Memoria para optar al título de Bioquímico / La vía de señalización Slit/Robo es una vía conservada en muchas especies que está involucrada en la guía de axones y dendritas durante el desarrollo del SNC. Estudios previos han demostrado que esta vía cumple un rol importante en la formación y mantención de límites en estadios tempranos del desarrollo del lóbulo óptico de Drosophila melanogaster. En este trabajo nos centramos en caracterizar la función del ligando de esta vía, la proteína Slit, la cual es secretada al medio extracelular y es procesada proteolíticamente. Encontramos que Slit influye en el establecimiento de límites entre compartimentos durante el desarrollo del lóbulo óptico. Mediante experimentos de rescate del fenotipo de mutantes Slit, usando el sistema Gal4/UAS, evaluamos la contribución de Slit en las diferentes subpoblaciones celulares del lóbulo óptico, donde se expresa: células gliales, neuronas de la médula y fotorreceptores. Descubrimos que la fuente principal de Slit son las neuronas de la médula, aunque investigaciones pasadas sugerían que Slit era secretada por glías. Además, analizamos si la función de Slit es a corta distancia, para lo cual realizamos experimentos de rescate específico en neuronas de la médula utilizando una versión de la proteína Slit con un segmento transmembrana en su extremo N-terminal, para mantenerla anclada a la membrana plasmática. Encontramos que esta versión de la proteína no rescata el fenotipo mutante de slit, por lo que creemos que Slit estaría actuando a largo alcance. Finalmente, realizamos experimentos de rescate específico en neuronas de la médula con una versión de Slit que no se procesa, para determinar si el corte proteolítico de Slit era requerido para su función y encontramos que este procesamiento es dispensable en este contexto. De esta forma, concluimos que Slit en el lóbulo óptico es secretado principalmente por las neuronas de la médula, actúa a larga distancia, y no requiere ser procesado para su acción / The Slit/Robo pathway is a widely conserved across species. It is involved in axon guidance during the development of the Central Nervous System (CNS). Previous studies have demonstrated the importance of this pathway in the formation and maintenance of boundaries in the optic lobe during early developmental stages in Drosophila melanogaster. During this thesis we focused on the characterization of the ligand of this pathway, the Slit protein, which is secreted to the extracellular medium and proteolytically processed. We observed that Slit is important in the establishment of boundaries in the optic lobe during the entire development of the animal. Through rescue experiments using the Gal4/UAS system, we evaluated the role of Slit in different optic lobe subpopulations where is expressed: glia, medulla neurons and photoreceptors. Thereby, we found out that the main source of Slit expression are medulla neurons, even though previous studies suggested that Slit is secreted by glial cells. Then, we assessed if the role of Slit is performed at short-range. For this aim we performed rescue experiments in medulla neurons using a Slit construct bound to a transmembrane domain to keep it attached to the plasma membrane. We observed that this construct did not rescue the mutant phenotype when expressed in medulla neurons. Finally, we performed rescue experiments using a Slit construct that cannot be processed because it lacks the cleavage site, and found that the proteolytic cleavage is not necessary in this cellular context. In summary, we found that during the development of the optic lobe, Slit protein is mainly secreted by medulla neurons, acts as a long-range cue and does not require proteolytic processing for its activity / Fondecyt 11150610

