Tubulin post-translational modifications (tPTMs) are currently studied as vital, yet obscure, cytoskeletal regulators. Their regulatory function relies on the spatiotemporal control over the activity of multiple tubulin modifying enzymes that functionalize microtubules, enabling their differentiation. The cilium, one of the organelles with the richest tPTMs diversity, has been studied with determination for the last decades, allowing the interrogation of the molecular processes that give rise to its function. The inner structure of this thin organelle, the axoneme, comprises a microtubule scaffold periodically decorated with macromolecular complexes whose characterization has been achieved with pseudoatomic detail. The molecular distribution and mechanism of action of tPTMs in cilia remain elusive. Using a combination of immunolabelling and cryoelectron tomography we interrogated the molecular function two tPTMs in the axonemal context. We showed that tubulin polyglycylation spanned most of the microtubular surface and was required for axonemal dynein activity regulation and male fertility. Additionally, there was an enrichment of polyglutamylation on a single microtubule protofilament, forming a pattern complementary to that of polyglycylation, that was required for proper coupling of microtubule sliding and bending forces during ciliary beating.

Sowohl die kotranslationale Translokation von sekretorischen Proteinen durch die Membran als auch die Insertion von Membranproteinen sind essentielle Prozesse in allen lebenden Zellen. Sie erfordern die Sortierung des translatierenden Ribosoms zur Membran mittels des Signalerkenungspartikels (SRP), eines im Verlauf der Evolution konservierten Ribonukleoprotein-Partikels. SRP erkennt die Signalsequenz einer wachsenden Proteinkette, sobald diese aus dem Ribosom hervortritt. Die Bindung von SRP führt zum Anhalten der Peptidelongation (Elongationsarrest) und zum Andocken an den membrangebundenen SRP-Rezeptor (SR). In dieser Arbeit wird die 12 Å Kryo-Elektronenmikroskopie-Struktur eines Sortierungs-Komplexes dargestellt, der aus dem Säugetier-SRP gebunden an ein aktives Ribosom mit Signalsequenz besteht. Ein erstes molekulares Modell von SRP in dieser Konformation wurde erzeugt. Es zeigt wie die S-Domäne von SRP die große ribosomale Untereinheit nahe dem Peptidtunnel-Ausgang kontaktiert, um dort die Signalsequenz zu binden. Außerdem wird deutlich wie die Alu-Domäne von SRP in die Bindungsstelle für Elongationsfaktoren hineinreicht, wodurch die Elongationsarrest-Aktivität der Alu-Domäne erklärt wird. Auf dieser Basis konnte ein erstes Struktur-basiertes Modell der ersten Schritte der kotranslationalen Proteinsortierung entworfen werden. Darüberhinaus wurde auch der Schritt des Andockens an die Membran visualisiert, indem die Struktur des Ribosom-SRP-SR-Komplexes durch Kryo-EM gelöst wurde. Erste Schlüsse hinsichtlich des Mechanismus, der das Ribosom vom SRP zum Translokon transferiert, können hier gezogen werden. Als Nebenergebnis konnte durch die erreichte hohe Auflösung die Position des wichtigen ribosomalen Proteins L30e in der Kryo-EM-Struktur des Weizenkeim-Ribosoms idenifiziert werden. / Cotranslational translocation of proteins across or into membranes is a vital process in all kingdoms of life. It requires targeting of the translating ribosome to the membrane by the signal recognition particle (SRP), an evolutionary conserved ribonucleoprotein particle. SRP recognizes signal sequences of nascent protein chains emerging from the ribosome. Subsequent binding of SRP leads to pausing of peptide elongation and docking to the membrane-bound SRP receptor. Here, the 12 Å cryo-electron microscopy structure of a targeting complex is presented consisting of mammalian SRP bound to an active 80S ribosome carrying a signal sequence. A molecular model of SRP in this functional conformation was generated. The model reveals how the S-domain of SRP contacts the large ribosomal subunit at the nascent chain exit site to bind the signal sequence, and that the Alu-domain reaches into the elongation factor binding site of the ribosome explaining its elongation arrest activity. A molecular model of the first steps of protein targeting is presented. Moreover, also the docking step has been visualized by solving a cryo-EM structure of the ribosome-SRP complex bound to the SRP receptor. This structure provides first hints regarding the mechanism of ribosome transfer to the translocon. As a side result the position of the functionally significant ribosomal protein L30e has been identified in the high resolution maps of the wheat germ ribosome.

No description available.

No description available.

