Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniv., 2001. / Härtill 4 uppsatser.

Detoxification of canola chemical defenses (phytoalexins and others) is an important mechanism used by the blackleg fungus Leptosphaeria maculans/Phoma lingam to overcome the plant’s natural defenses. Phytoalexins are anti-microbial defense metabolites produced de novo by plants in response to pathogen attack and other forms of stress. L. maculans is successful in detoxifying several cruciferous phytoalexins into different products. For example, brassinin, a key phytoalexin from crucifers, is transformed into indole-3-carboxaldehyde. This thesis includes investigation of phytoalexin metabolism by L. maculans and related work: (i) transformation pathways of cruciferous phytoalexins and analogues; (ii) design and synthesis of potential inhibitors of brassinin detoxification. In continuation of previous work, homologues, analogues and structural relatives of brassinin were analysed for metabolism by L. maculans. Products of metabolism of these compounds were identified and the overall metabolic pathways were established. It was concluded that structural relatives of brassinin metabolized differently from brassinin. Antifungal bioassays of the products suggested that all these transformations were detoxification reactions. Among the phytoalexins, rapalexin A was not metabolized whereas, erucalexin was metabolized. Results of these metabolism studies using L. maculans along with the syntheses and antifungal activities of the metabolites will be presented. In the second part of thesis, inhibition of the detoxification of brassinin by L. maculans using quinolines and isoquinolines was investigated. These compounds resulted from replacement of indolyl containing structures with quinoline and isoquinoline moieties, and various substitutions such as phenyl, thiazolyl, bromo, chloro, hydroxy and methoxy groups. All these compounds were tested for their effect on brassinin detoxification and antifungal activity. Overall, a significant effect on the rate of brassinin detoxification in cultures of L. maculans was detected in the presence of compounds 6-bromo-2-phenylquinoline, 2-phenylquinoline, 3-phenylquinoline, 1-thiazolylisoquinoline. 6-Bromo-2-phenylquinoline was the most effective compound in slowing down the metabolism of brassinin and also was a weak inhibitor of the growth of L. maculans (virulent on canola). Results of the syntheses and evaluation of the compounds are discussed.

Phoma stem canker (aka Blackleg) caused by the fungal pathogen Leptosphaeria maculans is a major disease affecting Canola (Brassica napus L.). This study examined 674 L. maculans isolates collected in 2010 and 2011 from western Canada at ten avirulence gene loci. Overall, certain alleles were more prevalent with AvrLm6 and AvrLm7 present in >85% of isolates and AvrLm3, AvrLm9, and AvrLepR2 present in <10% of isolates. This study also examined the genetic diversity of Leptosphaeria maculans populations around the world. Blackleg disease is found in most countries where Brassica spp. are cultivated and there are indications that L. maculans is an expanding species displacing the less aggressive Leptosphaeria biglobosa. Twenty two microsatellite primers were used to screen 96 isolates from 8 countries. A phylogenetic tree to assess the evolutionary relationship between regions was generated and the results indicated that genetic diversity was correlated with geographic location. / October 2015

Universiẗat, Diss., 2004--Kiel.