Os processos que regem o desenvolvimento dos olhos compostos em insetos têm sido amplamente estudados em Drosophila melanogaster onde estes se originam a partir de discos imaginais. Pouco se sabe, porém, sobre o desenvolvimento do lóbulo óptico e da retina em outros insetos que, na sua grande maioria, não possuem discos imaginais de olhos separados do sistema nervoso central. Neste sentido, a análise comparada do desenvolvimento dos olhos de Apis mellifera pode contribuir não somente para aspectos evo-devo entre as grandes famílias dos insetos holometábolos, quanto pode elucidar questões de plasticidade de desenvolvimento pois os olhos compostos apresentam fortes características sexo e casta-específicas. Com o objetivo primário de elucidar os padrões de divisão e diferenciação celular durante o desenvolvimento do olho em A. mellifera realizamos análises histológicas e de imunomarcação durante o desenvolvimento pós-embrionário, juntamente com análise de expressão do gene roughest em tempo real. Para imunomarcação utilizamos o anticorpo anti-fosfo-histona H3 fosforilada que marca células em fase M do ciclo celular. Foram analisadas larvas operárias entre o terceiro instar larval (L3) até pupas de olho branco, rosa e marrom, com foco sobre o quinto instar larval que fica subdividida em fase de alimentação e crescimento (L5F), fases de tecelagem de casulo (L5S) e prepupa (PP). O desenvolvimento do lóbulo óptico em Apis mellifera ocorre por dobramento neuroepitelial, a partir de um centro de diferenciação, seqüencialmente gerando as camadas neurais do lóbulo óptico (lóbula, medula e lâmina). A lâmina (última a surgir) 6 apresentou-se com desenvolvimento mais lento e em duas fases antes da metamorfose: a primeira fase é o seu surgimento no começo do quinto instar larval acompanhando o primeiro pico de expressão de roughest e a segunda fase ocorre durante a tecelagem de casulo com o desenvolvimento do córtex acompanhando o segundo pico de expressão de roughest. Ainda durante o segundo pico de expressão de roughest os rabdômeros da retina começam a ficar visíveis, assim como os feixes axonais. Estes porém estarão completamente formados somente após a metamorfose.. O desenvolvimento completo da lâmina, lóbula e medula e da retina ocorre somente após a metamorfose. Durante a fase pupal as estruturas do lóbulo óptico estão prontas, porém na retina observa-se ainda gradual pigmentação, encurtamento dos feixes axonais e alongamento dos rabdômeros até atingirem o seu comprimento final logo antes da emergência. / The processes that drive compound eye development in insects have been broadly studied in Drosophila melanogaster in which they arise from imaginal discs. Little is known about optic lobe and retina development in other insects, most of which do not have imaginal eye discs attached to the nervous system. For this reason, a comparative analysis of eye development in the honey bee, Apis mellifera, not only contributes to evo-devo aspects comparing the major families of holometabolous insects, but also may elucidate questions about developmental plasticity because the compound eyes of the honeybee show strong sex and caste-specific differences. Since our primary objective was to elucidate the pattern of cellular differentiation and division during eye development we performed histological and immunolabelling analyses during the postembrionic stages of development, concomitant with a realtime analysis of roughest gene expression. For the immunolabelling experiments we used an anti-phospho-histone H3 antibody that labels cells in M phase. We analyzed eye development in worker larvae starting with the third instar until white, pink and browneyed pupae, paying special attention to the fifth instar which was subdivided into feeding phase (L5F), cocoon spinning phase (L5S) and prepupae (PP). Optic Lobe development in Apis mellifera occurs by neuroepithelial folding initiating from a differentiation center, in the larval brain. This center sequentially produces the neural layers of the optic lobe (medulla, lobula and lamina). Development of the lamina, which is the last layer to be formed, takes more time and happens in two steps before metamorphosis. The first step is emergence at the beginning of the fifth larval instar coinciding with the first peak of roughest gene expression. The second step 8 occurs during the cocoon spinning phase and is marked by its inner differentiation, again accompanied by a second peak of roughest expression. During this second peak of roughest expression the rabdomers in the retina become visible. These, however, cplete thir development only during the pupal stage. The development of the lamina, lobula and medulla is not complete until after metamorphosis, even though these optic lobe structures are structurally defined already at the beginning of the pupal phase. Retinal development in this phase is marked by gradual pigmentation, axonal bundle shortening and rabdomer elongation, which reach their final size just prior to emergence of the bees from their brood cells.

