Le fer est un élément présent en abondance dans la croûte terrestre, indispensable à la quasi-totalité des êtres vivants. Cependant, en milieu marin la biodisponibilité du fer est souvent faible et sporadique. Les micro-algues du phytoplancton ont développé des stratégies pour faire face à cette limitation en fer et s’adapter à des niches écologiques variables. Les micro-algues vertes du genre Ostreococcus (Prasinophyceae) présentent une large distribution géographique dans l’océan mondial, et de nombreux écotypes venant de milieux contrastés ont été isolés. L’objectif principal de ma thèse était d’étudier les différentes stratégies mises en place par le genre Ostreococcus, et notamment l’influence de la lumière et de l’horloge circadienne, dans la gestion de la carence en fer. Mon travail s’est focalisé sur l’étude d’Ostreococcus tauri, écotype lagunaire (Clade C), que de récentes techniques de transformation par insertion et recombinaison homologue ont promu comme un organisme modèle pour des approches de génétique fonctionnelle. J’ai étudié la ferritine, une protéine impliquée dans la gestion de la réserve en fer chez de nombreux organismes, et mis en évidence sa régulation par l’alternance jour/nuit et l’horloge circadienne. J’ai montré son rôle dans l’assimilation du fer, la régulation de l’homéostasie du fer et le recyclage du fer intracellulaire lors d’une carence. Enfin, j’ai caractérisé les stratégies d’acclimatation et d’adaptation à la carence en fer chez plusieurs écotypes d’Ostreococcus, dont O. tauri, RCC 802 (Clade A), RCC 809 (Clade B) et un mutant de taille/biomasse. Une stratégie d’acclimatation par réduction de la biomasse cellulaire a été mise en évidence. / Iron is an abundant element in the earth crust and is essential for almost organisms. In the marine environment, however, its bioavailability is often low and the iron supplies sporadic. Phytoplanktonic species have developed various strategies to face iron limitation and adapt to different ecological niches. Green picoalgae from the genus Ostreococcus (Prasinophyceae) are widespread in the global ocean and numerous ecotypes have been isolated from contrasted environments. The main objective of my thesis was to identify the strategie(s) used by the genus Ostreococcus in response to iron starvation and in particular the influence of the day/night cycle and the circadian clock in the regulation of iron homeostasis. I focused my work on the lagoon ecotype, Ostreococcus tauri (Clade C), which has emerged as a model organism for functional genomics approaches thanks to the development of genetic transformation by random insertion and homologous recombination. I have studied ferritin, a protein involved in iron storage which is present throughout the tree of life. I showed that ferritin is regulated by the light/dark cycle and the circadian clock and that it is a key player in the regulation of iron uptake and the recycling. Finally, I characterized the acclimation and adaptation strategies to iron limitations of several Ostreococcus ecotypes including O.tauri, RCC802 (Clade A), RCC809 (Clade B) and a cell biomass mutant of O.tauri. The reduction of cell biomass appears to be a main mechanism of acclimation in response to iron limitation.

La chromatine est connue pour son rôle dans le maintien de l'identité cellulaire. Des perturbations dans la dynamique de la chromatine sont des événements courants dans les cancers. La structure de la chromatine et sa dynamique sont fortement dépendante des protéines HP1, connues pour être impliquées dans l’extinction de l’hétérochromatine, mais également dans la régulation de l'expression des gènes, la réplication et la réparation des dommages de l'ADN. Afin de mieux caractériser les fonctions d’HP1 chez les mammifères, nous avons étudié les conséquences de l'inactivation de leurs gènes chez la souris. De façon inattendue, nous démontrons que l'inactivation d’HP1a ou d’HP1g conduit à une prédisposition élevée des souris à développer des tumeurs spécifiquement dans le foie. Par conséquent, nous avons établi des modèles murins permettant l'inactivation simultanée d’HP1a/HP1b et HP1a/HP1g spécifiquement dans les hépatocytes. Ces modèles ont montré une augmentation significative de l'incidence du développement des tumeurs dans le foie, ce qui montre que les protéines HP1 sont des suppresseurs spécifiques de tumeurs hépatiques. L'analyse histologique de foies HP1abliverKO a montré des défauts qui ressemblent à ceux observés dans une pathologie connue du foie humain, la stéatohépatite non alcoolique. Afin de caractériser les mécanismes moléculaires sous-jacents ces fonctions des HP1, nous avons analysé le transcriptome de foies de souris âgées de 5 semaines. Ces analyses ont révélé que les gènes sur-exprimés en réponse à l’absence d’HP1ag ou HP1ab sont fortement enrichis en gènes codant pour des membres de la famille de répresseurs de transcription KRAB-ZFP. Ce résultat est intéressant car il est connu que ces répresseurs sont régulés par le corépresseur TRIM28 qui a besoin d’interagir avec HP1 pour remplir ses fonctions. Cela suggère donc une boucle d'autorégulation entre HP1, TRIM28 et KRAB-ZFP. En utilisant des souris exprimant une protéine TRIM28 qui est incapable d'interagir avec HP1 spécifiquement dans les hépatocytes, nous avons démontré que la perturbation de l'interaction entre TRIM28 et HP1 conduit au développement spontané de tumeurs dans le foie et conduit également à une surexpression des mêmes KRAB-ZFP que ceux dérégulée chez les souris HP1abliverKO et HP1agliverKO. L’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) a