Les protéines STAT5A et B sont des facteurs de transcription jouant un rôle important dans l'hématopoïèse normale et leucémique. Ce sont en effet des effecteurs essentiels d’oncogènes à activité tyrosines kinases, tels que BCR-ABL ou JAK2V617F responsables de la genèse d’hémopathies malignes. Ces oncogènes régulent la production de ROS (Reactive Oxygen Species) via l’activation de différentes voies de signalisation impliquées dans la prolifération et la survie cellulaire. Dans ce travail de thèse, nous montrons que l’activation oncogénique de STAT5, induite par BCR-ABL, favorise un stress oxydatif dans les cellules de Leucémie Myéloïde chronique (LMC), via la répression de l’expression des enzymes anti-oxydantes catalase et glutaredoxine-1 et la modulation potentielle de l’activité des NADPH oxydases. Nous montrons pour la première fois que l’effet pro-oxydant de STAT5 est régulé par la phosphorylation sur tyrosine de ces protéines et que les formes non phosphorylées et transcriptionnellement inactives exercent un effet anti-oxydant et protecteur contre le stress oxydatif, via des mécanismes non canoniques. Cette dualité de fonction est illustrée dans un modèle de co-culture de cellules de LMC et de cellules stromales médullaires, que nous avons développé dans le laboratoire afin de mimer le microenvironnement médullaire des cellules leucémiques. Dans ce modèle, nous montrons que le contact avec les cellules stromales permet d’inactiver STAT5 dans les cellules leucémiques et donc de promouvoir son activité anti-oxydante. Nous observons également un arrêt de prolifération et une entrée en phase G0 du cycle cellulaire des cellules leucémiques au contact des cellules stromales, ainsi qu’une résistance accrue de ces cellules à l’Imatinib, un inhibiteur de BCR-ABL. Ces données suggèrent un lien important entre activité anti-oxydante de STAT5, quiescence et chimio résistance des cellules leucémiques. / The Signal Transducer and Activator of Transcription factors 5A and B are two closely related STAT family members that play a major role in normal and leukemic hematopoiesis. STAT5 proteins are frequently activated in hematopoietic neoplasms and are targets of various tyrosine kinase oncogenes such as BCR-ABL and JAK2V617F. Both oncogenes were shown to stimulate the production of intracellular ROS (Reactive Oxygen Species) in leukemic cells and evidences for a cross talk between STAT5 and ROS metabolism have recently emerged. Herein, we demonstrate that sustained activation of STAT5 induced by BCR-ABL promotes ROS production in Chronic Myeloid Leukemia (CML) cells by repressing expression of two antioxidants, catalase and glutaredoxin1 and by possible functional interactions with NADPH oxidase complexes. We also provide compelling evidences that tyrosine phosphorylation regulate the pro-oxidant activity of STAT5 and that non phosphorylated STAT5 displays antioxidant properties and protection against oxidative stress via non-genomic effects. This dual function of STAT5 is also illustrated in an in vitro microenvironment model that we develop in our laboratory to analyze interactions between bone marrow stromal cells and CML cells. Using these coculture experiments, we show that STAT5 phosphorylation was reduced and its antioxidant activity enhanced in leukemic cells in contact with stromal cells. We also demonstrate in this model that leukemic cells stopped dividing, entered a quiescent G0 state and became resistant to Imatinib, a BCR-ABL kinase inhibitor. Collectively, these findings suggest an important link between antioxidant activity of STAT5, quiescence and resistance to chemotherapeutic agents in leukemic cells.

