as a consequence of aging and mechanical wear of aortic cusps, aortic valve diseases are currently considered multifactorial diseases, with an indisputable genetic determinism but not well characterized. My thesis aims to study the role of the transcription factor Krox20 during development and maturation of the valve through the analysis of mouse models. We have shown that this gene is necessary for the development and maturation of the aortic valve. Indeed, the deletion of Krox20 in the mouse leads to thickened aortic leaflets from the fetal stage and the onset of aortic valve disease in adults. These anomalies are associated with defects in the organization of the extracellular matrix and more particularly to direct regulsation of collagen type I and type III expression. Our analysis showed that 25% Krox20-/- mice have a bicuspid aortic valve. The analysis of this model has allowed us to identify a population of cardiac neural crest cells involved in the occurrence of this phenotype. In addition, we were able to observe a down regulation of eNos in Krox20-/- embryos and show a genetic interaction between Krox20 and eNos. To address the role of Krox20 in the process of calcification of the aortic valve, we have studied the effects of its overexpression. Our preliminary results indicate that this overexpression leads to activation of pro-fibrotic and pro-osteogenic genes, however, this is not sufficient to induce calcification of aortic valve leaflets.Therefore Krox20 is important for valvulogenesis but also for valvular homeostasis in the adult. My work has contributed to the identification of a potential candidate gene involved in human valve diseases.

Au cours de ma thèse, j'ai étudié le rôle in vivo du facteur de transcription Krox20 durant le développement précoce du cerveau postérieur des vertébrés et durant le processus de myélinisation du système nerveux périphérique. Je me suis plus particulièrement intéressée aux mécanismes impliqués dans la régulation de son activité via son interaction avec divers co-facteurs. Lors du développement embryonnaire, le cerveau postérieur des vertébrés, ou rhombencéphale, présente une segmentation transitoire le long de l'axe antéro-postérieur, aboutissant à la formation d'unités de différenciation neuronales. Le gène maître Krox20, codant un facteur de transcription à doigts de zinc, est exprimé précocement dans le rhombencéphale et est nécessaire à son développement, ainsi qu'à l'organisation correcte des nerfs crâniens. Une étude structure-fonction de Krox20 réalisée in vivo m'a permis de montrer que son activité au niveau du rhombencéphale implique différents domaines de la protéine en fonction des cibles transcriptionnelles considérées. J'ai de plus étudié plus spécifiquement le rôle de ses co-facteurs Nab et Hcf-1, montrant qu'ils jouent respectivement un rôle répresseur et activateur de l'activité de Krox20 lors du développement du rhombencéphale. Krox20 est également un gène-clé du processus de myélinisation du système nerveux périphérique et diverses mutations l'affectant ont été caractérisées chez des patients atteints de neuropathies démyélinisantes héréditaires, nommées maladies de Charcot-Marie-Tooth. J'ai généré une lignée de souris portant l'une de ces mutations, abolissant l'interaction entre Krox20 et les Nab. Ce modèle murin, présentant des défauts similaires à ceux observés chez les patients humains, m'a permis de confirmer le rôle majeur de l'interaction entre Krox20 et les Nab dans le processus de myélinisation. J'ai par ailleurs pu montrer que l'hypomyélinisation observée reposait sur un phénotype complexe, lié à un retard du processus de myélinisation suivi d'une dégradation de la myéline formée. Ceci suggère un rôle majeur de Krox20 et des Nab durant différentes étapes séquentielles de la myélinisation du système nerveux périphérique.

Au cours du développement embryonnaire, le destin d'une cellule est spécifié par l'expression de gènes dits de lignage. Le contrôle de l'expression de ces gènes est essentiel à la cohérence du développement embryonnaire. Pour savoir comment s'effectue ce contrôle, nous avons choisi un modèle de spécification dans le cerveau postérieur des vertébrés, le rhombencéphale. Au cours de son développement, cet organe comprend sept groupes de cellules homogènes, appelés rhombomères (r) et notés de r1 à r7, qui subissent des processus de spécification distincts. La voie de spécification de r3 et r5 est la mieux connue car elle est contrôlée par un facteur unique, Krox20. En l'absence de ce facteur, les cellules de r3 et r5 ne sont pas correctement spécifiées et voient leur destin neuronal modifié. Dans ce travail de thèse, nous dévoilons les mécanismes qui permettent de contrôler le nombre de cellules exprimant le gène Krox20, donc la taille de r3 et r5. Ces mécanismes contrôlent la dynamique de transcription de Krox20, en régulant l'activité de ses éléments régulateurs. Deux éléments, B et C, sont responsables de l'initiation de l'expression de Krox20 ; un troisième, noté A, l'amplifie et la prolonge grâce à une activité autorégulatrice. Nous montrons (i) que les cellules n'acquièrent l'identité r3/r5 que si elles activent l'élément A, (ii) que l'activation de l'élément A suit un mode tout-ou-rien, selon le niveau d'initiation de Krox20. Ces conclusions ont été obtenues par l'analyse d'un modèle mathématique, contraint par des données expérimentales obtenues chez le poisson-zèbre, et suffisamment résolutif pour décrire l'activation de A à l'échelle moléculaire.