Tato práce se zabývá strukturní studií dvou proteinů: proteinu Tail morphogenetic protein H (TmpH) bakteriofága 812, který napadá Zlatého stafylokoka (Staphylococcus aureus) a hexamerinu z potemníka (Tribolium castaneum). S. aureus je jedním z nejvíce rezistentních patogenů způsobující onemocnění s vysokou morbiditou a mortalitou. Bakteriofág 812 je schopen infikovat a lyzovat 95 % kmenů S. aureus a má potenciální využití ve fágové terapii. Protein TmpH je součástí virionu tohoto fága. V rámci této práce bylo připraveno několik plazmidů nesoucích gen TmpH, které byly použity pro rekombinantní expresi proteinu v buňkách E. coli BL21(DE3). Protein byl vyčištěn afinitní a gelovou chromatografií. Pro čistý protein byly optimalizovány krystalizační podmínky. Hexamerin je nejhojnějším proteinem larev a kukel hmyzu s dokonalou proměnou. V průběhu metamorfózy hexamerin slouží jako zdroj aminokyselin. V rámci této práce byl hexamerin izolován z kukel potemníka T. castaneum. Pro stanovení struktury hexamerinu byly použity dvě metody: rentgenová krystalografie a kryo-elektronová mikroskopie. Byly optimalizovány podmínky pro růst krystalů a vypěstovány krystaly vhodné pro sběr difrakčních dat. Nicméně struktura hexamerinu byla rychleji vyřešena kryo-elektronovou mikroskopií s rozlišením 3.2 . Znalost struktury hexamerinu umožní pochopení jeho funkce v regulaci vývoje hmyzu s dokonalou proměnou.

This work is focused on the visualization and thus in the aid in finding explanations for the behavior of polymer structures as they exist in solution. For this aim, preparation and imaging techniques based on cryo-TEM protocols were developed for a large variety of polymeric specimens using new commercially available devices and the results were compared with the findings of other means of structural investigations. The systems used in this work were chosen, as their investigations can be adapted to other polymer systems by slight adaptation of the preparation procedures.

Zusammenfassung Thema dieser Arbeit sind zwei zentrale biochemische Aspekte der Proteinbiosynthese , wobei das Ribosom eine zentrale Komponente darstellt: erstens wird ein spezieller Faktor des Elongationszyklus in Pilzen, eEF3, und zweitens der proteinleitende Kanal bei der kotranslationalen Proteintranslokation durch die Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) betrachtet. Für die Elongation der Polypeptidkette benötigen alle Organismen zwei Elongationsfaktoren, die GTPasen eEF1A (EF-Tu in Prokaryoten) und eEF2 (EF-G in Prokaryoten). Bei Fungi wird noch ein dritter Elongationsfaktor, eEF3, benötigt. Dieser Faktor ist eine ATPase mit ABC-Kassetten-Domänen. Durch einen nicht bekannten Mechamismus stimuliert er in Gegenwart von ATP die eEF1A-abhängige Bindung von Aminoacyl-tRNA an die ribosomale A-Stelle. Es wurde vorgeschlagen, dass eEF3 die Freisetzung von deacylierter tRNA aus der ribosomalen E-Stelle ermöglicht, und dadurch über allosterische Kopplung die Affinität der A-Stelle für Aminoacyl-tRNA erhöht. In dieser Arbeit wird die Kryo-EM Struktur von ribosomengebundenem eEF3 bei 13,3 Å vorgestellt. Dabei zeigt sich eine vollig neue ribosomale Bindungsstelle für eEF3 von der aus tatsächlich die Affinität für tRNA in der ribosomalen E-Stelle moduliert werden kann. Mit Hilfe der Kristallstruktur von eEF3 wurde ein molekulares Modell für eEF3 in seiner funktionalen Konformation generiert, welches