Leptosphaeria maculans est un Dothideomycète phytopathogène capable d’alterner des modes de vie saprophyte, hemibiotrophe endophyte et nécrotrophe durant son cycle infectieux sur le colza. Afin de comprendre cette plasticité infectieuse, une mutagenèse aléatoire à grande échelle par ATMT a permis de générer une collection de 5000 transformants. L’objectif principal de cette thèse était d’exploiter cette collection en prenant avantage de la disponibilité d’outils de génomique, pour, d’une part, comprendre les mécanismes d’intégration de l’ADN-T dans le génome, et d’autre part, identifier des déterminants du pouvoir pathogène ciblés par l’ADN-T dans des mutants affectés dans leur capacité infectieuse. Une analyse systématique de 318 pieds d’insertion a été réalisée dans le but de d’évaluer les caractéristiques de l’insertion de l’ADN-T. Ce dernier est fréquemment inséré dans les régions actives riches en gènes, et favorise des gènes impliqués dans des processus biologiques indicatifs d’une conidie germante. Un biais marqué des insertions en faveur des régions régulatrices est observé ainsi qu’une corrélation entre la densité des insertions et le skew CG près du site d’initiation de la transcription. Ces observations sont cohérentes avec le modèle de ciblage intranucléaire de l’ADN-T. Enfin, l’existence de micro-homologies entre le site de pré-insertion et la bordure gauche de l’ADN-T indique une intégration par voie de recombinaison homologue (HR) et/ou microhomologue (MMEJ). Une approche multicritère a été utilisée pour caractériser cette collection. Un test d’inoculation a permis d’identifier 166 mutants altérés dans leur pouvoir pathogène. La validation génétique de la co-ségrégation entre le phénotype altéré et la présence de l’ADN-T indique que 44% des mutants montrant un déterminisme monogénique de l’altération sont effectivement étiquetés. Parmi les mutants altérés, 35 ont été analysé pour : (i) le phénotype de croissance en conditions usuelles de culture et en réponse aux stress oxydatif, UV et nutritif, (ii) le lien entre altération de la germination et pouvoir pathogène. Les gènes affectés par l’intégration de l’ADN-T, ont été identifié et analysé dans la souche sauvage à l’aide de données de transcriptomique. Ces cribles ont permis de décomposer le phénotype d’altération in planta en plusieurs phénotypes in vitro. Le plus fréquemment, les mutants ne sont pas altérés dans leur in vitro croissance, mais la plupart sont sensibles aux ROS. Les analyses d’expression au cours de l’infection indiquent que les gènes codant pour des effecteurs et ceux impliqués dans la détoxification des ROS, ont des dynamiques d’expression inverses et bi-phasiques, en lien avec le style de vie hemibiotrophe de L. maculans. Les 42 gènes ciblés par l’ADN-T dans ces mutants ont été identifiés et leur fonction putative disséquée par bioinformatique et transcriptomique. Au final, nous avons identifié six mutants d’intérêt pour une caractérisation fonctionnelle. Deux de ceux-ci deux ont atteint un niveau de caractérisation suffisant pour l’émission d’une hypothèse de travail. Dans le mutant µ1165, l’ADN-T cible un gène codant pour une protéine ribosomale S17 (LmRPS17), dont la régulation dépendrait de la voie de signalisation du complex TORC1. Nos résultats préliminaires suggèrent, d’une part, que TORC1 est une cible potentielle de LmRPS17 et, d’autre part, que la phase biotrophe de l’infection chez L. maculans est probablement régulée par TORC1 via l’enzyme de détoxication des ROS SOD2. Dans le mutant µ444, l’ADN-T cible un gène codant pour un élément rétroviral putatif LmHYP1, largement conservé parmi les ascomycètes. Nos résultats suggèrent que LmHYP1 interviendrait dans la régulation de gènes impliqués dans le pouvoir pathogène, via la production de petits ARN interférents issus hypothétiquement du clivage de son ARN messager par la machinerie de défense anti-rétrovirale. La validation de ces deux hypothèses est en cours au laboratoire. / The Dothideomycete phytopathogen