Leptosphaeria maculans ‘brassicae’ (Lmb) est un champignon filamenteux de la classe des Dothideomycètes faisant partie du complexe d’espèces Leptosphaeria maculans-Leptosphaeria biglobosa composé d’agents pathogènes des crucifères. Lmb est particulièrement adapté au colza (Brassica napus) et provoque la maladie qui lui est la plus dommageable : la nécrose du collet. Dans le but de mieux comprendre et contrôler cette maladie, l’équipe d’accueil a initié un projet de génomique visant à identifier de façon systématique les gènes impliqués dans le pouvoir pathogène. Les premières données génomiques montraient deux aspects très importants et potentiellement spécifiques de Lmb : (i) tous les gènes d'avirulence caractérisés expérimentalement étaient localisés dans de grandes régions riches en bases AT et composées d'éléments transposables (ET), (ii) ces régions riches en AT préfiguraient une structure génomique particulière, qui, si elle se généralisait à l'ensemble du génome, aurait été totalement inédite chez un micro-organisme eucaryote. La première partie de cette thèse présente la description du génome de Lmb en se focalisant sur sa structure en isochores, résultant d’une invasion du génome par des ET qui ont ensuite été inactivés par un mécanisme de défense spécifique aux champignons ascomycètes, le RIP (Repeat-Induced Point mutation). Puis, l’impact potentiel de cette structure sur la diversification et l’évolution des protéines jouant un rôle clé lors de l’interaction agent pathogène-plante a été évalué, mettant ainsi en avant l’existence d’un génome à « deux vitesses ». Afin de mieux comprendre le rôle potentiel joué par les ET au niveau des capacités d’adaptation de Lmb au colza, une étude de génomique comparative et évolutive de cinq membres du complexe d’espèces a été réalisée. Ce travail montre que Lmb est la seule espèce du complexe dont le génome a été envahi par les ET, et que ces derniers sont impliqués dans (i) des réarrangements intrachromosomiques potentiellement liés à la spéciation entre Lmb et l’espèce la plus proche, (ii) la présence de gènes espèce-spécifiques et (iii) des déplacements dans des régions génomiques très dynamiques de gènes codant des effecteurs. Les travaux constituant cette thèse participent à la généralisation du concept selon lequel un lien fort existe chez les champignons filamenteux phytopathogènes entre ET et gènes impliqués dans la pathogenèse ou l’adaptation à l’hôte. / Leptosphaeria maculans ‘brassicae’ (Lmb) is a filamentous ascomycete from class Dothideomycetes. It belongs to the Leptosphaeria maculans-Leptosphaeria biglobosa species complex which comprises pathogens of crucifers. Lmb is specifically adapted to oilseed rape (Brassica napus) and is responsible for the most damaging disease of this crop: “stem canker”. In order to better understand and control the disease, the host team initiated a genomic project aiming at systematically identify genes involved in pathogenicity, analyse genome plasticity and evaluate their incidence on adaptability to host. Preliminary genome data firstly showed that all characterized avirulence genes were localized in large AT-rich regions, mainly composed of Transposable Elements (TEs). In addition, these AT-rich regions were the first hints that the Lmb genome may present a very unusual structure compared to other microorganisms. The first part of this thesis describes the Lmb genome with a special focus on its isochore structure, which is the result of a massive TE invasion of the genome followed by an inactivation of TEs by an ascomycete-specific defense mechanism called RIP (Repeat-Induced Point mutation). The potential impacts of this genome structure on diversification and evolution of proteins involved in the plant-pathogen interaction were assessed and highlighted the existence of a “two speed” genome. To better understand how TEs are involved in adaptation of Lmb towards oilseed rape, a comparative and evolutionary genomic analysis of five members of the species complex was conducted. This study shows that Lmb is the only species of the complex with genome invaded by TEs at such an extent, and that TEs are involved in (i) intrachromosomal rearrangements putatively related to the speciation event between Lmb and its closest relative species, (ii) the presence of species-specific genes, (iii) translocations of effector genes into highly dynamic genomic regions. Our data contribute to the generalization of the “two speed” genome concept in filamentous phytopathogens postulating that highly plastic regions of the genome are enriched in genes involved in niche adaptation and that a strong link exists between TEs and genes involved in pathogenesis or host adaptation.

