Mecanismos que regem o desenvolvimento do olho composto e lóbulo óptico tem sido amplamente estudados em Drosophila melanogaster onde a retina é formada a partir de um disco imaginal anexado com o cérebro e os lóbulos opticos a partir do primórdio óptico externo. Através de histologia comparativa e análise de expressão gênica no desenvolvimento do sistema visual em Apis mellifera nós procuramos elucidar questões sobre plasticidade do desenvolvimento subjacente a fortes diferenças sexo- e casta-específico no olho assim como contribuir com aspectos evo-devo. O desenvolvimento dos lóbulos ópticos ocorre por dobramento neuroepitelial a partir de um centro de diferenciação no cérebro larval. Deste centro, a medula, lamina e lóbula surgem ao mesmo tempo em operárias e zangões. Dois passos marcam a diferenciação da lâmina (i) sua origem a partir da diferenciação de neuroblastos da camada mais externa da medula, isso coincidindo com o primeiro pico de expressão de roughest, e (ii) 24 horas mais tarde o aparecimento dos omatideos hexagonais coincidindo com o segundo pico de expressão de roughest. Com a inclusão de genes candidatos relacionados com o desenvolvimento do olho e lóbulos ópticos em insetos [small optic lobe (sol), eyes absent (eya), minibrain (mnb), sine oculis (so), embryonic lethal, abnormal vision (elav) e epidermal growth factor receptor (egfr)] nós encontramos distintos picos de expressão para sol, eya, mnb e so em níveis de transcritos e tempo de aparição do pico diferindo entre operárias e zangões. Enquanto estes quatro genes mostraram relativa sincronia durante o desenvolvimento em zangões, o mesmo não ocorreu em operárias. Além disso, em operárias sol é muito mais expresso na pré-pupa do que em zangões. Ambos os sexo mostraram padrões muito similares de expressão de elav, exceto por um atraso em zangões. Em contraste, a expressão de egfr ocorre antes em zangões. Durante a phase chave no desenvolvimento do sistema visual, uma análise global do transcriptoma, por meio de micro-arranjos mostrou vários genes relacionados com ciclo celular entre os diferencialmente expressos. Em conclusão, a relação entre tempo e eventos morfológicos com os padrões de expressão gênica revelou diferenças possivelmente relacionadas com mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do sistema visual altamente dimorfico de Apis mellifera. / Developmental mechanisms governing compound eye development in insects have been broadly studied in Drosophila melanogaster, where the retina is formed from an imaginal disc attached to the larval brain. However little is known about eye development in other insects, most of which do not have such imaginal eye discs. Through a comparative histological and gene expression analysis of eye development in the honey bee, Apis mellifera, we intended to elucidate questions about developmental plasticity underlying the marked sex and castespecific differences in eye size, as well as to contribute to evo-devo aspects. Optic lobe development occurs by neuroepithelial folding initiating from a differentiation center in the larval brain. From this center, the medula, lamina and lobula arise at the same time in drones and workers. Two steps mark the differentiation of the lamina (i) its origin from neuroblasts differentiating in the outer layer of the medula, this coinciding with the first peak of roughest expression during the feeding stage of the fifth larval instar, and (ii) 24 hours later, the appearance of hexagonal ommatidia, coinciding with a second peak in roughest expression. Upon including further candidate genes related to insect eye development [small optic lobe (sol), eyes absent (eya), minibrain (mnb), sine oculis (so), embryonic lethal, abnormal vision (elav) and epidermal growth factor receptor (egfr)] we found distinct expression peaks for sol, eya, mnb and so, with timing and relative transcript levels differing between drones and workers. Whereas these four genes showed a relatively synchronous pattern of expression in drones in the fifth larval instar, this was not so in workers. Furthermore, in prepupae sol was higher expressed in workers than the other three genes, and also in comparison to drones. Both sexes showed a strikingly similar expression pattern for elav, except for some delay in drones. In contrast, egfr expression was found to occur earlier in drones. Through a global transcriptom analysis, done at a key step of larval development, several genes were reveled as diffetentially expressed, many of these regulating cell cycle steps. In conclusion, the relationship in the timing of morphological events with gene expression patterns revealed differences possibly related to mechanisms underlying development of the highly dimorphic compound eye in the honey bee.