Le facteur de transcription Ikaros est un régulateur essentiel de la lymphopoïèse. Ikaros est nécessaire à la différenciation des lymphocytes B et joue aussi un rôle important dans la suppression des LAL-T. Contrairement aux souris mutantes nulles pour Ikaros, les souris mutantes hypomorphes IkL/L développent des lymphocytes B matures après la naissance. Avec l’âge, toutes les souris IkL/L développent des leucémies T Notch dépendantes avec des mutations similaires à celles trouvées chez les patients atteints de LAL-T. La souris IkL/L est donc un excellent modèle pour étudier l’activation des cellules B matures et la pathogenèsedes LAL-T. Nous avons montré que la délétion spécifique du promoteur et de l’exon 1 de Notch1 dans les cellules T conduit à l’activation de promoteurs cryptiques dans la région 3’ du gène, qui génèrent des transcrits codant pour des protéines Notch1 constitutivement actives qui accélèrent la leucémogenèse dans la souris IkL/L. De plus, nous mettrons en évidence l’existence de cellules initiatrices de leucémie dans les tumeurs IkL/L puisque nous avons trouvé que des cellules ayant la capacité de s’auto-renouveler représentent 1 sur 500. Enfin, nous avons montré que les cellules B IkL/L ont une activation excessive d’ERK et dep38 après la stimulation du BCR, ce qui résulte en une hyper-prolifération et une production d’autoanticorps liés au lupus systémique érythémateux. Nos résultats suggèrent qu’Ikaros est un régulateur négatif de l’activation des lymphocytes B. / The Ikaros transcription factor is a critical regulator of lymphopoeisis. Ikaros is needed for the differentiation of B cell and plays an important role in tumor suppression in T cells. Contrary to the other Ikaros targeted mutant mice, the IkL/L mouse develops mature B cells after birth. With age, it develops Notch dependent tumors with similar mutations as thosefound in human T cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). Thus, the IkL/L mouse is an excellent model to study mature B cell activation and T-ALL tumor development. Here, we have shown that the deletion of the promoter and exon1 of the Notch1 gene in IkL/L T cells activates a cryptic promoter in the 3’ region which leads to the production of truncated, constitutively activated Notch1 proteins that accelerate tumorigenesis in the IkL/L mice. Moreover, we give evidence for the existence of LICs in the IkL/L tumors as we have found a specific subpopulation of cells with a frequency of 1 in 500 which show self-renewal capacity. In addition, we demonstrated that some tumor cells have the ability to efflux the Hoechst dye and that this side population is enriched in quiescent cells. Finally, we elucidate that IkL/L B cells display an enhanced activation of ERK and p38 after BCR stimulation that results in hyper-proliferation and the production of autoantibodies relatedto systemic lupus erythematosus (SLE). Our results suggest that Ikaros is a negative regulator of B cell activation.

Des études menées sur des modèles animaux ont montré que le métabolisme oxydatif joue un rôle important dans l’hématopoïèse normale et leucémique via le contrôle de l’activation de p38 MAPK. Nous avons établi que les cellules CD34+CD38- médullaires humaines ont un très faible niveau d’H2O2 et une forte expression de GPX3, le gène codant l’enzyme antioxydante glutathion peroxydase-3 (GPx-3), un déterminant majeur du potentiel souche des cellules hématopoïétiques. De plus, la niche leucémique étant essentielle pour l’auto-renouvellement des cellules souches leucémiques, nous avons étudié, chez l’homme, le rôle des cellules souches/stromales mésenchymateuses (CSM) médullaires primaires, dans la régulation de l’axe GPx-3/H2O2/p38 MAPK des cellules leucémiques et avons montré que les CSM contrôlent cet axe dans les cellules leucémiques humaines KG1a en régulant l’expression de GPx-3. Ces résultats ont bénéficié du développement de deux méthodes originales, l’une quantifiant l’expression des gènes antioxydants par RT-qPCR (« antioxydogramme », brevet) et l’autre permettant une analyse en haute résolution du cycle cellulaire par cytométrie en flux. / Studies in animal models have demonstrated that oxidative metabolism plays an important role in normal and leukemic hematopoiesis by controlling the p38 MAPK activation. We have established that the human bone marrow CD34+CD38- cells have a very low H2O2 level and express GPX3, the gene encoding for the antioxidative enzyme gluthathione peroxidase-3 (GPx-3) which is a major determinant of the stem cell potential of hematopoietic cells. As the niche is essential for the leukemic stem cell self-renewal, we have studied the role of human primary bone marrow mesenchymal stromal/stem cells (MSCs) in regulating the axis GPx-3/H2O2/p38 MAPK in human leukemic cells and we have shown that MSCs control this axis in human KG1a leukemic cells by regulating the expression of GPx-3. These results benefited from the development of two original methods, the first one quantifying the expression of by RT-qPCR of antioxidative genes (“antioxidogram”, patent) and the second one for high resolution analysis of the cell cycle by flow cytometry.