die strukturelle Basis für die Aktivität dieses ABC-Proteins im Kontext der Translation liefert. Bei der kotranslationalen Translokation stellt der heterotrimere Sec61-Komplex einen signalsequenzgesteuerten proteinleitenden Kanal (PCC) dar, der die Translokation eines sekretorischen Proteins durch, oder die Integration von Membranproteinen in die ER-Membran erlaubt. Es wird angenommen, dass der aktive proteinleitende Kanal im ribosomengebundenen Zustand aus einer oligomeren Struktur mit mehreren Kopien des Sec61-Heterotrimers besteht. Die Kristallstruktur eines inaktiven PCC zeigt jedoch nur ein einziges Heterotrimer (Monomer), das auch im aktiven Zustand funktional sein könnte. In dieser Arbeit wird eine Kryo-EM-Struktur des aktiven proteinleitenden Kanals im Komplex mit einem translatierenden Ribosom aus Hefe präsentiert, die die bislang detailierteste Elektronendichtekarte für den PCC zeigt. Als charakteristisches Merkmal kann eine trichterförmige Pore auf der zytosolischen Seite visualisiert werden. Es wurden verschiedene molekulare Modelle für den aktiven Zustand in die Elektronendichte gedockt. Obwohl eine genaue molekulare Interpretation durch die Auflösung (12,3 Å) nach wie vor limitiert ist, erscheint es sehr wahrscheinlich, dass nur ein einziges, geöffnetes Sec61-Heterotrimer im aktiven Kanal vorliegt. / This work presents cryo-EM structures of two active ribosomal ligands in yeast, namely eEF3 and Sec61. Protein synthesis requires two canonical elongation factors in all kingdoms. These are the GTPases eEF1A (EF-Tu in prokaryotes) and eEF2 (EF-G in prokayotes). In fungi, a third elongation factor eEF3 is required, which belongs to the ATP-binding cassette- (ABC-) protein family. This factor is essential for the binding of the aminoacyl-tRNA-eEF1A-GTP ternary complex to the A site of the ribosome and has been suggested to do so by facilitating the clearance of deacyl-tRNA from the ribosomal E-site. The cryo-EM structure of the ATP-bound form of eEF3 in complex with an 80S ribosome shows that eEF3 binds the ribosome in the post-translocational conformation using a novel binding site. From there the affinity for tRNA in the ribosomal E site could be easily modified. Using the crystal structure of eEF3, a molecular model for eEF3 was generated, which provides the structural basis for the activity of an ABC protein in the context of translation. In co-translational translocation the trimeric Sec61-complex serves as a signal sequence-gated protein-conducting channel (PCC) which allows the translocation of a secetory protein through and the integration of a membrane protein into the lipid bilayer of the ER. Bound to a ribosome, the active PCC seems to have an oligomeric structure consisting of several copies of Sec61-trimers. The crystal structure of an inactive PCC, however, shows only a single heterotrimer (monomer) which could also be functional in the active state. The cryo-EM structure of the active PCC in complex with a translating ribosome shows the hitherto most detailed electron density map for the PCC. The most characteristic feature is a funnel-shaped off-centered pore at the cytosolic side. Several models for the active state were docked into the EM-density. Although a precise molecular interpretation is limited by the resolution (12, 3 Å), a single copy of an opened Sec61-heterotrimer seems to be the most reasonable fit for the density.