Mecanismos que regem o desenvolvimento do olho composto e lóbulo óptico tem sido amplamente estudados em Drosophila melanogaster onde a retina é formada a partir de um disco imaginal anexado com o cérebro e os lóbulos opticos a partir do primórdio óptico externo. Através de histologia comparativa e análise de expressão gênica no desenvolvimento do sistema visual em Apis mellifera nós procuramos elucidar questões sobre plasticidade do desenvolvimento subjacente a fortes diferenças sexo- e casta-específico no olho assim como contribuir com aspectos evo-devo. O desenvolvimento dos lóbulos ópticos ocorre por dobramento neuroepitelial a partir de um centro de diferenciação no cérebro larval. Deste centro, a medula, lamina e lóbula surgem ao mesmo tempo em operárias e zangões. Dois passos marcam a diferenciação da lâmina (i) sua origem a partir da diferenciação de neuroblastos da camada mais externa da medula, isso coincidindo com o primeiro pico de expressão de roughest, e (ii) 24 horas mais tarde o aparecimento dos omatideos hexagonais coincidindo com o segundo pico de expressão de roughest. Com a inclusão de genes candidatos relacionados com o desenvolvimento do olho e lóbulos ópticos em insetos [small optic lobe (sol), eyes absent (eya), minibrain (mnb), sine oculis (so), embryonic lethal, abnormal vision (elav) e epidermal growth factor receptor (egfr)] nós encontramos distintos picos de expressão para sol, eya, mnb e so em níveis de transcritos e tempo de aparição do pico diferindo entre operárias e zangões. Enquanto estes quatro genes mostraram relativa sincronia durante o desenvolvimento em zangões, o mesmo não ocorreu em operárias. Além disso, em operárias sol é muito mais expresso na pré-pupa do que em zangões. Ambos os sexo mostraram padrões muito similares de expressão de elav, exceto por um atraso em zangões. Em contraste, a expressão de egfr ocorre antes em zangões. Durante a phase chave no desenvolvimento do sistema visual, uma análise global do transcriptoma, por meio de micro-arranjos mostrou vários genes relacionados com ciclo celular entre os diferencialmente expressos. Em conclusão, a relação entre tempo e eventos morfológicos com os padrões de expressão gênica revelou diferenças possivelmente relacionadas com mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do sistema visual altamente dimorfico de Apis mellifera. / Developmental mechanisms governing compound eye development in insects have been broadly studied in Drosophila melanogaster, where the retina is formed from an imaginal disc attached to the larval brain. However little is known about eye development in other insects, most of which do not have such imaginal eye discs. Through a comparative histological and gene expression analysis of eye development in the honey bee, Apis mellifera, we intended to elucidate questions about developmental plasticity underlying the marked sex and castespecific differences in eye size, as well as to contribute to evo-devo aspects. Optic lobe development occurs by neuroepithelial folding initiating from a differentiation center in the larval brain. From this center, the medula, lamina and lobula arise at the same time in drones and workers. Two steps mark the differentiation of the lamina (i) its origin from neuroblasts differentiating in the outer layer of the medula, this coinciding with the first peak of roughest expression during the feeding stage of the fifth larval instar, and (ii) 24 hours later, the appearance of hexagonal ommatidia, coinciding with a second peak in roughest expression. Upon including further candidate genes related to insect eye development [small optic lobe (sol), eyes absent (eya), minibrain (mnb), sine oculis (so), embryonic lethal, abnormal vision (elav) and epidermal growth factor receptor (egfr)] we found distinct expression peaks for sol, eya, mnb and so, with timing and relative transcript levels differing between drones and workers. Whereas these four genes showed a relatively synchronous pattern of expression in drones in the fifth larval instar, this was not so in workers. Furthermore, in prepupae sol was higher expressed in workers than the other three genes, and also in comparison to drones. Both sexes showed a strikingly similar expression pattern for elav, except for some delay in drones. In contrast, egfr expression was found to occur earlier in drones. Through a global transcriptom analysis, done at a key step of larval development, several genes were reveled as diffetentially expressed, many of these regulating cell cycle steps. In conclusion, the relationship in the timing of morphological events with gene expression patterns revealed differences possibly related to mechanisms underlying development of the highly dimorphic compound eye in the honey bee.

As síndromes hipertensivas gestacionais estão entre as maiores causas de morte materna e fetal. Entre elas destaca-se a pré-eclâmpsia (PE), que caracteriza-se pelo aumento da pressão arterial e proteinúria, a partir da 20ª semana de gestação. Embora sua etiologia seja ainda discutida, o papel dos fatores genéticos é amplamente aceito. Alterações do padrão da inativação do cromossomo X, processo epigenético encontrado em mamíferos com placenta, têm sido encontradas em algumas doenças que ocorrem exclusivamente em mulheres. O XIST é um gene chave nesse processo. Por outro lado, muitos microRNAs (pequenos RNAs não codificantes) são expressos abundantemente na placenta humana e alguns estão mapeados no cromossomo X. O objetivo do presente trabalho foi a verificação do padrão de inativação do cromossomo X e da expressão dos genes XIST e dos microRNAs X-específicos miR-221, miR-222 e mir-223 em mulheres com PE. O ensaio de HUMARA (receptor de andrógeno humano) utilizando PCR convencional e digestão com a enzima sensível à metilação HpaII foi analisado de forma qualitativa (visualização em gel de poliacrilamida) e semi-quantitativa (sequenciamento), sendo realizado a partir de sangue periférico (todas as amostras) e de tecido placentário [apenas das placentas de fetos femininos (17 amostras)]. Para o estudo do padrão de expressão foi obtido cDNA por transcrição reversa, a partir de RNA total extraído do tecido placentário (30 amostras).. A análise foi realizada por meio de PCR em tempo real. Foram utilizados os testes de Qui-quadrado e de t-Student, além do modelo linear generalizado para a análise estatística. Não houve diferença estatisticamente significativa para o parâmetro de inativação do cromossomo X entre os grupos controle e de PE, independente do tipo de tecido estudado (sangue ou placenta) quando foram aplicados os ensaios de HUMARA qualitativo e semi-quantitativo. Para o gene XIST e o microRNA miR-221 não foi evidenciada diferença estatisticamente significativa entre os grupos controle e de PE. O microRNA miR-223 não apresentou