Leptosphaeria maculans est l'agent de la nécrose du collet des crucifères, principale maladie fongique du colza (Brassica napus). Lorsque des variétés de colza possédant la résistance Rlm7 ont été commercialisées au début des années 2000, la totalité des souches européennes étaient avirulentes vis-à-vis de ce gène de résistance. A l'inverse, AvrLm3 était considéré comme absent de ces populations. Un précédent projet de thèse réalisé dans l'équipe a montré la rapide capacité d'adaptation de L. maculans à la pression de sélection exercée par Rlm7 (Daverdin et al. 2012) et le phénotypage des populations isolées lors de cette étude avait montré que 98% des souches virulentes vis-à-vis de Rlm7 étaient avirulentes vis-à-vis de Rlm3. L'hypothèse d'un masquage du phénotype avirulent dû à la présence d'AvrLm4-7 a alors été validée par la complémentation d'une souche avirulente vis-à-vis de Rlm3 par AvrLm4-7. Sur ces bases, l'objectif de mon projet de thèse était d'identifier AvrLm3 afin d'analyser l'antagonisme entre les phénotypes AvrLm3 et AvrLm4-7, ainsi que les mécanismes menant au contournement de Rlm3 et Rlm7.Le gène AvrLm3 avait été identifié comme génétiquement lié à AvrLm4-7. Toutefois il n'avait pas été possible d'identifier un gène candidat. Par la combinaison d'approches de génétique et de génomique (clonage positionnel, RNA-seq, séquençage de novo d'une souche avirulente et de clones BAC), j'ai pu identifier AvrLm3, dont la séquence était absente du génome de référence de L. maculans. AvrLm3 est très fortement exprimé lors des phases précoces de l'infection et code pour une petite protéine sécrétée et ne présentant pas d'homologies avec d'autres protéines fongiques. Ce gène a donc les caractéristiques classiques des gènes codant pour des effecteurs, mais présente la particularité d'être le premier gène d'avirulence de L. maculans localisé en région télomérique. Bien que le mécanisme par lequel la présence du gène AvrLm4-7 supprime la reconnaissance d'AvrLm3 dans l'interaction entre B. napus et L. maculans n'ait pas été élucidé au terme de ma thèse, plusieurs hypothèses ont pu être invalidées, notamment l'absence de régulation de l'expression d'AvrLm3 par AvrLm4-7. De plus, une approche double hybride a mis en évidence une absence d'interaction directe entre les deux protéines d'avirulence. L'isolement de souches de L. maculans issues de parcelles expérimentales en 2012 et 2013 a mis en évidence le contournement actuel de la résistance Rlm7, avec environ 10 % de souches virulentes. Le phénotypage de ces collections a confirmé la présence majoritaire d'un allèle avirulent d'AvrLm3 chez celles-ci, moins de 0,5 % des souches isolées étant virulentes à la fois vis-à-vis de Rlm3 et de Rlm7. L'analyse de 592 souches d'origine mondiale a montré qu'AvrLm3 est toujours présent chez L. maculans, sous diverses formes alléliques, suggérant un rôle majeur d'AvrLm3 dans la fitness fongique. La résurgence du phénotype avirulent vis-à-vis de Rlm3 suite au contournement de Rlm7 fait envisager l'opportunité d'exploiter l'interaction entre les deux gènes d'avirulence pour une gestion plus durable des gènes de résistance de B. napus, par l'alternance de cultivars possédant Rlm3 et Rlm7 ou le pyramidage de ces deux gènes dans des variétés de colza. De plus, le rôle démontré d'AvrLm3 et d'AvrLm4-7 dans l'agressivité lors de l'infection suppose un fort coût de fitness lié à la virulence. Toutefois, des mécanismes originaux de compensation permettant au champignon d'échapper à la reconnaissance par Rlm3 et Rlm7 tout en conservant a priori fonctionnelle la fonction effectrice d'AvrLm3 et AvrLm4-7 ont été identifiés. Les résultats obtenus lors de ce travail de thèse ont permis la meilleure caractérisation d'une interaction gène-pour-gène inhabituelle. La diversité des mécanismes moléculaires permettant à L. maculans de contourner la résistance Rlm3 illustre la complexité de la course aux armements entre les plantes et les agents pathogènes. / Leptosphaeria maculans is a Dothideomycete responsible for stem canker on oilseed rape (Brassica napus). Genetic control, encompassing mostly the use of major resistance genes, is the most effective method to control this pathogen. When the first cultivars harboring Rlm7 have been deployed in the early 2000's, all of the European isolates were avirulent towards this resistance gene and AvrLm3 was considered to be absent from the populations. In 2012, Daverdin et al. showed that L. maculans has the ability to rapidly overcome the Rlm7 resistance whenever a strong selection pressure is applied. The phenotyping of isolates sampled by Daverdin et al. also showed that more than 98 % of the isolates virulent towards Rlm7 had become avirulent towards Rlm3. This result led to the hypothesis that the presence of