Les mastocytes humains (MC) sont des cellules tissulaires d’origine hématopoïétique impliquées dans une série de processus physiologiques et pathologiques. Les recherches sur les MC ont été entravées pendant longtemps en raison de l'accès limité à des populations pures de ces cellules. Nous avons établi une nouvelle lignée humaine de MC, ROSAKIT WT, dont les propriétés sont similaires à celles des MC primaires, constituant un nouvel outil pour la recherche sur les fonctions des MC humains, et permettant le criblage à haut débit de thérapies anti-allergiques. Les MC sont impliqués dans les mastocytoses, où ils s’accumulent pathologiquement dans divers tissus. Bien que la plupart des cas de mastocytoses systémiques (SM) sont chroniques et indolents, les patients atteints de SM avancée (SM agressive; ASM, et leucémie à mastocytes; MCL) ont un mauvais pronostic, car la plupart des thérapies disponibles ne sont pas curatives. Afin de mieux comprendre la physiopathologie des formes avancées de SM et pour trouver de nouvelles approches pour le traitement, nous avons profité de la disponibilité des cellules ROSAKIT WT pour établir un nouveau sous-clone, la lignée cellulaire ROSAKIT D816V, représentant un équivalent des cellules néoplasiques s’accumulant dans les SM. L'utilisation de cette lignée et de cellules des patients nous a permis d’identifier BRD4 comme une nouvelle cible thérapeutique dans les ASM et les MCL. Nous avons démontré que les MC néoplasiques de patients avec ASM expriment des quantités substantielles de BRD4. Fait intéressant, nous avons aussi démontré que les lignées cellulaires HMC-1 et ROSAKIT D816V expriment aussi BRD4, et que leur prolifération est inhibée par un shRNA BRD4-spécifique. En outre, nous avons montré que le médicament JQ1, inhibiteur de BRD4, induit une inhibition de la croissance et une apoptose dose-dépendante dans les mêmes cellules. De plus, nous avons démontré que JQ1 supprime également la prolifération des MC néoplasiques primaires de patients atteints d’ASM ou de MCL à de faibles concentrations. Enfin, nous avons observé que la midostaurine (PKC412) et l’acide rétinoïque tout-trans (ATRA) coopèrent avec JQ1 pour induire des effets inhibiteurs synergiques sur l’inhibition de la survie des mêmes cellules. En conclusion, nos résultats représentent une avancée sur ce qui était précédemment connu sur l’implication de BRD4 dans les mastocytoses et nous ont permis d'identifier cette protéine comme cible thérapeutique prometteuse dans le traitement des formes avancées de SM. / Human mast cells (MCs) are hematopoietic stem cell (HSC)-derived, tissue-resident, multifaceted cells involved in a myriad of physiological and pathological processes. Researches on MCs have been hampered for a long time, due to limited access to pure populations of these cells. We have established a new human MC line, ROSAKIT WT, whose properties are similar to those of primary HSC-derived MCs, providing a novel tool for research on human MC functions, and enabling the high-throughput screening of anti-allergic therapies. Among others, MCs are involved in a group of diseases termed mastocytosis, where they accumulate pathologically in various tissues. Although most cases of systemic mastocytosis (SM) are chronic with an indolent course, patients with advanced SM (aggressive SM; ASM, and mast cell leukemia; MCL) have a reduced life expectancy and a poor prognosis, since most of the therapies already available are not curative. In order to better understand the pathophysiology of advanced SM and to. find new approaches for treatment, we took advantage of the availability of the ROSAKIT WT cells to establish a new subclone, the ROSAKIT D816V cell line, representing a paradigm of the neoplastic cells accumulating in SMUsing these malignant cell line and patients’ cells, we identified the epigenetic reader bromodomain-containing protein-4 (BRD4) as a novel drug target in ASM and MCL. Indeed, we demonstrated that