Os processos que regem o desenvolvimento dos olhos compostos em insetos têm sido amplamente estudados em Drosophila melanogaster onde estes se originam a partir de discos imaginais. Pouco se sabe, porém, sobre o desenvolvimento do lóbulo óptico e da retina em outros insetos que, na sua grande maioria, não possuem discos imaginais de olhos separados do sistema nervoso central. Neste sentido, a análise comparada do desenvolvimento dos olhos de Apis mellifera pode contribuir não somente para aspectos evo-devo entre as grandes famílias dos insetos holometábolos, quanto pode elucidar questões de plasticidade de desenvolvimento pois os olhos compostos apresentam fortes características sexo e casta-específicas. Com o objetivo primário de elucidar os padrões de divisão e diferenciação celular durante o desenvolvimento do olho em A. mellifera realizamos análises histológicas e de imunomarcação durante o desenvolvimento pós-embrionário, juntamente com análise de expressão do gene roughest em tempo real. Para imunomarcação utilizamos o anticorpo anti-fosfo-histona H3 fosforilada que marca células em fase M do ciclo celular. Foram analisadas larvas operárias entre o terceiro instar larval (L3) até pupas de olho branco, rosa e marrom, com foco sobre o quinto instar larval que fica subdividida em fase de alimentação e crescimento (L5F), fases de tecelagem de casulo (L5S) e prepupa (PP). O desenvolvimento do lóbulo óptico em Apis mellifera ocorre por dobramento neuroepitelial, a partir de um centro de diferenciação, seqüencialmente gerando as camadas neurais do lóbulo óptico (lóbula, medula e lâmina). A lâmina (última a surgir) 6 apresentou-se com desenvolvimento mais lento e em duas fases antes da metamorfose: a primeira fase é o seu surgimento no começo do quinto instar larval acompanhando o primeiro pico de expressão de roughest e a segunda fase ocorre durante a tecelagem de casulo com o desenvolvimento do córtex acompanhando o segundo pico de expressão de roughest. Ainda durante o segundo pico de expressão de roughest os rabdômeros da retina começam a ficar visíveis, assim como os feixes axonais. Estes porém estarão completamente formados somente após a metamorfose.. O desenvolvimento completo da lâmina, lóbula e medula e da retina ocorre somente após a metamorfose. Durante a fase pupal as estruturas do lóbulo óptico estão prontas, porém na retina observa-se ainda gradual pigmentação, encurtamento dos feixes axonais e alongamento dos rabdômeros até atingirem o seu comprimento final logo antes da emergência. / The processes that drive compound eye development in insects have been broadly studied in Drosophila melanogaster in which they arise from imaginal discs. Little is known about optic lobe and retina development in other insects, most of which do not have imaginal eye discs attached to the nervous system. For this reason, a comparative analysis of eye development in the honey bee, Apis mellifera, not only contributes to evo-devo aspects comparing the major families of holometabolous insects, but also may elucidate questions about developmental plasticity because the compound eyes of the honeybee show strong sex and caste-specific differences. Since our primary objective was to elucidate the pattern of cellular differentiation and division during eye development we performed histological and immunolabelling analyses during the postembrionic stages of development, concomitant with a realtime analysis of roughest gene expression. For the immunolabelling experiments we used an anti-phospho-histone H3 antibody that labels cells in M phase. We analyzed eye development in worker larvae starting with the third instar until white, pink and browneyed pupae, paying special attention to the fifth instar which was subdivided into feeding phase (L5F), cocoon spinning phase (L5S) and prepupae (PP). Optic Lobe development in Apis mellifera occurs by neuroepithelial folding initiating from a differentiation center, in the larval brain. This center sequentially produces the neural layers of the optic lobe (medulla, lobula and lamina). Development of the lamina, which is the last layer to be formed, takes more time and happens in two steps before metamorphosis. The first step is emergence at the beginning of the fifth larval instar coinciding with the first peak of roughest gene expression. The second step 8 occurs during the cocoon spinning phase and is marked by its inner differentiation, again accompanied by a second peak of roughest expression. During this second peak of roughest expression the rabdomers in the retina become visible. These, however, cplete thir development only during the pupal stage. The development of the lamina, lobula and medulla is not complete until after metamorphosis, even though these optic lobe structures are structurally defined already at the beginning of the pupal phase. Retinal development in this phase is marked by gradual pigmentation, axonal bundle shortening and rabdomer elongation, which reach their final size just prior to emergence of the bees from their brood cells.