mis en évidence que TRIM28 et HP1 sont recrutés de façon interdépendante dans les régions 5 'et/ou 3' des gènes de KRAB-ZFP afin de réguler leur expression. Nous avons également observé la dérégulation de certains gènes liés au cancer, comme Tert, Nox4, AR, GPC3 et Arid1a. Ces modifications sont dépendantes de l’isotope d’HP1 inactivé, ce qui reflète les différents mécanismes moléculaires de l’oncogenèse. Afin d'élucider l'impact possible d’HP1 sur l'organisation générale du noyau, j'ai effectué une analyse par immunofluorescence sur cryosections du foie. Nos données suggèrent que les caractéristiques hétérochromatiques constitutives (H3K9me3) sont remplacées par des caractéristiques hétérochromatiques facultatives (H3K27me3) en l'absence de HP1ag et que les foyers péricentriques hétérochromatiques ont une légère tendance à être délocalisés. Enfin, pour mieux comprendre les profils chromosomiques dans la tumeur du foie HP1-dépendante, nous avons effectué une hybridation génomique comparative dans les foies tumoraux. Comme prévu, plusieurs événements de gain et de perte dans les variations du nombre de copies (CNV) dans certaines régions subchromosomales ont été observés, en particulier pour les chromosomes 4, où certains membres de KRAB-ZFP sont touchés. En résumé, nos résultats montrent que les protéines HP1 sont des suppresseurs de tumeur spécifique du foie. Ces données suggèrent également que la fonction principale d’HP1 au sein du foie est de réguler l'activité de TRIM28 et ainsi réguler l'expression et l'activité de répression des KRAB-ZFP et, finalement, l'homéostasie du foie. / Chromatin is known for its essential role in establishment and maintenance of cellular identity. Accordingly, disturbances in chromatin’s dynamics are common events in cancers. Chromatin structure and dynamics is highly dependent upon HP1, small non-histone chromosomal proteins that are known to be involved in heterochromatin silencing but also in gene expression regulation, DNA replication and DNA damage repair. To better characterize HP1 functions in mammals, we have studied the consequences of the inactivation of the corresponding genes in mice. Unexpectedly, we demonstrated that inactivation of either HP1a or HP1g lead to a high predisposition of mice to develop tumors specifically within liver. Hence, we established mice models allowing simultaneous inactivation of HP1a/HP1b and HP1a/HP1g specifically within hepatocytes. These models (HP1abliverKO and HP1agliverKO) displayed a significant increased incidence of tumor development within liver, demonstrating that HP1 are liver specific tumor suppressors. Histological analysis of HP1abliverKO livers showed defects that resembled those observed in a human liver pathology known as nonalcoholic steatohepatitis (NASH) characterized by an increase of steatosis, followed by an increased inflammation and the development of fibrosis that finally leads to tumors in old animals. In the case of HP1agliverKO mice, even though inflammation and tumor development were observed, this was not linked with steatosis, strongly suggesting that the underlying mechanisms are specific of each HP1 isoform. In order to reveal molecular mechanisms, we did expression analysis in the liver of 5 weeks old mice, which revealed a strong enrichment of genes encoding for members of the KRAB-ZFP of transcriptional repressors family within genes regulated by HP1ag or HP1ab. This result is of particular interest since it is known that these repressors are regulated by the corepressor TRIM28 which has been shown to require its interaction with HP1 to fulfill its functions suggesting a loop of auto-regulation between HP1, TRIM28 and KRAB-ZFP. Using mice expressing a TRIM28 protein unable to interact with HP1 specifically within hepatocytes, we demonstrated here that the disruption of the interaction between TRIM28 and HP1 lead to spontaneous development of tumors within liver and to over-expression of the same KRAB-ZFP as those deregulated in HP1abliverKO and HP1agliverKO mice. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) pinpointed that TRIM28 and HP1 are inter-dependently recruited to the 5’ and/or 3’ ends of KRAB-ZFP genes to regulate their expression. We also observed deregulation of some cancer related genes, such as Tert (Telomerase reverse transcriptase), Nox4 (NADPH oxidase 4), AR (Androgen receptor), GPC3 (Glypican3), Arid1a (AT-Rich Interaction Domain 1A), and interestingly these alterations are depended upon the inactivated HP1 isotype, reflecting distinct molecular oncogenesis. In order to elucidate the possible impact of HP1 on global organization of the nucleus, I performed immunofluorescence analysis in the liver cryosections of 5 weeks old mice. Our data suggest that constitutive heterochromatic features (H3K9me3) are replaced by facultative heterochromatic features (H3K27me3) in absence of HP1ag and that heterochromatic pericentric foci tend to slightly be delocalized. Finally, to better understand the chromosomal rearrangements profile in HP1-dependent liver tumor, we performed Comparative genomic hybridization (CGH) in old tumoral liver. As anticipated, multiple events of gain and loss in copy number variations (CNV) in subchromosomal regions were observed, especially for chromosomes 4, where some KRAB-ZFP members are affected. Altogether, our data demonstrated that HP1 are liver-specific tumor suppressor. They also suggest that HP1 main function within liver is to regulate TRIM28 activity and thereby regulate the expression and repression activity of KRAB-ZFP and ultimately liver homeostasis.