neoplastic MCs from ASM patients expressed substantial amounts of BRD4. Interestingly, we then demonstrated that HMC-1 and ROSAKIT D816V cell lines express BRD4, and that their proliferation is inhibited by a BRD4-specific shRNA. Moreover, we showed that the BRD4-targeting drug JQ1 induced a dose-dependent growth inhibition and apoptosis in the same cells. In addition, we demonstrated that JQ1 suppressed also the proliferation of primary neoplastic MCs of patients with ASM or MCL at low concentrations. Finally, we reported that midostaurin (PKC412) and all-trans retinoic acid (ATRA) cooperated with JQ1 in producing synergistic inhibitory effects on the survival of HMC-1 and ROSA cells. Together, our data represent a significant advance over what was previously known on the involvement of BRD4 in mastocytosis and identify this epigenetic reader bromodomain-containing protein as a promising drug target in advanced SM

La mitochondrie est restée longtemps cantonnée au rôle de centrale énergétique cellulaire. On sait désormais qu'elle est aussi la principale source d'espèces réactives oxygénées, impliquées dans le stress oxydant et la signalisation inter- cellulaire. Le dérèglement de l'activité mitochondriale est ainsi susceptible d'être la cause de l'apparition et de la progression de maladies associées au vieillissement, comme le cancer et les maladies neurodégénératives. Dans le cadre de la leucémie aiguë myéloïde, des études menées par l'équipe dirigée par Jean-Emmanuel Sarry du Centre de Recherche en Cancérologie de Toulouse, ont montré qu'il est possible de sensibiliser les cellules jusqu'alors résistantes à la chimiothérapie, en ciblant préalablement la fonction mitochondriale. C'est dans ce contexte que s'inscrit le sujet de cette de thèse, portant sur la conception et la réalisation de micro-capteurs électrochimiques dédiées à l'analyse du métabolisme mitochondrial, à l'échelle de la mitochondrie isolée. La fabrication des microsystèmes s'est déroulée dans la salle blanche du Laboratoire d'Analyse et d'Architecture des Systèmes de Toulouse, sous l'encadrement des chercheurs Jérôme Launay et Pierre Temple-Boyer, spécialisés dans la conception de capteurs pour la détection d'espèces en phase liquide. Finalement, un système complet assurant le couplage à la microscopie et à la gestion des fluides a été fabriqué, validé, et breveté. Les résultats obtenus nous permettent d'envisager l'analyse à l'échelle de la mitochondrie unique par une approche parallélisée, ce qui n'a encore jamais été réalisé. / The role of mitochondria have been restricted to oxidative phosphorylation for a long time. Now it is clear that they are also the main sources of reactive oxygen species, implied in oxidative stress and cell-to-cell signaling. Thus, mitochondrial malfunction is potentially the cause of the appearance and the progression of diseases linked to ageing like cancers and neurodegenerative troubles. In the frame of acute myeloid leukemia, studies governed by Jean-Emmanuel Sarry of the Cancer Research Center of Toulouse, showed that it is possible to improve the efficacy of current chemotherapies by targeting mitochondria's function. In this context, the objective of the thesis presented here consist in the design and the manufacturing of electrochemical micro-sensors, dedicated to the analysis of the metabolic activity of isolated mitochondria. The manufacturing occurred in the clean room facilities of the Laboratory for Analysis and Architecture of Systems of Toulouse under the supervision of Jérôme Launay and Pierre Temple-Boyer, researchers specialized in the development of solutions aiming the detection of species diluted in solution. Finally, a complete system ensuring the coupling with microscopy and fluidics have been realized, validated, and patented. The results obtained allow us to consider the analysis at the scale of the single mitochondrion with a parallelized approach, thing that have never been made.