Les éléments cis-régulateurs contrôlent l'expression spatio-temporelle des gènes au cours du développement. La segmentation du rhombencéphale en rhombomères (r) établit l'organisation du cerveau postérieur des vertébrés. La spécification et la formation des segments r3 et r5 sont gouvernées par l'expression du facteur de transcription Krox20/Egr2, sous le contrôle de plusieurs éléments cis-régulateurs. Les éléments B (dans r5) et C (dans r3 et r5) sont actifs au démarrage de l'expression de Krox20 alors que l'élément A (dans r3 et r5) est un élément autorégulateur. En générant la délétion de l'élément A dans le génome murin, nous avons montré qu'il est nécessaire au maintien de l'expression de Krox20 dans r3 et r5. De façon inattendue, la délétion de l'élément C n'impacte pas la phase de démarrage mais abolit le maintien de l'expression de Krox20 dans r3 de manière analogue à celle de l'élément A. J'ai mis en évidence par différentes approches génétiques que l'élément C coopère en cis avec l'élément A, lors de la phase d'autorégulation. Plusieurs approches de conformation et d'accessibilité de la chromatine au locus Krox20 indiquent que l'élément A interagit de façon constitutive avec le promoteur et que l'élément C est capable d'affecter l'accessibilité de l'élément A à distance. Parallèlement, j'ai montré que la délétion de l'élément C chez le poisson-zèbre n'entraîne pas de modification de l'expression du gène Krox20 contrairement à la souris malgré un patron d'expression similaire. Ces approches complémentaires ont permis de caractériser le rôle fonctionnel de plusieurs éléments cis-régulateurs contrôlant l'expression d'un gène clef du développement des Vertébrés. / Cis-regulatory elements ensure the specifity and the maintenance of the spatio-temporal gene expression pattern throughout the development of an organism. Segmentation of the hindbrain into rhombomeres (r) establishes the posterior brain organisation in vertebrates. The specification and formation of r3 and r5 are governed by the expression of the transcription factor Krox20/Egr2, controlled by three cis-regulatory elements. Elements B (in r5) and C (in r3 and r5) are active during the initiation of Krox20 expression while element A (in r3 and r5) is an autoregulatory element. By studying the deletion of element A in the mouse genome, we have shown that Krox20 expression is not maintained in absence of this element. Unexpectedly, the deletion of element C does not impair Krox20 initiation but abolishes the maintenance of expression in r3, similarly to element A knock-out. I also showed by different genetic approaches that element C cooperates in cis with element A. Moreover, investigation of chromatin conformation and accessibility in the Krox20 locus indicate that element A and the promoter are engaged in a constitutive interaction and that element C is able to affect the accessibility of element A at a distance. In parallel, the deletion of element C in zebrafish did not reveal any modification in Krox20 expression, despite a similar expression pattern in mouse. These complementary approaches lead to the characterization of the functional role of several cis-regulatory elements driving the expression of a key developmental gene in vertebrates.

The inner ear, the sensory organ responsible for hearing and balance, contains specialized sensory and non-sensory epithelia arranged in a highly complex threedimensional structure. To achieve this complexity, a tight coordination between morphogenesis and cell fate specification is essential during otic development. Tisúes surrounding the otic primordium, and more particularly the adjacent segmented hindbrain, have been implicated in specifying structures along the anteroposterior and dorsoventral axes of the inner ear. In this work we have first characterized the generation and axial specification of the otic neurogenic domain, and second, we have investigated the effects of the mutation of kreisler/MafB -a gene transiently expressed in the rhombomeres 5 and 6 of the developing hindbrain- in early otic patterning and cell specification. We show that kr/kr embryos display an expansion of the otic neurogenic domain, due to defects in otic patterning. Although many reports have pointed to the role of FGF3 in otic regionalization, we provide evidence that FGF3 is not sufficient to govern this process. Neither Krox20 nor Fgf3 null mutant embryos, in which Fgf3 is either downregulated or absent in r5 and r6, present ectopic otic neuroblasts in the otic primordium. However, Fgf3-/-Fgf10-/- double mutants show a phenotype very similar to kr/kr embryos: they present ectopic neuroblasts along the AP and DV otic axes. Finally, and remarkably, partial rescue of the kr/kr phenotype is obtained when Fgf3 or Fgf10 are ectopically expressed in the hindbrain of kr/kr embryos. These results highlight a compensatory mechanism between FGFs, and the importance of hindbrain-derived signals in instructing otic patterning and the establishment of the neurogenic domain.