AvrLm4-7 can suppress AvrLm3 recognition by Rlm3 and this was validated by the complementation of an isolate avirulent towards Rlm3 with a functional allele of AvrLm4-7. AvrLm3 is genetically linked to AvrLm4-7, at a distance of 20 cM. However, no candidate gene was identified before the beginning of my PhD. The objective of my PhD project was to identify AvrLm3, in order to better understand the antagonistic relationship between AvrLm3 and AvrLm4-7 phenotypes. The combination of genetic and genomic approaches (genetic mapping, RNA-seq, de novo sequencing of an isolate avirulent towards Rlm3 and BAC clone sequencing) allowed me to identify AvrLm3, whose sequence was absent from the reference genome assembly. AvrLm3 has common characteristics with others genes encoding fungal effector: it codes for a small, cysteine-rich protein, is highly expressed at early infection stages and shows no homology with others fungal genes. Although the mechanism allowing the suppression of AvrLm3 recognition due to the presence of AvrLm4-7 has not been elucidated, several hypotheses were invalidated: the presence of AvrLm4-7 has no impact on AvrLm3 expression and the two avirulence proteins do not interact physically.The sampling of field isolates in 2012 and 2013 showed the currently ongoing breakdown of Rlm7, with ca. 10% of virulent isolates, and the resurgence of the AvrLm3 phenotype in these populations, only 0.5 % of isolates being virulent towards both Rlm3 and Rlm7. A large collection of isolates from worldwide origin was genotyped for AvrLm3. It revealed that all isolates possess AvrLm3, with a high level of allelic diversity. The resurgence of the avirulent phenotype towards Rlm3 following the breakdown the Rlm7, along with the important role of AvrLm3 and AvrLm4-7 in fungal fitness, suggest that the antagonistic relationship between these two avirulence phenotypes could be an opportunity to propose original strategies to increase the durability of Rlm3 and Rlm7, by alternating both resistance genes at the landscape level or using pyramiding strategies. However, we identified novel isoforms of AvrLm4-7 allowing the fungus to escape Rlm7 recognition, while maintaining the suppression of Rlm3 recognition effective. This work allowed to better characterize an unusual gene-for-gene relationship. Indeed, only one other example of antagonism between avirulence phenotypes has been identified to date, in the phytopathogenic fungus Fusarium oxysporum (Houterman et al., 2008). The diversity of mechanisms allowing L. maculans to overcome the Rlm3 resistance illustrates perfectly the complexity of the arms race between plants and pathogens.

In the first part of this thesis the metabolism of the phytotoxins destruxin B and sirodesmin PL in crucifers and non-crucifers was studied using HPLC-ESI-MSn. Destruxin B and sirodesmin PL are phytotoxins produced by the phytopathogenic fungi Alternaria brassicae (Berk.) Sacc. (causative agent of blackspot disease) and Leptosphaeria maculans (Desm) Ces. et de Not.[asexual stage Phoma lingam (Tode ex Fr) Desm.] (causative agent of blackleg disease). Five cruciferous species were used in this study: Arabidopsis thaliana L., Brassica rapa L., B. napus L., Thellungiella salsuginea Pallas and Erucastrum gallicum O.E. Schulz. In addition, the cereals Avena sativa L. and Triticum aestivum L. were studied similarly. Destruxin B was metabolized by all crucifers to hydroxydestruxin B, a transformation similar to previously reported reactions in other crucifers. In addition, destruxin B elicited production of phytoalexins in A. thaliana, T. salsuginea and E. gallicum, while no phytoalexins were detected in case of B. rapa and B. napus. In cereals destruxin B was transformed differently. Several metabolites were detected and identified by HPLC-ESI-MSn analyses: hydroxydestruxin B, two isomers of dehydrodestruxin B and desmethyldestruxin B. On the other hand, no metabolites related to transformation of sirodesmin PL were detected in crucifers; however, in cereals sirodesmin PL was transformed to deacetylsirodesmin PL. In all crucifers sirodesmin PL was found to be a stronger elicitor of phytoalexin production than destruxin B. In the second part of this thesis, mycelia from different pathogenic fungi were screened for indolyl-3-acetaldoxime dehydratase. L. maculans isolate Laird 2 was chosen for isolation, characterization and substrate specificity of aldoxime dehydratase, as it showed the highest specific activity among the tested pathogens. The enzyme was partially purified using three chromatographic steps. It showed Michaelis–Menten kinetics and an apparent molecular mass of about 40 kDa. Based on its substrate specificity, the enzyme appears to be an indolyl-3-acetaldoxime dehydratase

Freie Univ., Diss.--Berlin, 1999.