transcritos detectáveis em nenhum dos grupos de estudo. Para o microRNA miR-222, houve diferença estatisticamente significativa, sendo que no grupo de PE a expressão foi mais elevada. Não foi encontrada associação entre o padrão de inativação do cromossomo X e a expressão do gene XIST e dos microRNAs estudados. Embora a inativação preferencial do cromossomo X tenha sido encontrada nos dois grupos, padrões de inativação preferencial extrema foram verificados em um número maior de casos com PE. Os resultados mostram que o miR-222 apresenta potencial para ser utilizado como marcador molecular da PE, sugerindo também que exista uma diminuição na expressão de seus genes-alvo que devem ser estudados como candidatos na patogênese da doença. / The gestational hypertensive syndromes are among the major causes of maternal and fetal death. The Preeclampsia (PE) is the most prevalent of those syndromes and it is characterized by the increase of blood pressure and proteinury, which start from to 20th week of gestation. Although its ethiology is argued actually the genetics factors have been accepted. Alterations in pattern of chromosome X inactivation, epigenetic process of mammals with placenta have been found in some diseases that occur exclusively in women. XIST is a key gene in this process. On the other hand very microRNAs (small RNAs no coding) are overexpressed in human placenta and someones are located at X choromosome. The subject of this research was verify the patterns of chromosome X inactivation and the expression of the XIST gene and X-specific microRNAs in women affected by PE. In the HUMARA (human androgen receptor) assay was carried out with peripheral blood (all samples) and placental tissue [only female fetuses placentas (17 samples)]. The conventional PCR and digestion methodology with HpaII enzyme were employed and the result was analysed to qualitative (polyacrilamide gel) and semi quantitative (sequencing) form. The cDNA was obtained to gene expression study by reverse transcription reaction from placenta total RNA (30 samples). Gene expression assay was carried out with real time PCR. To statistical analyze was used the Qui-square and t-Student tests besides the widespread lineal model. There was not statistical significant differences to chormosome X inactivation parameter among the groups control and PE independently of the tissue studied (blood or placenta) when the qualitative and semi quantitative HUMARA assay were applied. To XIST and miR-221 were not evidenced significant statistical differences among the groups control and of PE. The miR-223 did not show detectable transcripts to any group studied. The miR-222 expression was more elevated in the PE group than control group and this difference was significant statistically. In the present study was not found association among the chromosome X inactivation pattern and the gene expression of XIST and the microRNAs studied. Although the chromosome X inactivation have been found in the two groups the preferential chromosome X inactivation patterns were verified in a great number of cases in PE group. The results showed that miR-222 has a potential to be employed as molecular marker of PE also suggesting the existence of a decrease in expression of its target genes which have to be investigated like candidates to disease pathogenesis.

A endometriose é uma doença ginecológica benigna, de etiologia complexa e multifatorial, caracterizada pela presença de estroma e tecido glandular tipo endométrio fora da cavidade uterina. Afeta de 10 a 15% da população feminina, que apresentam sintomatologia variada, incluindo dor pélvica e infertilidade. Para elucidar mecanismos potenciais que estejam envolvidos com a fisiopatologia complexa desta doença, analisamos o perfil de expressão gênico diferencial pela metodologia de hibridação subtrativa em tecido eutópico e ectópico (lesões peritoniais e endometrioma ovariano) de 17 mulheres com endometriose, no início da fase proliferativa do ciclo menstrual. Foram identificados 291 genes desregulados nas lesões endometrióticas, considerados como genes candidatos. Para a validação dos dados, utilizamos a metodologia de PCR em tempo real para os genes CTGF e SPARC, indicados como superexpressos; e MYC, MMP3, IGFBP1 e PAEP como menos expressos nas lesões. Diferenças significativas de expressão nas lesões peritoniais foram obtidas para os genes SPARC, MYC, IGFBP1, PAEP e nos endometriomas ovarianos para os genes MMP3 e PAEP. Sugerimos que a desregulação dos genes SPARC, MYC, MMP3, IGFBPI e PAEP seja responsável pela perda da homeostase celular nas lesões endometrióticas, contribuindo para a implantação e sobrevivência do tecido ectópico no ambiente extra-uterino. Este trabalho disponibilizou ao banco de dados da literatura, 291 genes com expressão gênica diferencial em lesões endometriótricas peritoniais e ovarianas como candidatos a investigações futuras. / Endometriosis is a benign gynecological disease, which presents a multifactorial and complex etiology, characterized by the presence of stromal and glandular endometrium tissue outside the uterine cavity. Ten to 15% of the female population is affected by the disease with a wideranging symptomatology including pelvic pain and infertility. To clarify the potential mechanisms involved in the complex physiopathology of this disease, we analyzed the differential gene expression profile by subtractive hybridization in eutopic and ectopic tissue (peritoneal lesions and ovarian endometriomas) from 17 women with endometriosis, in the early proliferative phase of the menstrual cycle. We identified 291 genes deregulated in the endometriotic lesions, considered as candidate genes. For data validation, Real Time PCR was applied for genes CTGF and SPARC, indicated as overexpressed; and for genes MYC, MMP3, IGFBP1 and PAEP, indicated as downregulated in the lesions. Significant differences in the peritoneal lesions expression were obtained for genes SPARC, MYC, IGFBP1, PAEP and in the ovarian endometriomas for genes MMP3 and PAEP. We suggest that the deregulation of genes SPARC, MYC, MMP3, IGFBPI and PAEP is responsible for loss of cellular homeostasis in the endometriotic lesions, contributing for the implantation and maintenance of the ectopic tissue in the extra-uterine environment. This study provided 291 genes with differential gene expression, in peritoneal and ovarian lesions, to the literature database as candidates for future investigations.