Techn. Universiẗat, Diss., 2001--Braunschweig.

Die Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) ermöglicht als einzigartige Methode die dreidimensionale Visualisierung der makromolekularen Struktur von Eis-eingebetteten Zellen in ihrem nativen Zustand [Baumeister 2005; Leis et al. 2009]. Ziel dieser Arbeit war es einen universellen Einsatz der Kryo-ET bei eukaryotischen Zellen zu ermöglichen. Dazu wurden neue Ansätze entwickelt bzw. bestehende Methoden optimiert. Da bei der Anwendung der Tomographie die Probendicke mit jedem Kippwinkel zunimmt, gilt momentan die Probendicke (< 1 µm) als limitierender Faktor bei der Kryo-ET. Während prokaryotische Zellen nahezu routinemäßig mittels Kryo-ET untersucht werden können, ist dies bei eukaryotischen Zellen nur partiell in peripheren Arealen oder Ausläufern der Zelle möglich. Dies konnte anhand der Untersuchung von intakten, pluripotenten Stammzellen (P19 Zellen) bestätigt werden. Aufgrund ihrer neuronen-ähnlichen dendritischen Morphologie können diese dünnen Bereiche mit dem Elektronenstrahl durchdrungen werden. So konnte in der 3D-Rekonstruktion eines Zellausläufers ein Mitochondrium in seiner nativen Umgebung visualisiert werden. Zudem wurden mehrere ATP-Synthasen in der Cristaemembran identifiziert, die erstmalig die Existenz von ATP-Synthasedimeren in situ bestätigen. Für die Untersuchung von zellmittigen (dicken) Bereichen müssen jedoch andere Methoden angewendet werden. So ermöglicht die Kryo-Ultramikrotomie das Herstellen von Dünnschnitten (< 100 nm) Eis-eingebetteter Proben. Mit Hilfe dieser Methode wurden in dieser Arbeit Kryo-Schnitte von HL-1 Kardiomyozyten erstellt und tomographisch analysiert. Da die Probe sehr heterogen verteilt ist, ist die Suche nach der Zielstruktur im Elektronenmikroskop sehr zeitaufwendig. Gleichzeitig ist die strahlenempfindliche Probe während der Suche dem Elektronenstrahl ausgesetzt, was die Struktur beeinträchtigen kann. Um die ‚Effizienz’ der Kryo-ET an Kryo-Schnitten zu erhöhen, wurden zwei neue Verfahren implementiert: Einerseits die korrelative Kryo-Fluoreszenzmikroskopie, welche sich zur Suche und Identifikation von Mitochondrien innerhalb des Dünnschnittes unter Flüssigstickstoff (LN2)-Temperatur eignet und andererseits eine neue Methode, die das Aufbringen von Goldkolloiden auf Kryo-Schnitten zum