Leptosphaeria maculans is capable to alternate saprophytic, hemibiotrophic, endophytic and necrotrophic life styles during a single infectious cycle on its host plant, Brassica napus. However, little is known about the determinants of such plasticity. As part of a large-scale insertional mutagenesis project aiming at the discovery of pathogenicity factors a collection 5000 transformants has been generated by ATMT. The main objective of my PhD was to take advantage of “omics” to extract biological value from L. maculans mutants collection for a better understanding of T-DNA integration features and further identification of pathogenesis determinants in this fungus. A systematic analysis of 318 T-DNA tags was performed in a large collection of transformants in order to evaluate the features of T-DNA integration in its particular TE-rich compartmentalized genome. The T-DNA integration was mainly targeted to gene-rich, transcriptionally active regions, and favored biological processes that are consistent with the physiological status of a germinating conidia. In addition, T-DNA integration was strongly biased towards regulatory regions, and mainly promoters. Consistently with the T-DNA intranuclear targeting model, the density of T-DNA insertion correlated with CG skew near the transcription initiation site. The existence of microhomologies between promoter sequences and the T-DNA LB flanking sequence was also consistent with T-DNA integration to host DNA mediated by homologous recombination and/or the microhomology-mediated end joining pathways. Based on this data, a multi-criteria approach was used to draw the more possible information from this collection by identifying all 166 mutants reliably affected in pathogenicity, and expanding the genetic analysis. Considering single-gene segregation of the pathogenicity phenotype, our data indicate a 44% ratio of actual tagging. In parallel, for a subset of 35 isolates of the collection, we (i) described growth patterns in regular culture conditions or in response to oxidative, UV or starvation stresses, (ii) evaluated the link between altered germination and pathogenicity, (iii) identified and annotated the genes putatively affected by the T-DNA integration, and (iv) analyzed kinetics of expression of these genes in the WT isolate using available microarrays. Our results showed that pathogenicity alteration phenotype could be broken down into a pattern of phenotypes in vitro including growth, germination defect and susceptibilities to oxidative burst, starvation and UV stresses. Our results showed that most of these mutants were not altered in axenic growth but showed enhanced sensitivity to reactive oxygen species (ROS). Furthermore, our results showed that effectors and ROS scavengers have inverted dynamics during plant infection, consistently with the biphasic hemibiotrophic growth of L. maculans. Also, 42 genes targeted by the T-DNA in these mutants were recovered and dissected. This catalogue allowed us to identify a series of promising mutants for further functional studies. Based on this screening, six mutants were subjected to further analyses but only two reached sufficient advance for hypothesis building. In mutant µ1165, the T-DNA targeted a ribosomal protein S17 (LmRPS17), a downstream component of target of rapamycin complex 1 (TORC1) pathway. Our preliminary results suggested that TORC1 is a potential a target of LmRPS17. Also, biotrophic growth is probably tuned by TORC1 via Super oxide dismutase 2 (SOD2). In mutant µ444, the T-DNA targeted a retroviral-like element LmHyp1 widely conserved among ascomycetes. Our results suggest that LmHyp1 probably acts as a regulatory element during plant infection as its cleavage by the antiretroviral defences is hypothesized to generate siRNAs that silences distant genes. Work on these mutants is in progress.

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Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniv., 2006. / Härtill 5 uppsatser.