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-12-19Bitstream added on 2014-06-13T19:42:46Z : No. of bitstreams: 1 stolf_r_dr_jabo.pdf: 614846 bytes, checksum: 82111cb3ffddd8bb8eb4829df0158e4a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A seca é, atualmente, o principal fator responsável por perdas na produção brasileira de soja. Em situações de déficit hídrico, vários mecanismos são acionados pela planta para aumentar a tolerância à seca. Conhecer esses mecanismos e como é regulada a expressão dos genes relacionados com resposta à seca, é essencial na identificação de rotas metabólicas envolvidas nos processos de defesa, e, conseqüentemente, no desenvolvimento de estratégias moleculares para obtenção de plantas mais tolerantes a essa condição. O estudo da expressão gênica em plantas requer a quantificação precisa de RNAm expressos em diferentes situações. Assim, inicialmente foram usados os eventos de soja geneticamente modificados para tolerância à seca, P58 e P1333, contendo a construção rd29a: Atdreb1a, em condições de 15% de umidade gravimétrica (UG) para hibridização em chips contendo 44 Kb de oligonucleotídeos, sendo possível identificar 100 genes diferencialmente expressos em cada evento, quando comparados com a planta controle. Posteriormente, foram utilizadas cultivares de soja contrastantes para a tolerância à seca, em diferentes condições de déficit hídrico no sistema de hidroponia, e construídos arranjos de cDNA a partir de biblioteca gerada, obtendo-se 145 genes diferencialmente expressos que codificam proteínas envolvidas direta elou indiretamente em rotas metabólicas de resposta a estresses bióticos e abióticos. Os grupos de genes identificados como diferencialmente expressos durante os tratamentos aplicados em ambos os experimentos foram classificados em categorias funcionais, entre eles genes envolvidos na produção de energia, fatores de transcrição, genes envolvidos em diferentes vias anabólicas e/ou catabólicas como aminoácidos, lipídeos, carboidratos e no metabolismo fotossintético, genes de respostas a estresses, genes que participam... / The drought is currently the main responsible factor for losses Brazilian soybeans production. In water stress situation, several mechanisms are triggered by the plant to increase tolerance to drought. Knowing these mechanisms and how is regulated the expression of genes related to the drought response is essential in identifying routes involved in the metabolic processes of defense, and, therefore, the development of molecular strategies to obtain more tolerant plants to this condition. The study of gene expression in plants requires the quantification of RNAm expressed in different situations. So, initially, two methodologies of DNA microarray for analysis in large scale of differential gene expression were conducted. First, soybeans events genetically modified for tolerance to drought, P58 and P1333 containing the construction rd29a: Atdreb1a under conditions of 15% gravimetric humidity (GH) were used in chips containing 44 Kb of oligonucleotides, being able to identify 100 differential gene expression in each event, compared with the control plant. Subsequently, contrasting cultivars to drought were used, in different conditions of water stress in the hidroponic system, and cDNA arrays were constructed, getting 145 differential gene expression that encode proteins involved directly and I or indirectly on routes of metabolic response to biotic and abiotic stresses. The groups of genes identified with differential expression during the treatments applied in both experiments were classified into functional categories, including genes involved in the production of energy, of transcription factors, genes involved in different ways anabolics and I or catabolics as amino acids, lipids, carbohydrates and the photosynthetic metabolism, gene responses to stresses, genes that participate in the synthesis of proteins, cell communication, the cell cycle, cellular transport genes with... (Complete abstract click electronic access below)

A endometriose é uma doença ginecológica benigna, de etiologia complexa e multifatorial, caracterizada pela presença de estroma e tecido glandular tipo endométrio fora da cavidade uterina. Afeta de 10 a 15% da população feminina, que apresentam sintomatologia variada, incluindo dor pélvica e infertilidade. Para elucidar mecanismos potenciais que estejam envolvidos com a fisiopatologia complexa desta doença, analisamos o perfil de expressão gênico diferencial pela metodologia de hibridação subtrativa em tecido eutópico e ectópico (lesões peritoniais e endometrioma ovariano) de 17 mulheres com endometriose, no início da fase proliferativa do ciclo menstrual. Foram identificados 291 genes desregulados nas lesões endometrióticas, considerados como genes candidatos. Para a validação dos dados, utilizamos a metodologia de PCR em tempo real para os genes CTGF e SPARC, indicados como superexpressos; e MYC, MMP3, IGFBP1 e PAEP como menos expressos nas lesões. Diferenças significativas de expressão nas lesões peritoniais foram obtidas para os genes SPARC, MYC, IGFBP1, PAEP e nos endometriomas ovarianos para os genes MMP3 e PAEP. Sugerimos que a desregulação dos genes SPARC, MYC, MMP3, IGFBPI e PAEP seja responsável pela perda da homeostase celular nas lesões endometrióticas, contribuindo para a implantação e sobrevivência do tecido ectópico no ambiente extra-uterino. Este trabalho disponibilizou ao banco de dados da literatura, 291 genes com expressão gênica diferencial em lesões endometriótricas peritoniais e ovarianas como candidatos a investigações futuras. / Endometriosis is a benign gynecological disease, which presents a multifactorial and complex etiology, characterized by the presence of stromal and glandular endometrium tissue outside the uterine cavity. Ten to 15% of the female population is affected by the disease with a wideranging symptomatology including pelvic pain and infertility. To clarify the potential mechanisms involved in the complex physiopathology of this disease, we analyzed the differential gene expression profile by subtractive hybridization in eutopic and ectopic tissue (peritoneal lesions and ovarian endometriomas) from 17 women with endometriosis, in the early proliferative phase of the menstrual cycle. We identified 291 genes deregulated in the endometriotic lesions, considered as candidate genes. For data validation, Real Time PCR was applied for genes CTGF and SPARC, indicated as overexpressed; and for genes MYC, MMP3, IGFBP1 and PAEP, indicated as downregulated in the lesions. Significant differences in the peritoneal lesions expression were obtained for genes SPARC, MYC, IGFBP1, PAEP and in the ovarian endometriomas for genes MMP3 and PAEP. We suggest that the deregulation of genes SPARC, MYC, MMP3, IGFBPI and PAEP is responsible for loss of cellular homeostasis in the endometriotic lesions, contributing for the implantation and maintenance of the ectopic tissue in the extra-uterine environment. This study provided 291 genes with differential gene expression, in peritoneal and ovarian lesions, to the literature database as candidates for future investigations.