späteren Alignieren der Kippserie ermöglicht. Letztere setzt eine Synthese von 10 nm großem, kolloidalem Gold in Toluol voraus. Nach Zugabe von Isopentan werden die auf dem EM-Trägernetzchen (Grid) angehefteten Kryo-Schnitte bei einer Temperatur von -150°C in diese Suspension getaucht. Des Weiteren wurden verschiedene Trägermaterialien zur Kultivierung von Kardiomyozyten getestet und Osmolalitätsmessungen von unterschiedlichen Kryo-Schutz¬lösungen, welche für das Hochdruck-Verfahren notwendig sind, durchgeführt. Auch hier konnten in den 3D-Rekonstruktionen von Kardiomyozyten die ATP-Synthasen eindeutig in Kryo-Schnitten identifiziert werden. Darüber hinaus gelang die 3D-Visualisierung von zwei Mitochondrien, die sich in der Teilungs- oder Fusionsphase befanden. In einem dieser Mitochondrien sind inorganische Ablagerungen sichtbar. Im Verlauf dieser Dissertation wurde zusätzlich die Methode des Cryo-Planings entwickelt; eine Variante der Kryo-Ultramikrotomie. Bei dieser Technik wird die vitrifizierte Probe direkt auf dem EM-Grid gedünnt. Dieses Verfahren ermöglicht es, Material vom vitrifizierten Eisfilm mittels eines Diamantmessers zu entfernen. Dafür wurde ein spezieller Halter für das Kryo-Ultramikrotom konzipiert und hergestellt. Der Halter erlaubt das Zentrieren und Klemmen eines EM-Grids. Um das Abtragen kleinerer Bereiche der Eisoberfläche zu ermöglichen, wurde ein 1 mm breites Diamantmesser angefertigt. Die Analyse der gedünnten Proben mittels Kryo-Scanning Electron Microscopy (SEM) zeigte eine gleichmäßig abgetragene Oberfläche. Schneideartefakte, wie sie bei der Kryo-Ultramikrotomie auftreten, wurden nicht beobachtet. Zudem sind die zellulären Proben im gedünnten Bereich des Eisfilms sehr leicht identifizierbar. Brüche, die möglicherweise durch den Probeneinbau im Eisfilm entstehen, konnten mittels Kryo-SEM bis dato nicht beobachtet werden. Die theoretischen Betrachtungen ergaben, dass unter Verwendung des Cryo-Planings als alleinige Methode elektronentransparente Bereiche (< 1 µm Dicke) hergestellt werden können. Bisher konnte jedoch keine elektronentomographische Untersuchung einer geplanten Probe erfolgen, da sie sich als zu dick erwies. Dies ist darauf zurückzuführen, dass mit dem Stereomikroskop nur eine sehr grobe Abschätzung der tatsächlichen Dicke des abgetragenen Bereichs möglich ist.