Magistrantūros studijų darbu siekta nustatyti Leptosphaeria maculans ir L. biglobosa rūšių paplitimą ir pasiskirstymą ant įvairių rūšių bastutinių šeimos augalų (Brassica napus var. biennis, Brassica napus var. annua, Brassica oleracea var. capitata, Brassica oleracea var. italica) bei grybo surinkto iš skirtingų augalų rūšių augimo specifiką in vitro sąlygomis. / The master work was aimed to identify the occurrence and distribution of Leptosphaeria maculans and Leptosphaeria biglobosa species on the plants of various Brassica species (Brassica napus var. biennis, Brassica napus var. annua, Brassica oleracea var. capitata, Brassica oleracea var. italica) determine growth specificity of fungi on agar media, collected from different plant species, in in vitro conditions.

Leptosphaeria maculans, agent de la nécrose du collet des crucifères, est un agent pathogène majeur du colza (Brassica napus). La lutte génétique est aujourd’hui le procédé le plus utilisé afin de protéger les cultures des attaques de ce champignon. Cette méthode se base principalement sur l’utilisation de cultivars possédant des gènes de résistance spécifique (Rlm) qui permettent le déclenchement des réactions de défense de la plante parla reconnaissance directe ou indirecte des produits des gènes d’avirulence correspondants (AvrLm) présents dans la population pathogène. Plusieurs de ces résistances ont déjà été massivement déployées en France et dans le monde, connaissant dans un premier temps un fort succès commercial grâce à la protection fournie, suivie d’une perte d’efficacité très rapide. Avant cette thèse, le nombre d’études au champ des processus impliqués dans le contournement d’un gène de résistance était très limité, en particulier chez les champignons. L’objectif de cette thèse était d'étudier l’évolution moléculaire du gène d’avirulence AvrLm4-7sous pression de sélection, en profitant de son clonage et de la commercialisation récente de cultivars Rlm7, afin d’obtenir une étude précoce et détaillée des mécanismes moléculaires à l’origine du contournement d’une résistance spécifique. Le gène AvrLm4-7 présente l’originalité de coder pour une protéine responsable d’une double spécificité d’interaction vis-à-vis des gènes Rlm4 et Rlm7. Dans un premier temps, j’ai pu valider par mutagenèse dirigée le rôle primordial de l’acide aminé 120 dont la mutation affecte la reconnaissance d’AvrLm4 par Rlm4 sans toutefois altérer la reconnaissance d’AvrLm7 par Rlm7.Le contournement de la résistance Rlm7 a été ensuite analysé à l’aide d’une importante collection de souches prélevée sur deux sites expérimentaux indépendants (Grignon ; Versailles) sur une période de trois ans. Sur le premier site était cultivée une variété Rlm7 en monoculture avec un travail du sol simplifié tandis que sur le second site, le mode de culture incluait rotation culturale et enfouissement par labour des résidus de cultures. Il a ensuite été montré que, au contraire de la reconnaissance AvrLm4/Rlm4, un grand nombre d’évènements de mutation peuvent être à l’origine de la virulence d’une souche vis-à-vis de Rlm7. L’analyse moléculaire des souches virulentes et avirulentes de cette collection a ainsi permis de répertorier sept catégories d’évènements de mutation. La grande majorité des cas concerne la délétion d’AvrLm4-7 mais des mutations dues au RIP et plusieurs autres évènements de mutation provoquant l’introduction prématurée de codons stop dans la séquence codante du gène sont aussi observés. La majorité de ces évènements de mutation sont liés à la reproduction sexuée du champignon et ont lieu au sein même de la parcelle d’étude. Le phénotypage de cette collection a par ailleurs révélé un fort contraste entre les deux sites expérimentaux, démontrant ainsi l’importance des pratiques culturales dans le maintien de l’efficacité de la résistance Rlm7 dans le temps. En effet, après trois années de culture de cultivars Rlm7, la fréquence des souches virulentes a7 dans les populations du site de Versailles reste inférieure à 1 % contre environ 30 % sur le site de Grignon. Finalement, le phénotypage de la collection de souches a également montré