As síndromes hipertensivas gestacionais estão entre as maiores causas de morte materna e fetal. Entre elas destaca-se a pré-eclâmpsia (PE), que caracteriza-se pelo aumento da pressão arterial e proteinúria, a partir da 20ª semana de gestação. Embora sua etiologia seja ainda discutida, o papel dos fatores genéticos é amplamente aceito. Alterações do padrão da inativação do cromossomo X, processo epigenético encontrado em mamíferos com placenta, têm sido encontradas em algumas doenças que ocorrem exclusivamente em mulheres. O XIST é um gene chave nesse processo. Por outro lado, muitos microRNAs (pequenos RNAs não codificantes) são expressos abundantemente na placenta humana e alguns estão mapeados no cromossomo X. O objetivo do presente trabalho foi a verificação do padrão de inativação do cromossomo X e da expressão dos genes XIST e dos microRNAs X-específicos miR-221, miR-222 e mir-223 em mulheres com PE. O ensaio de HUMARA (receptor de andrógeno humano) utilizando PCR convencional e digestão com a enzima sensível à metilação HpaII foi analisado de forma qualitativa (visualização em gel de poliacrilamida) e semi-quantitativa (sequenciamento), sendo realizado a partir de sangue periférico (todas as amostras) e de tecido placentário [apenas das placentas de fetos femininos (17 amostras)]. Para o estudo do padrão de expressão foi obtido cDNA por transcrição reversa, a partir de RNA total extraído do tecido placentário (30 amostras).. A análise foi realizada por meio de PCR em tempo real. Foram utilizados os testes de Qui-quadrado e de t-Student, além do modelo linear generalizado para a análise estatística. Não houve diferença estatisticamente significativa para o parâmetro de inativação do cromossomo X entre os grupos controle e de PE, independente do tipo de tecido estudado (sangue ou placenta) quando foram aplicados os ensaios de HUMARA qualitativo e semi-quantitativo. Para o gene XIST e o microRNA miR-221 não foi evidenciada diferença estatisticamente significativa entre os grupos controle e de PE. O microRNA miR-223 não apresentou transcritos detectáveis em nenhum dos grupos de estudo. Para o microRNA miR-222, houve diferença estatisticamente significativa, sendo que no grupo de PE a expressão foi mais elevada. Não foi encontrada associação entre o padrão de inativação do cromossomo X e a expressão do gene XIST e dos microRNAs estudados. Embora a inativação preferencial do cromossomo X tenha sido encontrada nos dois grupos, padrões de inativação preferencial extrema foram verificados em um número maior de casos com PE. Os resultados mostram que o miR-222 apresenta potencial para ser utilizado como marcador molecular da PE, sugerindo também que exista uma diminuição na expressão de seus genes-alvo que devem ser estudados como candidatos na patogênese da doença. / The gestational hypertensive syndromes are among the major causes of maternal and fetal death. The Preeclampsia (PE) is the most prevalent of those syndromes and it is characterized by the increase of blood pressure and proteinury, which start from to 20th week of gestation. Although its ethiology is argued actually the genetics factors have been accepted. Alterations in pattern of chromosome X inactivation, epigenetic process of mammals with placenta have been found in some diseases that occur exclusively in women. XIST is a key gene in this process. On the other hand very microRNAs (small RNAs no coding) are overexpressed in human placenta and someones are located at X choromosome. The subject of this research was verify the patterns of chromosome X inactivation and the expression of the XIST gene and X-specific microRNAs in women affected by PE. In the HUMARA (human androgen receptor) assay was carried out with peripheral blood (all samples) and placental tissue [only female fetuses placentas (17 samples)]. The conventional PCR and digestion methodology with HpaII enzyme were employed and the result was analysed to qualitative (polyacrilamide gel) and semi quantitative (sequencing) form. The cDNA was obtained to gene expression study by reverse transcription reaction from placenta total RNA (30 samples). Gene expression assay was carried out with real time PCR. To statistical analyze was used the Qui-square and t-Student tests besides the widespread lineal model. There was not statistical significant differences to chormosome X inactivation parameter among the groups control and PE independently of the tissue studied (blood or placenta) when the qualitative and semi quantitative HUMARA assay were applied. To XIST and miR-221 were not evidenced significant statistical differences among the groups control and of PE. The miR-223 did not show detectable transcripts to any group studied. The miR-222 expression was more elevated in the PE group than control group and this difference was significant statistically. In the present study was not found association among the chromosome X inactivation pattern and the gene expression of XIST and the microRNAs studied. Although the chromosome X inactivation have been found in the two groups the preferential chromosome X inactivation patterns were verified in a great number of cases in PE group. The results showed that miR-222 has a potential to be employed as molecular marker of PE also suggesting the existence of a decrease in expression of its target genes which have to be investigated like candidates to disease pathogenesis.