Die Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) ermöglicht als einzigartige Methode die dreidimensionale Visualisierung der makromolekularen Struktur von Eis-eingebetteten Zellen in ihrem nativen Zustand [Baumeister 2005; Leis et al. 2009]. Ziel dieser Arbeit war es einen universellen Einsatz der Kryo-ET bei eukaryotischen Zellen zu ermöglichen. Dazu wurden neue Ansätze entwickelt bzw. bestehende Methoden optimiert. Da bei der Anwendung der Tomographie die Probendicke mit jedem Kippwinkel zunimmt, gilt momentan die Probendicke (< 1 µm) als limitierender Faktor bei der Kryo-ET. Während prokaryotische Zellen nahezu routinemäßig mittels Kryo-ET untersucht werden können, ist dies bei eukaryotischen Zellen nur partiell in peripheren Arealen oder Ausläufern der Zelle möglich. Dies konnte anhand der Untersuchung von intakten, pluripotenten Stammzellen (P19 Zellen) bestätigt werden. Aufgrund ihrer neuronen-ähnlichen dendritischen Morphologie können diese dünnen Bereiche mit dem Elektronenstrahl durchdrungen werden. So konnte in der 3D-Rekonstruktion eines Zellausläufers ein Mitochondrium in seiner nativen Umgebung visualisiert werden. Zudem wurden mehrere ATP-Synthasen in der Cristaemembran identifiziert, die erstmalig die Existenz von ATP-Synthasedimeren in situ bestätigen. Für die Untersuchung von zellmittigen (dicken) Bereichen müssen jedoch andere Methoden angewendet werden. So ermöglicht die Kryo-Ultramikrotomie das Herstellen von Dünnschnitten (< 100 nm) Eis-eingebetteter Proben. Mit Hilfe dieser Methode wurden in dieser Arbeit Kryo-Schnitte von HL-1 Kardiomyozyten erstellt und tomographisch analysiert. Da die Probe sehr heterogen verteilt ist, ist die Suche nach der Zielstruktur im Elektronenmikroskop sehr zeitaufwendig. Gleichzeitig ist die strahlenempfindliche Probe während der Suche dem Elektronenstrahl ausgesetzt, was die Struktur beeinträchtigen kann. Um die ‚Effizienz’ der Kryo-ET an Kryo-Schnitten zu erhöhen, wurden zwei neue Verfahren implementiert: Einerseits die korrelative Kryo-Fluoreszenzmikroskopie, welche sich zur Suche und Identifikation von Mitochondrien innerhalb des Dünnschnittes unter Flüssigstickstoff (LN2)-Temperatur eignet und andererseits eine neue Methode, die das Aufbringen von Goldkolloiden auf Kryo-Schnitten zum späteren Alignieren der Kippserie ermöglicht. Letztere setzt eine Synthese von 10 nm großem, kolloidalem Gold in Toluol voraus. Nach Zugabe von Isopentan werden die auf dem EM-Trägernetzchen (Grid) angehefteten Kryo-Schnitte bei einer Temperatur von -150°C in diese Suspension getaucht. Des Weiteren wurden verschiedene Trägermaterialien zur Kultivierung von Kardiomyozyten getestet und Osmolalitätsmessungen von unterschiedlichen Kryo-Schutz¬lösungen, welche für das Hochdruck-Verfahren notwendig sind, durchgeführt. Auch hier konnten in den 3D-Rekonstruktionen von Kardiomyozyten die ATP-Synthasen eindeutig in Kryo-Schnitten identifiziert werden. Darüber hinaus gelang die 3D-Visualisierung von zwei Mitochondrien, die sich in der Teilungs- oder Fusionsphase befanden. In einem dieser Mitochondrien sind inorganische Ablagerungen sichtbar. Im Verlauf dieser Dissertation wurde zusätzlich die Methode des Cryo-Planings entwickelt; eine Variante der Kryo-Ultramikrotomie. Bei dieser Technik wird die vitrifizierte Probe direkt auf dem EM-Grid gedünnt. Dieses Verfahren ermöglicht es, Material vom vitrifizierten Eisfilm mittels eines Diamantmessers zu entfernen. Dafür wurde ein spezieller Halter für das Kryo-Ultramikrotom konzipiert und hergestellt. Der Halter erlaubt das Zentrieren und Klemmen eines EM-Grids. Um das Abtragen kleinerer Bereiche der Eisoberfläche zu ermöglichen, wurde ein 1 mm breites Diamantmesser angefertigt. Die Analyse der gedünnten Proben mittels Kryo-Scanning Electron Microscopy (SEM) zeigte eine gleichmäßig abgetragene Oberfläche. Schneideartefakte, wie sie bei der Kryo-Ultramikrotomie auftreten, wurden nicht beobachtet. Zudem sind die zellulären Proben im gedünnten Bereich des Eisfilms sehr leicht identifizierbar. Brüche, die möglicherweise durch den Probeneinbau im Eisfilm entstehen, konnten mittels Kryo-SEM bis dato nicht beobachtet werden. Die theoretischen Betrachtungen ergaben, dass unter Verwendung des Cryo-Planings als alleinige Methode elektronentransparente Bereiche (< 1 µm Dicke) hergestellt werden können. Bisher konnte jedoch keine elektronentomographische Untersuchung einer geplanten Probe erfolgen, da sie sich als zu dick erwies. Dies ist darauf zurückzuführen, dass mit dem Stereomikroskop nur eine sehr grobe Abschätzung der tatsächlichen Dicke des abgetragenen Bereichs möglich ist.