Mecanismos que regem o desenvolvimento do olho composto e lóbulo óptico tem sido amplamente estudados em Drosophila melanogaster onde a retina é formada a partir de um disco imaginal anexado com o cérebro e os lóbulos opticos a partir do primórdio óptico externo. Através de histologia comparativa e análise de expressão gênica no desenvolvimento do sistema visual em Apis mellifera nós procuramos elucidar questões sobre plasticidade do desenvolvimento subjacente a fortes diferenças sexo- e casta-específico no olho assim como contribuir com aspectos evo-devo. O desenvolvimento dos lóbulos ópticos ocorre por dobramento neuroepitelial a partir de um centro de diferenciação no cérebro larval. Deste centro, a medula, lamina e lóbula surgem ao mesmo tempo em operárias e zangões. Dois passos marcam a diferenciação da lâmina (i) sua origem a partir da diferenciação de neuroblastos da camada mais externa da medula, isso coincidindo com o primeiro pico de expressão de roughest, e (ii) 24 horas mais tarde o aparecimento dos omatideos hexagonais coincidindo com o segundo pico de expressão de roughest. Com a inclusão de genes candidatos relacionados com o desenvolvimento do olho e lóbulos ópticos em insetos [small optic lobe (sol), eyes absent (eya), minibrain (mnb), sine oculis (so), embryonic lethal, abnormal vision (elav) e epidermal growth factor receptor (egfr)] nós encontramos distintos picos de expressão para sol, eya, mnb e so em níveis de transcritos e tempo de aparição do pico diferindo entre operárias e zangões. Enquanto estes quatro genes mostraram relativa sincronia durante o desenvolvimento em zangões, o mesmo não ocorreu em operárias. Além disso, em operárias sol é muito mais expresso na pré-pupa do que em zangões. Ambos os sexo mostraram padrões muito similares de expressão de elav, exceto por um atraso em zangões. Em contraste, a expressão de egfr ocorre antes em zangões. Durante a phase chave no desenvolvimento do sistema visual, uma análise global do transcriptoma, por meio de micro-arranjos mostrou vários genes relacionados com ciclo celular entre os diferencialmente expressos. Em conclusão, a relação entre tempo e eventos morfológicos com os padrões de expressão gênica revelou diferenças possivelmente relacionadas com mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do sistema visual altamente dimorfico de Apis mellifera. / Developmental mechanisms governing compound eye development in insects have been broadly studied in Drosophila melanogaster, where the retina is formed from an imaginal disc attached to the larval brain. However little is known about eye development in other insects, most of which do not have such imaginal eye discs. Through a comparative histological and gene expression analysis of eye development in the honey bee, Apis mellifera, we intended to elucidate questions about developmental plasticity underlying the marked sex and castespecific differences in eye size, as well as to contribute to evo-devo aspects. Optic lobe development occurs by neuroepithelial folding initiating from a differentiation center in the larval brain. From this center, the medula, lamina and lobula arise at the same time in drones and workers. Two steps mark the differentiation of the lamina (i) its origin from neuroblasts differentiating in the outer layer of the medula, this coinciding with the first peak of roughest expression during the feeding stage of the fifth larval instar, and (ii) 24 hours later, the appearance of hexagonal ommatidia, coinciding with a second peak in roughest expression. Upon including further candidate genes related to insect eye development [small optic lobe (sol), eyes absent (eya), minibrain (mnb), sine oculis (so), embryonic lethal, abnormal vision (elav) and epidermal growth factor receptor (egfr)] we found distinct expression peaks for sol, eya, mnb and so, with timing and relative transcript levels differing between drones and workers. Whereas these four genes showed a relatively synchronous pattern of expression in drones in the fifth larval instar, this was not so in workers. Furthermore, in prepupae sol was higher expressed in workers than the other three genes, and also in comparison to drones. Both sexes showed a strikingly similar expression pattern for elav, except for some delay in drones. In contrast, egfr expression was found to occur earlier in drones. Through a global transcriptom analysis, done at a key step of larval development, several genes were reveled as diffetentially expressed, many of these regulating cell cycle steps. In conclusion, the relationship in the timing of morphological events with gene expression patterns revealed differences possibly related to mechanisms underlying development of the highly dimorphic compound eye in the honey bee.