Leishmania é um gênero de protozoários tripanossomatídeos, dimórficos, causadores das leishmanioses. As espécies do subgênero Viannia, como Leishmania (Viannia) braziliensis, são causadoras da leishmaniose cutânea e cutâneo-mucosa nas Américas Central e do Sul. A regulação da expressão gênica em Leishmania ocorre preferencialmente no nível póstranscricional com a participação de elementos regulatórios de ação cis e trans e proteínas ligantes de RNA. Neste contexto, RNAs não codificadores (ncRNAs) conhecidos por seus papéis regulatórios em diversos organismos, ainda são pouco explorados em Leishmania. Sendo assim, o presente estudo analisou o transcriptoma de L. braziliensis explorando o conteúdo codificador e não codificador do parasita. A investigação de expressão diferencial (DE), incluindo análises de enriquecimento de ontologias gênicas, confirmou padrões de expressão, por categoria funcional, como os já reportados para outras espécies de Leishmania durante o desenvolvimento. No entanto, a avaliação do conjunto desses genes DE, empregando a ortologia como parâmetro, sugeriu uma possível contribuição de genes parálogos para a diversidade entre espécies de Leishmania. Para a análise de ncRNAs, um pipeline desenvolvido por Patrícia C. Ruy possibilitou a identificação e caracterização de 11372 ncRNAs putativos em L. braziliensis. Análises acerca dos padrões de expressão diferencial foi conduzido e trinta e cinco ncRNAs putativos foram categorizados, selecionados e submetidos a Northern blotting para avaliação do tamanho e confirmação do padrão de expressão; seis genes foram selecionados para análises funcionais subsequentes. Para avaliação de uma possível função para os ncRNAs a serem investigados, foram gerados parasitos nocaute de cinco desses ncRNAs. O crescimento dos parasitos nocaute em cultura axênica não foi afetado pela ausência dos genes mas o perfil de infecção de macrófagos in vitro foi afetado em 4 dos 6 transfectantes; sugerindo que os ncRNAs sejam funcionais. Cinco ncRNAs foram submetidos a ensaios de pull-down e o conjunto de proteínas ligantes desses transcritos foi identificada. Esse estudo do transcriptoma de L. braziliensis contribui para o entendimento da modulação da expressão dos genes codificadores de proteínas, revela o conteúdo de ncRNA putativos, sua expressão diferencial durante o seu desenvolvimento e ensaia os primeiros estudos funcionais sobre os últimos / Leishmania is a genus of trypanosomatid protozoan parasites, causative agents of leishmaniases. Viannia sub-genera species as Leishmania (Viannia) braziliensis are the causative agents of cutaneous and muco-cutaneous leishmaniasis in Central and South America. The gene expression in this parasites is regulated via post-transcriptional mecanisms comprising the action of cis and trans regulatory elements and RNA binding proteins. In this context, non coding RNAs poorly explored as putative factors involved in regulation of gene expression in Leishmania must be investigated. In this study the transcriptome of coding and ncRNAs of L. braziliensis were analysed. Differential expression analysis, including gene ontology enrichment analysis, during the parasite development revealed the expected paterns for gene expression in Leishamnia spp. A comparative analysis, considering up-regulated genes suggested a contribution of paralogues genes to diversity between Leishmania. spp. To uncover putative ncRNAs, a computational pipeline was previous designed identifying and characterizing 11,372 putative ncRNAs in L. braziliensis, allowing a classification into different ncRNAs classes. The differential expression analysis revealed similar patterns to those observed for protein coding genes. Thirty-five putative ncRNAs were categorized, selected and subjected to Northern blotting being 6 of them selected to functional analysis. These selected group was investigated conducting and stablishing knockout lines, that revealed phenotypic differences concerning diminishing in promastigote growth and in vitro macrophage infection, suggesting possible functional roles of ncRNAs in L. braziliensis. Finnaly, the protein interactions of these ncRNAs were revealed and must be explored in the future to uncover possible regulatory roles of this ncRNAs until now, putative in L. braziliensis. This work represents an outline of L. braziliensis transcriptome contributing to improve the understanding of coding and noncoding RNA content in the parasite

As células-tronco hematopoéticas (CTHs) e estromais mesenquimais multipotentes (CTMs) isoladas da medula óssea vêm sendo utilizadas como fonte autóloga no tratamento de doenças autoimunes, como a esclerose múltipla (EM). As CTHs dão origem a todas as células dos sistemas hematopoético e imunológico e as CTMs possuem propriedades imunomoduladoras pela liberação de fatores solúveis e interação célula-célula. Existem trabalhos que sugerem que as doenças autoimunes sejam provenientes de defeitos intrínsecos nas células-tronco precursoras da medula óssea. Com o intuito de avaliar se as CTHs e CTMs de pacientes com EM possuem alterações intrínsecas, o objetivo geral deste trabalho foi avaliar o perfil de expressão gênica diferencial por microarrays de CTHs e CTMs de pacientes com EM, além de avaliar o perfil de expressão gênica de CTMs após o transplante autólogo de CTHs e a capacidade imunomoduladora in vitro das CTMs de pacientes. As CTHs e CTMs foram isoladas da medula óssea de pacientes com EM e doadores saudáveis, após consentimento informado. As CTHs foram isoladas por colunas imunomagnéticas e as CTMs foram isoladas por gradiente de densidade e submetidas à caracterização morfológica, imunofenotípica e capacidade de diferenciação em adipócitos e osteócitos. O RNA das CTHs e CTMs foi extraído e purificado e o perfil de expressão gênica foi avaliado por microarrays, utilizando hibridações em lâminas contendo 44.000 sondas. A capacidade imunomoduladora das CTMs de pacientes e controles foi avaliada por ensaios de cocultivo com linfócitos alogênicos e as citocinas foram quantificadas no sobrenadante por CBA flex e ELISA. Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. Os resultados mostraram que as CTHs de pacientes possuem perfis de expressão gênica diferentes dos controles, com 2.722 genes diferencialmente expressos, envolvidos em vias de sinalização importantes para manutenção/proliferação das CTHs e diferenciação em linhagens específicas durante a hematopoese. Dentre essas sinalizações estão incluídas as vias da apoptose, Wnt, Notch, mTOR, PI3K/Akt e Ca/NFAT, sugerindo que as CTHs de pacientes com EM possuam alterações intrínsecas que podem estar relacionadas com a patogenia da doença autoimune. As CTMs isoladas de pacientes com EM exibiram aparência senescente e reduzida expressão de marcadores imunofenotípicos. Com relação à expressão gênica, as CTMs de pacientes possuem perfil diferente das CTMs controle, sendo detectados 618 genes diferencialmente expressos, incluindo genes relacionados à sinalização FGF, HGF, sinalização de moléculas de adesão e moléculas envolvidas nos processos de imunorregulação, como IL10, IL6, TGFB1, IFNGR1, IFNGR2 e HGF. O perfil de expressão gênica das CTMs de pacientes pós-transplante assemelhou-se ao perfil das CTMs pré-transplante. Ensaios de cocultivo de CTMs com linfócitos alogênicos mostraram que as CTMs de pacientes possuem capacidade antiproliferativa reduzida em relação às CTMs controle, e ainda, secreção reduzida de TGF- e IL-10 no sobrenadante das coculturas. Esses dados sugerem que as CTMs isoladas de pacientes com EM possuam alterações fenotípicas, transcricionais e funcionais. Embasados nesses achados, concluímos que as CTHs e as CTMs de pacientes com EM possuem alterações intrínsecas que podem estar relacionadas com a patogenia da doença. Uma vez que as CTMs sejam células com grande potencial terapêutico para controle da EM em pacientes refratários aos tratamentos convencionais, as alterações encontradas sugerem que CTMs de doadores saudáveis sejam mais adequadas em aplicações clínicas. / Bone marrow hematopoietic stem cells (HSCs) and mesenchymal stromal cells (MSCs) have been used as an autologous source to treat autoimmune diseases, such as multiple sclerosis (MS). HSC give rise to all hematopoietic and immune system cells, and MSCs exhibit immunomodulatory properties by releasing soluble factors and by cell-cell interactions. Evidence indicates that bone marrow stem cells obtained from patients with autoimmune diseases may present intrinsic defects. To assess whether or not HSC and MSC of MS patients have intrinsic defects, the main objective of this study was to evaluate the differential gene expression profiles of HSC and MSC from MS patients before and after autologous HSC transplantation, and additionally, to evaluate the in vitro immunomodulatory ability of patient MSCs. Bone marrow HSC and MSCs were isolated from MS patients and healthy donors. HSCs were isolated by immunomagnetic columns and MSCs were isolated by gradient density and cultured until the third passage. MSCs were characterized according to morphology, immunophenotypic markers and cell differentiation into adipocytes and osteocytes. HSC and MSCs mRNAs were extracted, purified, and the gene expression profile was evaluated by microarray hybridizations, using a platform containing 44.000 probes. The immunomodulatory activity of patient and control MSCs was assessed by coculture assays with allogeneic lymphocytes. Cytokines were quantified in coculture supernatants by ELISA and CBA flex. This study was approved by the Ethics Committee of the University Hospital of the School of Medicine of Ribeirão Preto. The results showed that the patient HSCs exhibited a distinctive gene expression profile when compared to healthy HSCs, yielding 2.722 differentially expressed genes, involved in essential HSC signaling pathways for maintenance, proliferation and differentiation into specific lineages during hematopoiesis. Among these signaling pathways were included, apoptosis, Wnt, Notch, mTOR, PI3K/Akt and Ca/NFAT, suggesting that patient HSCs have significant intrinsic transcriptional alterations that may be associated with MS pathogenesis. Regarding MSCs isolated from MS patients, they exhibited senescence appearance, decreased expression of immunophenotypic markers, and also exhibited a distinctive gene expression profile in relation to healthy MSCs, yielding 618 genes differentially expressed genes, included in FGF and HGF signaling pathways, adhesion molecules, and genes involved in immunoregulation processes, such as IL-10, IL-6, TGFB1, IFNGR1, IFNGR2 and HGF. Coculture assays of control or patient MSCs with allogeneic lymphocytes showed that patient cells exhibited reduced antiproliferative activity as compared with controls, and also exhibited reduced secretion of TGF- and IL-10 cytokines in coculture supernatants. These data suggest that MSCs isolated from MS patients have phenotypic, functional and transcriptional defects, highlighting genes related to MSC maintenance, adhesion and immunomodulatory effects. According to these results, we concluded that patient HSCs and MSCs have intrinsic defects that may be associated with the disease per se. Considering that MSCs exhibit great therapeutic potential to control MS patients refractory to conventional treatment, the major MSCs alterations observed in this study indicate that healthy MSCs may be more suitable for MS cell therapy.