Nous avons utilisé une approche ethnobotanique pour identifier des espèces de plantes utilisées par les Cris afin de traiter les symptômes du diabète de type 2. Larix laricina du Roi (L. laricina) a récemment été identifiée comme une des meilleures plantes qui a stimulé le transport de glucose dans les cellules C2C12 et fortement potentialisé la différenciation des 3T3-L1 en indiquant une sensibilité potentiellement accrue à l’insuline. Ensuite, ces études de criblage ont été effectuées sur des extraits éthanolique (EE) en utilisant une série de bioessais in vitro. Cependant, les préparations traditionnelles des plantes sont souvent faites avec l’eau chaude. Le but de cette thèse de doctorat était d’isoler les principes actifs de L. laricina par un fractionnement guidé par l’adipogenèse; d’évaluer et de comparer l’activité et les mécanismes antidiabétiques des EE et des extraits aqueux (HWE) de ces 17 plantes. Pour le fractionnement de L. laricina, on a isolé plusieurs composés connus et identifié un nouveau composé actif cycloartane triterpene, qui a amélioré fortement l’adipogenèse et a été responsable en partie de l’activité adipogénique (potentiellement similaire à l’effet sensibilisateur à l’insuline des glitazone) de l’extrait éthanolique issu de l’écorce de L. laricina. Pour le métabolisme lipidique, nos résultats ont confirmé que 10 parmi les 17 EE ont augmenté la différenciation des adipocytes alors que 2 extraits seulement l’ont inhibée. Les HWE ont montré une faible activité adipogénique ou antiadipogénique. Les EE de R. groenlandicum et K. angustifolia ont le PPAR γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ), le SREBP-1 (sterol regulatory element binding protein-1) et le C/EBP (CCAAT-enhancer binding proteins) α, alors que ceux de P. balsamifera et A. incana les ont inhibés. L’effet inhibiteur de P. balsamifera a également été prouvé d’avoir impliqué l’activation de la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK). Les EE et HWE de R. groenlandicum ont stimulé les mêmes facteurs de transcription alors que les extraits aqueux d’autres plantes sélectionnées ont perdu ces effets en comparaison avec leurs extraits éthanoliques respectifs. L’analyse phytochimique a également identifié le groupe des espèces actives et inactives, notamment lorsque les espèces ont été séparées par famille de plante. Finalement concernant l’homéostasie de glucose, nos résultats ont confirmé que plusieurs EE ont stimulé le transport de glucose musculaire et inhibé l’activité de la glucose-6-phosphatase (G6Pase) hépatique. Certains des HWE ont partiellement ou complètement perdu ces activités antidiabétiques par rapport aux EE, tandis qu’une seule plante (R.groenlandicum) a juste conservé un potentiel similaire entre les EE et HWE dans les deux essais. Dans les cellules musculaires, les EE de R.groenlandicum, A. incana et S. purpurea ont stimulé le transport de glucose en activant la voie de signalisation de l’AMPK et en augmentant le niveau d’expression des GLUT4. En comparaison avec les EE, les HWE de R.groenlandicum ont montré des activités similaires; les HWE de A. incana ont complètement perdu leur effet sur tous les paramètres étudiés; les HWE de S. purpurea ont activé la voie de l’insuline au lieu de celle de l’AMPK pour augmenter le transport de glucose. Dans les cellules H4IIE, les EE et HWE des 5 plantes ont activé la voie de l’AMPK, et en plus les EE et HWE de 2 plantes ont activé la voie de l’insuline. La quercétine-3-O-galactoside et la quercétine 3-O-α-L-arabinopyranoside ont été identifiées comme des composés ayant un fort potentiel antidiabétique et donc responsables de l'activité biologique des plantes HWE actifs avec le transport du glucose. En conclusion, on a isolé plusieurs composés connus et identifié un nouveau triterpène actif à partir du fractionnement de L. laricina. Nous avons fourni également une preuve directe pour l'évaluation et la comparaison d'une action analogue à l'insuline ou insulino-sensibilisateur des EE et HWE de plantes médicinales Cris au niveau de muscle, de foie et de tissus adipeux. Une partie de leur action peut être liée à la stimulation des voies de signalisation intracellulaire insulino-dépendante et non-insulino-dépendante, ainsi que l’activation de PPARγ. Nos résultats