que le contournement de Rlm7 s’accompagnait dans plus de 98% des souches de la résurgence de l’avirulence AvrLm3. Par l’étude de cette collection et par croisements génétiques, j’ai pu montrer que AvrLm3 n’était pas un nouvel allèle d’avrLm4-7 mais un second gène situé en région télomérique à 19.3 cM d’AvrLm4-7. J’ai également démontré une interaction fonctionnelle antagoniste entre AvrLm4-7 et AvrLm3 qui empêche la reconnaissance Rlm3 /AvrLm3 en présence d’AvrLm4-7 et explique la restauration de l’avirulence AvrLm3 lors de la perte de l’avirulence AvrLm7.Par une association originale de biologie moléculaire, de génétique des populations et d’agronomie, j’ai ainsi pu apporter une nouvelle illustration à la course aux armements entre un agent pathogène et sa plante hôte, les gènes AvrLm3 et AvrLm4-7 utilisant deux stratégies distinctes afin d’échapper à la reconnaissance de leurs gènes de résistance spécifiques. / Leptosphaeria maculans is a filamentous ascomycete causing stem canker of oilseed rape (Brassica napus). This disease is often controlled by the use of B. napus cultivars harbouring major resistance genes (Rlm). Direct or indirect recognition of the corresponding avirulence protein (AvrLm) in the pathogen triggers plant defence reactions. Several resistances have been massively deployed in France and worldwide, they initially showed commercial success due to the protection provided and in a second time, a very fast decrease of efficiency (resistance breakdown).Prior to this thesis, field studies of resistance gene breakdown mechanisms were rare, especially for fungi. The purpose of this PhD thesis was to study the molecular evolution of the avirulence gene AvrLm4-7 under selection pressure, by exploiting our knowledge of the gene, and the recent release of Rlm7 cultivars, to obtain an early and detailed study of the molecular mechanisms involved in a resistance gene breakdown. AvrLm4-7 induces resistance responses in plant harbouring either Rlm4 or Rlm7 and I validated by targeted point mutagenesis the central role of the amino acid 120 in the avrLm4-7-Rlm4 interaction. Its mutation prevents AvrLm4-7 recognition by Rlm4 without affecting avrLm4-7-Rlm7 recognition.Loss of avirulence towards Rlm7 was then studied by the analysis of an important isolate collection originating from two independent French experimental fields (Grignon; Versailles) over three years. In the first field was cropped Rlm7 cultivars in monoculture with low tillage agronomical practices whereas crop rotation and ploughing were done in the second field. In contrast to AvrLm4-Rlm4 evolution, a great number of mutations were found to explain the “gain” of virulence towards Rlm7. Seven mutational event categories were found. The great majority of these categories involve AvrLm4-7 deletion but mutation due to RIP and several other mutational events causing premature apparition of stop codons in the coding sequence of the gene were observed too. The majority of these events are linked to the sexual reproduction of the fungus and occurs in the experimental field.In addition, our work showed the importance of the cultural practices in preserving Rlm7 efficacy. Indeed, after three years using Rlm7 cultivars, a7 frequency was below 1% whereas representing around 30% of the isolates observed in Grignon.Finally, phenotyping of the isolate collection also showed the resurgence of an A3 phenotype linked with the loss of AvrLm7 avirulence in more than 98% of the isolates. Genetic analysis and collection phenotyping showed that AvrLm3 is not a new AvrLm4-7 allele but a distinct gene located in a telomeric region at 19.3 cM of AvrLm4-7. I also demonstrated that an antagonistic interaction between AvrLm4-7 and AvrLm3 exists: the presence of Avrlm4-7 prevents Rlm3 to detect AvrLm3 and explains the surge of the AvrLm3 avirulence along with the loss of the AvrLm7 avirulence.By an original association of molecular biology, population genetic and agronomy, this work provided a new illustration of the plant-pathogen arms race, AvrLm3 and AvrLm4-7 using two different strategies to escape their respective resistance genes.