Mecanismos que regem o desenvolvimento do olho composto e lóbulo óptico tem sido amplamente estudados em Drosophila melanogaster onde a retina é formada a partir de um disco imaginal anexado com o cérebro e os lóbulos opticos a partir do primórdio óptico externo. Através de histologia comparativa e análise de expressão gênica no desenvolvimento do sistema visual em Apis mellifera nós procuramos elucidar questões sobre plasticidade do desenvolvimento subjacente a fortes diferenças sexo- e casta-específico no olho assim como contribuir com aspectos evo-devo. O desenvolvimento dos lóbulos ópticos ocorre por dobramento neuroepitelial a partir de um centro de diferenciação no cérebro larval. Deste centro, a medula, lamina e lóbula surgem ao mesmo tempo em operárias e zangões. Dois passos marcam a diferenciação da lâmina (i) sua origem a partir da diferenciação de neuroblastos da camada mais externa da medula, isso coincidindo com o primeiro pico de expressão de roughest, e (ii) 24 horas mais tarde o aparecimento dos omatideos hexagonais coincidindo com o segundo pico de expressão de roughest. Com a inclusão de genes candidatos relacionados com o desenvolvimento do olho e lóbulos ópticos em insetos [small optic lobe (sol), eyes absent (eya), minibrain (mnb), sine oculis (so), embryonic lethal, abnormal vision (elav) e epidermal growth factor receptor (egfr)] nós encontramos distintos picos de expressão para sol, eya, mnb e so em níveis de transcritos e tempo de aparição do pico diferindo entre operárias e zangões. Enquanto estes quatro genes mostraram relativa sincronia durante o desenvolvimento em zangões, o mesmo não ocorreu em operárias. Além disso, em operárias sol é muito mais expresso na pré-pupa do que em zangões. Ambos os sexo mostraram padrões muito similares de expressão de elav, exceto por um atraso em zangões. Em contraste, a expressão de egfr ocorre antes em zangões. Durante a phase chave no desenvolvimento do sistema visual, uma análise global do transcriptoma, por meio de micro-arranjos mostrou vários genes relacionados com ciclo celular entre os diferencialmente expressos. Em conclusão, a relação entre tempo e eventos morfológicos com os padrões de expressão gênica revelou diferenças possivelmente relacionadas com mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do sistema visual altamente dimorfico de Apis mellifera. / Developmental mechanisms governing compound eye development in insects have been broadly studied in Drosophila melanogaster, where the retina is formed from an imaginal disc attached to the larval brain. However little is known about eye development in other insects, most of which do not have such imaginal eye discs. Through a comparative histological and gene expression analysis of eye development in the honey bee, Apis mellifera, we intended to elucidate questions about developmental plasticity underlying the marked sex and castespecific differences in eye size, as well as to contribute to evo-devo aspects. Optic lobe development occurs by neuroepithelial folding initiating from a differentiation center in the larval brain. From this center, the medula, lamina and lobula arise at the same time in drones and workers. Two steps mark the differentiation of the lamina (i) its origin from neuroblasts differentiating in the outer layer of the medula, this coinciding with the first peak of roughest expression during the feeding stage of the fifth larval instar, and (ii) 24 hours later, the appearance of hexagonal ommatidia, coinciding with a second peak in roughest expression. Upon including further candidate genes related to insect eye development [small optic lobe (sol), eyes absent (eya), minibrain (mnb), sine oculis (so), embryonic lethal, abnormal vision (elav) and epidermal growth factor receptor (egfr)] we found distinct expression peaks for sol, eya, mnb and so, with timing and relative transcript levels differing between drones and workers. Whereas these four genes showed a relatively synchronous pattern of expression in drones in the fifth larval instar, this was not so in workers. Furthermore, in prepupae sol was higher expressed in workers than the other three genes, and also in comparison to drones. Both sexes showed a strikingly similar expression pattern for elav, except for some delay in drones. In contrast, egfr expression was found to occur earlier in drones. Through a global transcriptom analysis, done at a key step of larval development, several genes were reveled as diffetentially expressed, many of these regulating cell cycle steps. In conclusion, the relationship in the timing of morphological events with gene expression patterns revealed differences possibly related to mechanisms underlying development of the highly dimorphic compound eye in the honey bee.