indiquent que les espèces de plantes, les tissus ou les cellules cibles, ainsi que les méthodes d'extraction sont tous des déterminants significatifs de l'activité biologique de plantes médicinales Cris sur le métabolisme glucidique et lipidique. / We have used a collaborative ethnobotanical approach to identify plant species used by the Cree of Eeyou Istchee (CEI) to treat symptoms of type 2 diabetes. Several screening studies were performed on 17 species identified in a survey of the Cree Nation. Firstly, Larix laricina du Roi (L. laricina) was recently identified as one of the top plants, which stimulated glucose uptake in C2C12 muscle cells and strongly potentiated the differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes suggesting enhanced insulin sensitivity. Secondly, these screening studies were performed on ethanol extracts (EE) using an in vitro bioassay platform, however, traditional preparations are often based on hot water. So the purpose of this PhD thesis was to isolate the active principles from L. laricina through adipogenesis-guided fractionation, and to evaluate and compare the antidiabetic activity and mechanisms of EE and hot water extracts (HWE) of these 17 Cree plants. For the fractionation of L. laricina, we isolated several known compounds and identified a new active cycloartane triterpene, which strongly enhanced adipogenesis in 3T3-L1 cells and was responsible partly for the adipogenic (potentially glitazone-like insulin sensitizing) activity of the ethanol extract of the bark of L. laricina. In the adipocyte lipid metabolism course, the results confirmed that 10 of the 17 EE stimulated adipocyte differentiation and adipogenesis, whereas 2 had inhibitory effects. Corresponding HWE exhibited partial or complete loss of such adipogenic or anti-adipogenic activity. R. groenlandicum and K. angustifolia EEs activated Peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPAR γ), sterol regulatory element binding protein-1 (SREBP-1) and CCAAT-enhancer binding protein (C/EBP) α, whereas P. balsamifera and A. incana decreased these transcription factors. P. balsamifera’s inhibitory effect was also found to involve AMP-activated protein kinase (AMPK) activation. R. groenlandicum HWE and EE stimulated similar transcription factors, but HWE of other selected plants lost such effects compared to their respective EE. Phytochemical analysis also uncovered clustering of active versus inactive species, notably when species were segregated by plant family. The results showed that several EE stimulated muscle glucose uptake and inhibited hepatic glucose-6-phosphatase (G6Pase) activity. Some of the HWE partially or completely lost these antidiabetic activities in comparison to EE; while one plant (R.groenlandicum) retained similar potential between EE and HWE in both assays. In C2C12 muscle cells, EE of R.groenlandicum, A. incana and S. purpurea stimulated glucose uptake by activating AMPK pathway and increasing GLUT4 expression level. In comparison to EE, HWE of R.groenlandicum exhibited similar activities; HWE of A. incana completely lost its effect on all parameters; interestingly, HWE of S. purpurea activated insulin pathway instead of AMPK pathway to increase glucose uptake. In the H4IIE cells, all selected 5 plants HWE and EE activated AMPK pathway, and in addition, 2 plants EE and HWE also activated insulin pathways. Quercetin-3-O-galactoside and quercetin 3-O-α-L-arabinopyranoside were identified as potential candidates to be responsible for the biological activity of the active HWE plants in the glucose transport assay. In conclusion, we isolated several known compounds and identified a new active triterpene from fractionation of L. laricina. We also provide direct evidence evaluating and comparing of an insulin-like or insulin-sensitizing action of EE and HWE of Cree medicinal plants at the level of muscle, liver and adipose tissue. Part of their actions may be related to stimulation of insulin-dependent and insulin-independent intracellular signaling pathways, as well as to PPARγ activation. The results indicate that plant species, target tissues or cells, as well as extraction methods, are all significant determinants of the biological activity of Cree medicinal plants on glucose and lipid metabolism.