Leptosphaeria maculans and L. biglobosa co-infect winter oilseed rape plants to cause phoma stem canker disease. The sexual spores of both species are produced in pseudothecia on infected winter oilseed rape stem debris after harvest and this is the most important source of inoculum for infection of newly-emerged plants in autumn. Field experiments investigated the effects of host resistance on proportions of pathogens Leptosphaeria maculans and L. biglobosa in most leaf and stem tissues during 2011/2012, 2012/2013 and 2013/2014 growing seasons and on the pseudothecial development on crop debris on nine winter oilseed rape cultivars; cvs Adriana (Rlm4 + quantitative resistance (QR)), Bilbao (Rlm4), Capitol (Rlm1), Drakkar (no R gene against L. maculans), DK Cabernet (Rlm1 + (QR), Es-Astrid (QR), Excel (Rlm7), Roxet (Rlm7) and NK Grandia (QR). Cultivars with a combination of R-gene resistance and QR [Adriana (Rlm4 + QR), DK Cabernet (Rlm1 + QR)] or cultivars with only QR [(Es-Astrid and NK Grandia)] had more numbers of L. maculans leaf spots than other cultivars in autumn but less stem canker damage. There was greater number of L. biglobosa leaf spots on leaves of cvs Roxet and Excel with resistance gene Rlm7 than those of other cultivars and later more L. biglobosa DNA was detected in their stems than in those of other cultivars. In all cultivars in the three growing seasons, there was a greater amount of L. biglobosa DNA than L. maculans DNA in basal stem canker and upper stem lesions. The cv. Drakkar (no R gene against L. maculans) was susceptible in all three growing seasons, with a great number of L. maculans and L. biglobosa leaf spots and severe stem cankers. There were four cultivars (Adriana, Bilbao, Drakkar and NK Grandia) selected for the study of pseudothecial development under natural conditions with different times of exposure and in controlled environment conditions (20oC, continuous wetness). The fastest development was on the susceptible cv. Drakkar (no R gene against L. maculans), followed by Bilbao (Rlm4), Adriana (Rlm4 + QR) and NK Grandia (QR) for stem base cankers and upper stem lesions in controlled conditions. Results for pseudothecial development on stems of the nine winter oilseed rape cultivars that were exposed in natural conditions at Bayfordbury support the controlled environment results, with pseudothecia on stems of cultivars with a combination R-gene and QR consistently maturing later than those on other cultivars, regardless of the weather conditions in three growing seasons. Ascospores produced in pseudothecia are the primary inoculum that initiate phoma stem canker epidemics in autumn. Ascospore release was later in autumn 2011 than in autumn/winter 2012/2013 or 2013/2014 because of dry weather. The pattern of ascospore release had a peak, or maximum in autumn/winter 2011/2012 (4958 spores/m-3 on 22 Jan 2012) and several maxima in autumn/winter 2012/2013 (1307 spores/m-3 on 5 Nov 2012, 1291 spores/m-3 on 15 Nov 2012, 1306 spores/m-3 on 25 Dec 2012) and 2013/2014 (4575 spores/m-3 on 27 Oct 2013, 4619 spores/m-3 on 3 Nov 2013, 3674 spores/m-3 on 9 Nov 2013, 3521 spores/m-3 on 12 Dec 2013). Results from the qPCR showed that ascospores of L. maculans were released earlier than ascospores of L. biglobosa at Bayfordbury in the 2013/2014 growing season. There were differences in phenotype of isolates amongst ninety-five isolates of L. maculans and forty-eight isolates of L. biglobosa obtained from different sources (phoma leaf spots, upper stem lesions or basal stem cankers) on different cultivars. Cotyledon tests showed that the resistance genes Rlm4, Rlm5, Rlm6 and Rlm7 are still effective in England. Most isolates from phoma leaf spots carried avirulent AvrLm4 (39 isolates; 97.5%), AvrLm5 (39 isolates; 97.5%) and AvrLm6 alleles (36 isolates; 90%) and all 40 isolates carried the avirulent allele AvrLm7 (100%). Fewer isolates from basal stem cankers carried avirulent AvrLm4 (4 isolates, 16.7%) or AvrLm6 alleles (16.7%) but all 24 isolates carried the avirulent AvrLm7 (100%). Fewer isolates from upper stem lesions carried the avirulent AvrLm4 allele (5 isolates; 16.1%), but 15 isolates carried avirulent AvrLm5 (48.4%), 21 isolates carried AvrLm6 (67.7%) and all 31 isolates carried AvrLm7 (100%). By contrast, all isolates were virulent against Rlm1, Rlm2, Rlm3 and Rlm9. This knowledge, together with knowledge about R genes present in current winter oilseed rape cultivars, should be useful to provide recommendations on cultivar selection to growers based on regional frequencies of avirulent alleles of Avr allele genes in the L. maculans populations (races) and improved understanding of the race structure of L. maculans. There is a need to further investigate any R genes that operate against L. biglobosa (possibly from wild brassicas) and to study if any R genes or QR can provide resistance against both L. maculans and L. biglobosa.