<p>Detta är ett examensarbete som genomförts hos Göteborg Energi AB och syftar till att utreda omkryogen uppgradering av biogas med fördel kan ske genom att producera nödvändig kyla medvärmedriven absorptionskylmaskin. Göteborg Energi är en av tre parter som tillsammans ska bygga enbiogasanläggning i Lidköping som ska vara i drift 2010. Anläggningen ska producera 30 GWhflytande biogas per år.</p><p>Arbetet utreder om det är fördelaktigt ur ekonomiskt, energimässigt och miljömässigt perspektiv attuppgradera biogas med kryogen teknik med värmeproducerad kyla. En jämförelse görs först medkryogen teknik där kylan är producerad med el och sen med andra uppgraderingstekniker. Som stödhar två olika processimuleringsprogram används, Hysys och DESIGN II.</p><p>Resultatet visar att energianvändningen ökar då värmedriven kyla används i jämförelse med kylaproducerad med el. 0,47 kW/Nm3 rågas för kryo med absorptionskyla och 0,29 kW/Nm3 rågas medel. Om det finns avsättning för spillvärmen kan energianvändningen i uppgraderingen minska till 0,29kW/Nm3 rågas och 0,15 kW/Nm3 rågas för systemet med värmedriven respektive eldriven kyla. Ijämförelse med andra uppgraderingstekniker ligger 0,47 kW/Nm3 bland de teknikerna med högstenergianvändning medans 0,29 kW/Nm3 placerar sig bland de teknikerna med lägstenergianvändning.</p><p>Resultat visar att klimatpåverkan från uppgraderingen, som kommer av metanslip och elanvändningen,minskar marginellt om kylan produceras med värme istället för el. Resultatet varierar mycket beroendepå hur koldioxidutsläppen från marginalelen beräknas. I jämförelse med andra uppgraderingsteknikerligger kryo lägre än de flesta andra. Undantaget är COOAB-tekniken som är överlägset bäst tack varalågt metanslip och liten elanvändning.</p><p>Ekonomisk jämförelse med andra uppgraderingstekniker visar att kostnaden för energianvändningenligger i samma nivå som övriga uppgraderingstekniker i jämförelsen, ca 0,03 kr/kWh uppgraderad gas.Om det finns avsättning för spillvärmen sjunker kostnaden till 0,024 och 0,02 kr/kWh uppgraderad gasför kryoteknik med kyla ifrån värme respektive el.</p><p>Min slutsats är att utnyttjande av spillvärmen är av stor vikt för att få god ekonomi och lågenergianvändning med kryogen uppgradering. En marginellt förbättrad miljöprestanda kan erhållas omnödvändig kyla produceras med värme istället för el då kryogen uppgradering används. Annars är detalltid mer fördelaktigt att använda el för att producera nödvändig kyla.</p> / <p>This is a master thesis that has been carried out at Göteborg Energi AB. It refers to investigate ifcryogenic upgrading of biogas with advantage can be done by producing necessary cold with a heatdriven absorption cooling machine. Göteborg Energi is one of three actors that together will build abiogas plant in Lidköping that will be up and running in 2010. The plant will produce 30 GWhliquefied biogas annually.</p><p>This thesis investigastes whether it is advantageous, to upgrade biogas with heat driven cooling, in aperspective of economy, energy use and environment. It compares cryogenic upgrading with coldproduced by electricity, but also by other techniques. Two different process simulation softwares havebeen used as support to this thesis; Hysys and DESIGN II.</p><p>The result shows that energy usage increases when the necessary cold is produced with heat instead ofelectricity; 0,47 kW/Nm3 rawgas for cryo upgrade with absorptions cooling and 0,29 kW/Nm3 rawgaswith cold produced by electricity. If it’s possible to use the waste heat to warm the digester, the energyconsumption for the upgrading can be reduced to 0,29 kW/Nm3 for the system with heat-driven cold,and 0,15 kW/Nm3 rawgas for cold produced by electricity. In comparison with other techniques forupgrading, 0,47 kW/Nm3 rawgas is a high value while 0,29 kW/Nm3 rawgas is among the lowestvalues for energy use.</p><p>The impact on the climate emerges from the use of electricity and when methane slips out from theupgrading plant. The result shows that the impact on the climate is slightly decreased for cryogenicupgrading when the cold is produced with a heat driven absorption machine instead of electricity. Theresult varies a lot due to how one calculate the emission of carbon dioxide from the electricity on themargin. In comparison with other upgrading techniques, the climate impact from cryogenic upgradingis less, other than the COOAB-technique that is superior because of its low methane slip and lowdemand of electricity.</p><p>An economical comparison shows that the cost for energy usage is about the same for cryogenic as forother techniques; approximately 0,03 SEK/kWh upgraded gas. If one can utilize the waste heat, thecost would be decreased to 0,024 and 0,02 SEK/kWh upgraded gas for the system with cryogenicupgrading with cooling from absorption machine respectively cooling produced with electricity.</p><p>My conclusion is that the utilization of the waste heat is essential if one wishes to get good economyand low energy use for the upgrading of biogas with cryogenic methods. A slightly increasedenvironmental improvement can be received if one change the cold production from electricity to heat,otherwise it is always more advantageous to use electricity for cryogenic methods.</p>