As células-tronco hematopoéticas (CTHs) e estromais mesenquimais multipotentes (CTMs) isoladas da medula óssea vêm sendo utilizadas como fonte autóloga no tratamento de doenças autoimunes, como a esclerose múltipla (EM). As CTHs dão origem a todas as células dos sistemas hematopoético e imunológico e as CTMs possuem propriedades imunomoduladoras pela liberação de fatores solúveis e interação célula-célula. Existem trabalhos que sugerem que as doenças autoimunes sejam provenientes de defeitos intrínsecos nas células-tronco precursoras da medula óssea. Com o intuito de avaliar se as CTHs e CTMs de pacientes com EM possuem alterações intrínsecas, o objetivo geral deste trabalho foi avaliar o perfil de expressão gênica diferencial por microarrays de CTHs e CTMs de pacientes com EM, além de avaliar o perfil de expressão gênica de CTMs após o transplante autólogo de CTHs e a capacidade imunomoduladora in vitro das CTMs de pacientes. As CTHs e CTMs foram isoladas da medula óssea de pacientes com EM e doadores saudáveis, após consentimento informado. As CTHs foram isoladas por colunas imunomagnéticas e as CTMs foram isoladas por gradiente de densidade e submetidas à caracterização morfológica, imunofenotípica e capacidade de diferenciação em adipócitos e osteócitos. O RNA das CTHs e CTMs foi extraído e purificado e o perfil de expressão gênica foi avaliado por microarrays, utilizando hibridações em lâminas contendo 44.000 sondas. A capacidade imunomoduladora das CTMs de pacientes e controles foi avaliada por ensaios de cocultivo com linfócitos alogênicos e as citocinas foram quantificadas no sobrenadante por CBA flex e ELISA. Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. Os resultados mostraram que as CTHs de pacientes possuem perfis de expressão gênica diferentes dos controles, com 2.722 genes diferencialmente expressos, envolvidos em vias de sinalização importantes para manutenção/proliferação das CTHs e diferenciação em linhagens específicas durante a hematopoese. Dentre essas sinalizações estão incluídas as vias da apoptose, Wnt, Notch, mTOR, PI3K/Akt e Ca/NFAT, sugerindo que as CTHs de pacientes com EM possuam alterações intrínsecas que podem estar relacionadas com a patogenia da doença autoimune. As CTMs isoladas de pacientes com EM exibiram aparência senescente e reduzida expressão de marcadores imunofenotípicos. Com relação à expressão gênica, as CTMs de pacientes possuem perfil diferente das CTMs controle, sendo detectados 618 genes diferencialmente expressos, incluindo genes relacionados à sinalização FGF, HGF, sinalização de moléculas de adesão e moléculas envolvidas nos processos de imunorregulação, como IL10, IL6, TGFB1, IFNGR1, IFNGR2 e HGF. O perfil de expressão gênica das CTMs de pacientes pós-transplante assemelhou-se ao perfil das CTMs pré-transplante. Ensaios de cocultivo de CTMs com linfócitos alogênicos mostraram que as CTMs de pacientes possuem capacidade antiproliferativa reduzida em relação às CTMs controle, e ainda, secreção reduzida de TGF- e IL-10 no sobrenadante das coculturas. Esses dados sugerem que as CTMs isoladas de pacientes com EM possuam alterações fenotípicas, transcricionais e funcionais. Embasados nesses achados, concluímos que as CTHs e as CTMs de pacientes com EM possuem alterações intrínsecas que podem estar relacionadas com a patogenia da doença. Uma vez que as CTMs sejam células com grande potencial terapêutico para controle da EM em pacientes refratários aos tratamentos convencionais, as alterações encontradas sugerem que CTMs de doadores saudáveis sejam mais adequadas em aplicações clínicas. / Bone marrow hematopoietic stem cells (HSCs) and mesenchymal stromal cells (MSCs) have been used as an autologous source to treat autoimmune diseases, such as multiple sclerosis (MS). HSC give rise to all hematopoietic and immune system cells, and MSCs exhibit immunomodulatory properties by releasing soluble factors and by cell-cell interactions. Evidence indicates that bone marrow stem cells obtained from patients with autoimmune diseases may present intrinsic defects. To assess whether or not HSC and MSC of MS patients have intrinsic defects, the main objective of this study was to evaluate the differential gene expression profiles of HSC and MSC from MS patients before and after autologous HSC transplantation, and additionally, to evaluate the in vitro immunomodulatory ability of patient MSCs. Bone marrow HSC and MSCs were isolated from MS patients and healthy donors. HSCs were isolated by immunomagnetic columns and MSCs were isolated by gradient density and cultured until the third passage. MSCs were characterized according to morphology, immunophenotypic markers and cell differentiation into adipocytes and osteocytes. HSC and MSCs mRNAs were extracted, purified, and the gene expression profile was evaluated by microarray hybridizations, using a platform containing 44.000 probes. The immunomodulatory activity of patient and control MSCs was assessed by coculture assays with allogeneic lymphocytes. Cytokines were quantified in coculture supernatants by ELISA and CBA flex. This study was approved by the Ethics Committee of the University Hospital of the School of Medicine of Ribeirão Preto. The results showed that the patient HSCs exhibited a distinctive gene expression profile when compared to healthy HSCs, yielding 2.722 differentially expressed genes, involved in essential HSC signaling pathways for maintenance, proliferation and differentiation into specific lineages during hematopoiesis. Among these signaling pathways were included, apoptosis, Wnt, Notch, mTOR, PI3K/Akt and Ca/NFAT, suggesting that patient HSCs have significant intrinsic transcriptional alterations that may be associated with MS pathogenesis. Regarding MSCs isolated from MS patients, they exhibited senescence appearance, decreased expression of immunophenotypic markers, and also exhibited a distinctive gene expression profile in relation to healthy MSCs, yielding 618 genes differentially expressed genes, included in FGF and HGF signaling pathways, adhesion molecules, and genes involved in immunoregulation processes, such as IL-10, IL-6, TGFB1, IFNGR1, IFNGR2 and HGF. Coculture assays of control or patient MSCs with allogeneic lymphocytes showed that patient cells exhibited reduced antiproliferative activity as compared with controls, and also exhibited reduced secretion of TGF- and IL-10 cytokines in coculture supernatants. These data suggest that MSCs isolated from MS patients have phenotypic, functional and transcriptional defects, highlighting genes related to MSC maintenance, adhesion and immunomodulatory effects. According to these results, we concluded that patient HSCs and MSCs have intrinsic defects that may be associated with the disease per se. Considering that MSCs exhibit great therapeutic potential to control MS patients refractory to conventional treatment, the major MSCs alterations observed in this study indicate that healthy MSCs may be more suitable for MS cell therapy.