Blackleg, caused by Leptosphaeria maculans, inflicts greatest canola yield losses when plants are infected before reaching the six-leaf growth stage. Studies were conducted to model pseudothecia maturation and ascospore dispersal to help growers make timely foliar fungicide applications. Pseudothecia maturation occurred mostly during the second half of June or in July in 2017 and 2018 in North Dakota and ascospores concentrations peaked during mid to late June in both years. A logistic regression model developed using temperature and relative humidity predicted the maturation of pseudothecia and ascospore dispersal with approximately 74% and 70% accuracy respectively. In addition, trials to evaluate the efficacy of five seed treatment fungicides were conducted under greenhouse and field conditions. All treatments reduced (P = 0.05) disease severity on seedlings in greenhouse trials, but not in field trials. Seed treatments, while a valuable tool, should not be used as the only means to manage blackleg.

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Une méthode de lutte efficace contre le phoma du colza est l'utilisation de variétés résistantes mais l'efficacité des résistances spécifiques est peu durable. D'autres méthodes de lutte peuvent être mobilisées : lutte chimique et contrôle cultural (adaptation du travail du sol, de la date et de la densité de semis, ou de l'azote organique). La combinaison spatiale et temporelle des méthodes de lutte génétique, culturale et chimique dans le paysage permet de mieux contrôler la maladie et de préserver l'efficacité des résistances spécifiques et la rentabilité économique, tout en répondant aux exigences environnementales et toxicologiques de la production intégrée. Etant données les échelles d'espace et de temps considérées et la multiplicité des techniques, il est difficile de tester expérimentalement ces stratégies. SIPPOM-WOSR a donc été développé, a Simulator for Integrated Pathogen Population Management, for Winter OilSeed Rape. Il est composé de 5 modules simulant la production d'inoculum, la dispersion des ascospores, la croissance du peuplement végétal et le rendement accessible, l'évolution de la structure génétique des populations pathogènes, et l'infection. Les sorties sont l'indice de sévérité de la maladie et les pertes de rendement associées, le rendement, la marge brute, le coût énergétique des pratiques et l'indice de fréquence de traitement, ainsi que la structure des populations pathogènes, sous l'effet de forces évolutives. Des expérimentations et analyses de données ont été réalisées pour acquérir des connaissances et compléter des formalismes, par exemple sur la récurrence de l'épidémie ou sur l'effet de la résistance quantitative sur la sévérité de la maladie. Une analyse de sensibilité a été réalisée pour étudier la sensibilité des différents modules aux variations des paramètres. Des exemples de simulation montrent l'intérêt de SIPPOM pour tester des stratégies de gestion intégrée et durable d'une maladie.

Leptosphaeria maculans, agent de la nécrose du collet des crucifères, est un agent pathogène majeur du colza (Brassica napus). La lutte génétique est aujourd'hui le procédé le plus utilisé afin de protéger les cultures des attaques de ce champignon. Cette méthode se base principalement sur l'utilisation de cultivars possédant des gènes de résistance spécifique (Rlm) qui permettent le déclenchement des réactions de défense de la plante parla reconnaissance directe ou indirecte des produits des gènes d'avirulence correspondants (AvrLm) présents dans la population pathogène. Plusieurs de ces résistances ont déjà été massivement déployées en France et dans le monde, connaissant dans un premier temps un fort succès commercial grâce à la protection fournie, suivie d'une perte d'efficacité très rapide. Avant cette thèse, le nombre d'études au champ des processus impliqués dans le contournement d'un gène de résistance était très limité, en particulier chez les champignons. L'objectif de cette thèse était d'étudier l'évolution moléculaire du gène d'avirulence AvrLm4-7sous pression de sélection, en profitant de son clonage et de la commercialisation récente de cultivars Rlm7, afin d'obtenir une étude précoce et détaillée des mécanismes moléculaires à l'origine du contournement d'une résistance spécifique. Le gène AvrLm4-7 présente l'originalité de coder pour une protéine responsable d'une double spécificité d'interaction vis-à-vis des gènes Rlm4 et Rlm7. Dans un premier temps, j'ai