Les transporteurs ABC constituent une famille de protéines membranaires qui assurent une fonction de transport, au travers des membranes cellulaires. Plusieurs ABC sont impliqués dans des physiopathologies humaines ou induisent des phénotypes de résistance. Ce manuscrit présente l'étude de l'expression de l'ensemble des ABC, par PCR quantitative, dans différents organes, ou en réponse à un traitement chez l'Homme et la souris. Nous avons étudié l'effet d'un traitement colchicine sur des lignées cellulaires humaines et des souris. Nous avons montré que ce traitement permettait d'induire l'expression de transporteurs ABC. Nous avons établi la première cartographie de l'expression des transporteurs ABC au cours du développement hépatique. Certains transporteurs absents du foie fœtal s'expriment après la naissance et jouent probablement un rôle dans la physiopathologie du foie adulte. A l'inverse l'expression de certains transporteurs s'éteint après la naissance, suggérant un rôle dans l'hématopoïèse. Nous avons mesuré l'expression des transporteurs ABC sur des biopsies de patients atteints de leucémies aiguës en corrélation avec leur sensibilité aux chimiothérapies. De façon intéressante, nous avons montré que des transporteurs jusqu'à présent non décrits dans la résistance pourraient contribuer à un mauvais pronostic. Enfin, nous avons étudié le transcritpome ABC dans les cellules souches humaines à différents stades de différenciation. Certains transporteurs pour lesquels nous observons des variations d'expression pourraient caractériser un état de différenciation et être impliqués dans l'auto-renouvellement ou la différentiation des cellules souches.

La leucémie myéloïde aiguë (LMA) est une maladie clonale hétérogène caractérisée par une prolifération immature des cellules myéloïdes et une défaillance de la moelle osseuse. Malgré les avancées rapides dans le domaine de la LMA, notamment concernant de nouvelles cibles thérapeutiques et une meilleure compréhension des mécanismes biologiques, le traitement clinique de la LMA reste inchangé et dépend du caryotype des patients. Lors des trois dernières décennies, la plupart des patients ont fini par récidiver et décéder de la maladie ; il n’y a encore aucun schéma thérapeutique standard qui améliore le pronostic et le traitement de la LMA.Les imidazoquinoxalines sont des dérivés de l’imiquimod qui présentent un effet immunomodulateur indirect et une activité anti-tumorale directe contre le mélanome et le lymphome à cellules T, provoquant l’inhibition de la croissance cellulaire et l’induction de l’apoptose par la voie dépendante des caspases . Nous avons étudié les effets des dérivés de la série imidazoquinoxaline, EAPB0203 et EAPB0503, sur des lignées de cellules humaines LMA. Nous avons montré que EAPB0503 inhibe la croissance de la lignée cellulaire LMA qui présente la mutation NPM-1 de manière dose et temps dépendants. Par rapport au dérivé EAPB0203 précédemment synthétisé, EAPB0503 a une activité inhibitrice plus forte sur les cellules OCI-AML3 ainsi que sur des cellules provenant de patients LMA. Nous avons démontré que EAPB0503 induit une dégradation médiée par les protéasomes deNPM-1 muté ainsi qu’un rétablissement de la localisation nucléolaire de NPM-1 sauvage conduisant à une inhibition de la prolifération des cellules OCI-AML3.EAPB0503 induit une apoptose massive comme démontré par l’analyse du cycle cellulaire avec une accumulation de cellules traitées en phase preG0. L’apoptose a été confirmée par la réponse positive au test de l’annexine V, le clivage de PARP et la dissipation du potentiel membranaire mitochondrial dans les cellules OCI-AML3 traitées.En outre, EAPB0503 a augmenté les niveaux d’expression et de phosphorylation de p53.Ces résultats, concernant l’arrêt de la croissance cellulaire et l’apoptose, sélectivement dans les cellules LMA présentant la mutation NPM-1, renforcent l’idée d’un ciblage de l’oncoprotéine NPM-1 muté pour éliminer les cellules leucémiques et justifient une évaluation préclinique plus large puis une évaluation clinique pour ce candidat médicament prometteur.En conclusion, nos études mettent en évidence l'utilisation d’EAPB0503 comme un candidat médicament prometteur qui présente une activité anti-tumorale encourageante et qui devrait faire l’objet d’études précliniques dans le cadre d’une thérapie ciblée contre la