Preparation of biological samples for transmission electron microscopy is not a trivial task. The samples must withstand a vacuum environment present inside a microscope, and it is often necessary to use non-physiological procedures for their processing. These procedures usually involve aldehyde-based fixation, replacing water with alcohol (i.e. dehydration/substitution), and embedding into a resin, which creates support for the subsequent preparation of thin sections that can be placed into the microscope. In the last decade, the method of cryo-fixation (vitrification) using ultra-fast high-pressure freezing followed by freeze substitution and low-temperature resin embedding gained a dominant position in the cell biology research. In this way, a range of biological samples with a thicknesses up to several hundreds of micrometers was successfully vitrified to a state that was closely related to their in vivo structures. The cryo-fixation of isolated biological objects (with a limited thickness up to several micrometers) is possible in a thin layer of vitrified water by plunge freezing at ambient pressure. In combination with electron cryo-microscopy, this method has become the most effective and fundamental principle for the high-resolution studies and image analysis of fully hydrated samples...

Preparation of biological samples for transmission electron microscopy is not a trivial task. The samples must withstand a vacuum environment present inside a microscope, and it is often necessary to use non-physiological procedures for their processing. These procedures usually involve aldehyde-based fixation, replacing water with alcohol (i.e. dehydration/substitution), and embedding into a resin, which creates support for the subsequent preparation of thin sections that can be placed into the microscope. In the last decade, the method of cryo-fixation (vitrification) using ultra-fast high-pressure freezing followed by freeze substitution and low-temperature resin embedding gained a dominant position in the cell biology research. In this way, a range of biological samples with a thicknesses up to several hundreds of micrometers was successfully vitrified to a state that was closely related to their in vivo structures. The cryo-fixation of isolated biological objects (with a limited thickness up to several micrometers) is possible in a thin layer of vitrified water by plunge freezing at ambient pressure. In combination with electron cryo-microscopy, this method has become the most effective and fundamental principle for the high-resolution studies and image analysis of fully hydrated samples...

Konstanz, Univ., Diss., 2008. / Aus: Ersch. auch im Verl. Dr. Hut (http://www.dr.hut-verlag.de), ISBN 978-3-89963-780-9.

The present study focused on clarification of the roles of environmental osmolality and ion composition in the initiation of spermatozoa motility in different freshwater fish species. Additionally, the role of osmotic and ionic agents in sturgeon spermatozoa maturation was investigated. A first aim of the present study focused on studies of osmotic regulation of spermatozoa volume alterations in different fish species. This led to the discovery that spermatozoa swelling are species-specific: fish sperm with ionic mode of motility activation (sturgeon, trout) has no capacity for swelling, In contrast to carp sperm (osmotic mode of activation) for which volume correlates with environmental osmolality. A second aim was to apply the capacity for swelling in carp spermatozoa to improve the cryopreservation procedure relative to post-thaw sperm quality. Post-thaw motility parameters and ability to fertilize eggs were measured and compared with non-treated sperm. As a result, higher post-thaw motility rate, spermatozoa velocity, and fertilization rate were observed in sperm pretreated with hypotonic solutions compared to non-treated sperm. Thus, our results demonstrate for the first time, that spermatozoa ability for hypotonic changes could be used for improvement of cryopreservation procedure. A third aim of this study was the investigation of the role of environmental osmolality and ion composition in fish sperm motility. Sturgeons and salmonids sperm was activated in media of differing ionic and osmotic composition. Even though environmental Ca2+ concentration is not crucial in conditions of Na+ presence, a minimal intracellular free Ca2+ concentration should be present in sturgeon spermatozoa for initiation of motility. Alteration of osmolality does not seem to play a major regulatory role in trout spermatozoa activation. Alteration of sperm sensitivity to Ca2+ was detected during spawning, according to seasonality. Low motility rate was detected in brook trout spermatozoa at the end of the spawning period. However, a Ca2+ concentration increase up to 10 mM in activating media led to activate motility in at least 85% of the spermatozoa, which suggests a decrease of sperm sensitivity to Ca2+ at the end of the spawning season. The fourth aim was the study of the role of osmotic and ionic agents in sterlet spermatozoa maturation. Our results demonstrate that sturgeon testicular spermatozoa lack capability for motility activation and fertilization. During spawning, sperm is released from testis, pass through the kidney where it is mixed with urine, into the Wolffian duct. We demonstrated for the first time, that testicular sperm incubation with urine controls in vivo maturation, but can be performed in vitro as well (Chapter 6). We detected that sperm maturation does not occur under conditions of Ca2+ deficiency, suggesting that Ca2+ plays an essential role in this process (Chapter 7). During this maturation process, we observed a gradual decrease of spermatozoa sensitivity to environmental Ca2+. We found that testicular spermatozoa motility could be activated only when the Ca2+ concentration is high. Thus, we hypothesize that maturation process might be controlled by Ca2+ influx into the cell with subsequent loading of some Ca2+ stores. To our knowledge, these results provide, for the first time, evidence for the presence of Ca2+ stores in sturgeon spermatozoa. As a conclusion, the results of this study shed light on osmotic and ionic regulation of sperm motility in different fish species. The involvement of specific ions together with osmotic shock in fish spermatozoa maturation and aging were clarified. These findings broaden the possibilities of in vitro sperm manipulation in fisheries practice such as the use of sturgeon testicular spermatozoa, improvement of poor quality sperm in salmonids at the end of spawning season, and increase of carp sperm cryoresistance.