pu valider par mutagenèse dirigée le rôle primordial de l'acide aminé 120 dont la mutation affecte la reconnaissance d'AvrLm4 par Rlm4 sans toutefois altérer la reconnaissance d'AvrLm7 par Rlm7.Le contournement de la résistance Rlm7 a été ensuite analysé à l'aide d'une importante collection de souches prélevée sur deux sites expérimentaux indépendants (Grignon ; Versailles) sur une période de trois ans. Sur le premier site était cultivée une variété Rlm7 en monoculture avec un travail du sol simplifié tandis que sur le second site, le mode de culture incluait rotation culturale et enfouissement par labour des résidus de cultures. Il a ensuite été montré que, au contraire de la reconnaissance AvrLm4/Rlm4, un grand nombre d'évènements de mutation peuvent être à l'origine de la virulence d'une souche vis-à-vis de Rlm7. L'analyse moléculaire des souches virulentes et avirulentes de cette collection a ainsi permis de répertorier sept catégories d'évènements de mutation. La grande majorité des cas concerne la délétion d'AvrLm4-7 mais des mutations dues au RIP et plusieurs autres évènements de mutation provoquant l'introduction prématurée de codons stop dans la séquence codante du gène sont aussi observés. La majorité de ces évènements de mutation sont liés à la reproduction sexuée du champignon et ont lieu au sein même de la parcelle d'étude. Le phénotypage de cette collection a par ailleurs révélé un fort contraste entre les deux sites expérimentaux, démontrant ainsi l'importance des pratiques culturales dans le maintien de l'efficacité de la résistance Rlm7 dans le temps. En effet, après trois années de culture de cultivars Rlm7, la fréquence des souches virulentes a7 dans les populations du site de Versailles reste inférieure à 1 % contre environ 30 % sur le site de Grignon. Finalement, le phénotypage de la collection de souches a également montré que le contournement de Rlm7 s'accompagnait dans plus de 98% des souches de la résurgence de l'avirulence AvrLm3. Par l'étude de cette collection et par croisements génétiques, j'ai pu montrer que AvrLm3 n'était pas un nouvel allèle d'avrLm4-7 mais un second gène situé en région télomérique à 19.3 cM d'AvrLm4-7. J'ai également démontré une interaction fonctionnelle antagoniste entre AvrLm4-7 et AvrLm3 qui empêche la reconnaissance Rlm3 /AvrLm3 en présence d'AvrLm4-7 et explique la restauration de l'avirulence AvrLm3 lors de la perte de l'avirulence AvrLm7.Par une association originale de biologie moléculaire, de génétique des populations et d'agronomie, j'ai ainsi pu apporter une nouvelle illustration à la course aux armements entre un agent pathogène et sa plante hôte, les gènes AvrLm3 et AvrLm4-7 utilisant deux stratégies distinctes afin d'échapper à la reconnaissance de leurs gènes de résistance spécifiques.

La maîtrise des épidémies fongiques par l'utilisation de résistances génétiques occupe une place centrale dans mon parcours de recherches. En tant qu'épidémiologiste, j'étudie la biologie et la génétique des populations du champignon responsable du phoma (Leptosphaeria maculans) en relation avec la stabilité de l'efficacité des résistances du colza dans les agro-écosystèmes. Comme trame à mon rapport d'HDR, je propose de revenir sur ce parcours en montrant en quoi l'utilisation du concept d'"épidémie" verrouillait notre conception d'épidémiologistes en focalisant les travaux sur l'échelle de la parcelle pendant la saison culturale ; puis comment mes travaux sur les populations naturelles (d'escargots) m'ont permis d'enrichir ma vision d'agronome. Ces connaissances m'ont permis de travailler à renforcer la prise en compte conjointe de l'épidémiologie et de la génétique des populations en étudiant la transmission de descendants entre saisons culturales. J'ai en particulier produit des connaissances sur la production d'inoculum à l'issue de la saison culturale et sur la dissémination entre parcelles. En parallèle à la production de connaissances, mon investissement théorique m'a permis de proposer un cadre dans lequel l'épidémiologie - à condition de la penser en termes d'"épidémies cycliques" - peut permettre le dialogue entre génétique et agronomie, entre dynamique et évolution des populations. Ceci ouvre la perspective de travailler dans les agro-écosystèmes, sur la coévolution entre métapopulations pathogènes (les champignons) et métapopulations hôtes (les plantes), sous l'influence des actions humaines.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniversitet, 2008. / Härtill 4 uppsatser.