Detta är ett examensarbete som genomförts hos Göteborg Energi AB och syftar till att utreda omkryogen uppgradering av biogas med fördel kan ske genom att producera nödvändig kyla medvärmedriven absorptionskylmaskin. Göteborg Energi är en av tre parter som tillsammans ska bygga enbiogasanläggning i Lidköping som ska vara i drift 2010. Anläggningen ska producera 30 GWhflytande biogas per år. Arbetet utreder om det är fördelaktigt ur ekonomiskt, energimässigt och miljömässigt perspektiv attuppgradera biogas med kryogen teknik med värmeproducerad kyla. En jämförelse görs först medkryogen teknik där kylan är producerad med el och sen med andra uppgraderingstekniker. Som stödhar två olika processimuleringsprogram används, Hysys och DESIGN II. Resultatet visar att energianvändningen ökar då värmedriven kyla används i jämförelse med kylaproducerad med el. 0,47 kW/Nm3 rågas för kryo med absorptionskyla och 0,29 kW/Nm3 rågas medel. Om det finns avsättning för spillvärmen kan energianvändningen i uppgraderingen minska till 0,29kW/Nm3 rågas och 0,15 kW/Nm3 rågas för systemet med värmedriven respektive eldriven kyla. Ijämförelse med andra uppgraderingstekniker ligger 0,47 kW/Nm3 bland de teknikerna med högstenergianvändning medans 0,29 kW/Nm3 placerar sig bland de teknikerna med lägstenergianvändning. Resultat visar att klimatpåverkan från uppgraderingen, som kommer av metanslip och elanvändningen,minskar marginellt om kylan produceras med värme istället för el. Resultatet varierar mycket beroendepå hur koldioxidutsläppen från marginalelen beräknas. I jämförelse med andra uppgraderingsteknikerligger kryo lägre än de flesta andra. Undantaget är COOAB-tekniken som är överlägset bäst tack varalågt metanslip och liten elanvändning. Ekonomisk jämförelse med andra uppgraderingstekniker visar att kostnaden för energianvändningenligger i samma nivå som övriga uppgraderingstekniker i jämförelsen, ca 0,03 kr/kWh uppgraderad gas.Om det finns avsättning för spillvärmen sjunker kostnaden till 0,024 och 0,02 kr/kWh uppgraderad gasför kryoteknik med kyla ifrån värme respektive el. Min slutsats är att utnyttjande av spillvärmen är av stor vikt för att få god ekonomi och lågenergianvändning med kryogen uppgradering. En marginellt förbättrad miljöprestanda kan erhållas omnödvändig kyla produceras med värme istället för el då kryogen uppgradering används. Annars är detalltid mer fördelaktigt att använda el för att producera nödvändig kyla. / This is a master thesis that has been carried out at Göteborg Energi AB. It refers to investigate ifcryogenic upgrading of biogas with advantage can be done by producing necessary cold with a heatdriven absorption cooling machine. Göteborg Energi is one of three actors that together will build abiogas plant in Lidköping that will be up and running in 2010. The plant will produce 30 GWhliquefied biogas annually. This thesis investigastes whether it is advantageous, to upgrade biogas with heat driven cooling, in aperspective of economy, energy use and environment. It compares cryogenic upgrading with coldproduced by electricity, but also by other techniques. Two different process simulation softwares havebeen used as support to this thesis; Hysys and DESIGN II. The result shows that energy usage increases when the necessary cold is produced with heat instead ofelectricity; 0,47 kW/Nm3 rawgas for cryo upgrade with absorptions cooling and 0,29 kW/Nm3 rawgaswith cold produced by electricity. If it’s possible to use the waste heat to warm the digester, the energyconsumption for the upgrading can be reduced to 0,29 kW/Nm3 for the system with heat-driven cold,and 0,15 kW/Nm3 rawgas for cold produced by electricity. In comparison with other techniques forupgrading, 0,47 kW/Nm3 rawgas is a high value while 0,29 kW/Nm3 rawgas is among the lowestvalues for energy use. The impact on the climate emerges from the use of electricity and when methane slips out from theupgrading plant. The result shows that the impact on the climate is slightly decreased for cryogenicupgrading when the cold is produced with a heat driven absorption machine instead of electricity. Theresult varies a lot due to how one calculate the emission of carbon dioxide from the electricity on themargin. In comparison with other upgrading techniques, the climate impact from cryogenic upgradingis less, other than the COOAB-technique that is superior because of its low methane slip and lowdemand of electricity. An economical comparison shows that the cost for energy usage is about the same for cryogenic as forother techniques; approximately 0,03 SEK/kWh upgraded gas. If one can utilize the waste heat, thecost would be decreased to 0,024 and 0,02 SEK/kWh upgraded gas for the system with cryogenicupgrading with cooling from absorption machine respectively cooling produced with electricity. My conclusion is that the utilization of the waste heat is essential if one wishes to get good economyand low energy use for the upgrading of biogas with cryogenic methods. A slightly increasedenvironmental improvement can be received if one change the cold production from electricity to heat,otherwise it is always more advantageous to use electricity for cryogenic methods.

Zobrazovanie pomocou kryo-elektrónovej mikroskopie má svoje nezastúpiteľné miesto v analýze viacerých biologických štruktúr. Lokalizácia buniek kultivovaných na mriežke a ich segmentácia voči pozadiu alebo kontaminácii je základom. Spolu s vývojom viacerých metód hlbokého učenia sa podstatne zvýšila úspešnosť úloh sémantickej segmentácie. V tejto práci vyvinieme hlbokú konvolučnú neurónovú sieť pre úlohu sémantickej segmentácie buniek kultivovaných na mriežke. Dátový súbor pre túto prácu bol vytvorený pomocou dual-beam kryo-elektónového mikroskopu vyvinutého spoločnosťou Thermo Fisher Scientific Brno.