Wasser verhält sich aus physikalischer Sicht beim Kristallisationsprozess im Vergleich zu anderen molekularen Systemen anomal. So ist aus den Erfahrungen des täglichen Lebens bekannt, dass Wasser sich beim Gefrieren ausdehnt, sodass das entstehende Eis aufgrund seiner angenommenen Festkörperstruktur eine geringere Dichte aufweist und auf der festen Phase aufschwimmt. Das wachsende Volumen des Festkörpers sowie die Ausbildung scharfer Eiskristallnadeln führen immer dann zu Komplikationen, wenn der Expansionsprozess durch feste Begrenzungen limitiert ist. Dies ist z. B. in zellulären Strukturen sowie deren Untereinheiten der Fall. Aus diesem Grund sind für die Untersuchung kryogener biologischer Proben sowohl die Gefriertechnik als auch die angewendete Präparationstechnik von essentieller Bedeutung. Diese stellen bereits seit den 1950er Jahren im Bereich der Kryo-Elektronenmikroskopie eine vielgenutzte Methode dar. Um diese Techniken auch für die, nur im Ultrahochvakuum verwendete, Nicht-Kontakt-Rasterkraftmikroskopie nutzbar machen zu können, muss zunächst eine experimentelle Grundlage geschaffen werden, welche die Implementierung verschiedener Präparationstechniken kryogener Proben in ein Ultrahochvakuum-System erlaubt. Die Arbeit beschreibt neben den gebräuchlichsten Gefrier- und Kryo-Präparationstechniken den detaillierten Aufbau einer entsprechenden Anlage. Um deren Funktionalität zu zeigen, wird die Gefrierätztechnik eingesetzt. Primäre, einfache Untersuchungsobjekte hierfür bilden Eisfilme, die auf ein Goldsubsubstrat aufgebracht werden. Für das Freiätzen von unter der Eisschicht befindlichen biologischen Strukturen ist es von zentraler Bedeutung, die Ätzparameter soweit abschätzen zu können, dass die Struktur für das rasterkraftmikroskopische Messverfahren zugänglich ist. Hierzu vermittelt die Arbeit ebenfalls erste Einblicke. Als einfaches biologisches System für grundlegende Experimente dienen auf diesem Gebiet bakterielle Hüllproteine (S-Schichten), deren Proteinmonomere auf Substratoberflächen außerhalb ihrer zellulären Umgebung durch Selbstorganisation gitterartige Strukturen ausbilden.

This work is focused on the visualization and thus in the aid in finding explanations for the behavior of polymer structures as they exist in solution. For this aim, preparation and imaging techniques based on cryo-TEM protocols were developed for a large variety of polymeric specimens using new commercially available devices and the results were compared with the findings of other means of structural investigations. The systems used in this work were chosen, as their investigations can be adapted to other polymer systems by slight adaptation of the preparation procedures.

The aim of this thesis is to investigate applicability of regulariza- tion by Krylov subspace methods to discrete inverse problems arising in single particle analysis (SPA). We start with a smooth model formulation and describe its discretization, yielding an ill-posed inverse problem Ax ≈ b, where A is a lin- ear operator and b represents the measured noisy data. We provide theoretical background and overview of selected methods for the solution of general linear inverse problems. Then we focus on specific properties of inverse problems from SPA, and provide experimental analysis based on synthetically generated SPA datasets (experiments are performed in the Matlab enviroment). Turning to the solution of our inverse problem, we investigate in particular an approach based on iterative Hybrid LSQR with inner Tikhonov regularization. A reliable stopping criterion for the iterative part as well as parameter-choice method for the inner regularization are discussed. Providing a complete implementation of the proposed solver (in Matlab and in C++), its performance is evaluated on various SPA model datasets, considering high levels of noise and realistic distri- bution of orientations of scanning angles. Comparison to other regularization methods, including the ART method traditionally used in SPA,...