LMA. / Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous clonal disorder characterized by immature myeloid cell proliferation and bone marrow failure. Although the remarkable improvements in the field and regarding new drug targets and better understanding of the biology, the clinical treatment of AML remains unchanged and depending on karyotype of patients. For the last thirty years with the majority of patients, in the end, relapsing and dying of the disease, there is no standard regimen that improves prognosis and treat AML yet.Imidazoquinoxalines are imiquimod derivatives with indirect immunomodulatory effect and direct antitumor activity on melanoma and T-cell lymphoma, attributed to growth inhibition and induction of apoptosis through caspase-dependent pathway. We examined the effects of imidazoquinoxaline derivatives, EAPB0203 and EAPB0503, on human AML cells. We found that EAPB0503 inhibit cell growth of AML cell line that harbors the NPM-1 mutation in a time- and dose-dependent way. Compared to the previously synthesized EAPB0203, EAPB0503 has a more pronounced inhibitory activity on OCI-AML3 cells and cells derived from AML patients as well. We demonstrated that the EAPB0503 induces proteasome-mediated degradation of mutant NPM-1, and restoration of the nucleolar localization of the NPM-1wt leading to an inhibition of the proliferation of OCI-AML3 cells.EAPB0503 induced massive apoptosis as demonstrated with the cell cycle analysis by the accumulation of treated cells in the preG0 region. Apoptosis has been confirmed by Annexin V positivity, PARP cleavage, and dissipation of mitochondrial membrane potential in treated OCI-AML3 cells.Furthermore, EAPB0503 increased the expression and phosphorylation levels of p53.These results in growth inhibition and apoptosis, selectively in AML cells that harbor the NPM-1 mutation reinforce the idea targeting NPM-1m oncoprotein to eradicate leukemic cells and warrant a broader preclinical then clinical evaluation of this promising drug.In conclusion, our studies highlight the use of EAPB0503 as a promising anti-tumor activity to be investigated preclinically in AML targeted therapy.

Un défi de la transcriptomique est d'explorer l'intégralité du répertoire des transcrits normaux et anormaux. Les analyses de GEP (Gene Expression Profiling) basées sur la technologie des puces à ADN sont largement exploitées en cancérologie depuis plusieurs années. Parallèlement, les nouvelles méthodes basées sur le séquençage à haut débit offrent désormais la possibilité de réaliser des analyses précises et sensibles nécessaires à l'étude des cellules normales et cancéreuses. Quelle que soit la méthode, la caractérisation de l'ensemble des transcrits codants et non-codants représente un réel défi biologique pour la recherche de nouveaux marqueurs de diagnostic et de pronostic, et pour la bonne prise en charge des patients. Dans ce travail, j'ai eu l'occasion de traiter deux aspects différents de la biologie qui convergent vers l'identification de transcrits exprimés de manière aberrante dans les leucémies myéloïdes. Le premier aspect a consisté à proposer une sélection de biomarqueurs moléculaires pour la caractérisation de la leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC). A partir de l'expression de ces gènes, nous avons développé un score de pronostic qui a permis de définir deux groupes de patients cliniquement distincts. Nous avons ensuite complété notre étude par une caractérisation phénotypique par cytométrie en flux des sous-populations cellulaires aberrantes constituant les lignages mono- et granulocytaires. Une partie de ce travail a été étendue aux leucémies aiguës myéloïdes (LAM) à caryotype normal (CN). L'autre aspect a consisté à participer à la mise en place d'une approche computationnelle intégrée pour caractériser de nouveaux ARNs non annotés et fort probablement non-codants. En explorant des données de Digital Gene Expression (DGE), nous avons quantifié et caractérisé la fraction de ces transcrits dans les régions intergéniques. Nous avons vérifié l'expression de ces nouveaux transcrits dans les tissus normaux et cancéreux en croisant avec d'autres données d'expression, telles que le RNA-Sequencing, et regarder leur conservation et leur expression dans d'autres espèces. / A challenge of transcriptomics is to explore the full repertoire of normal and abnormal transcripts. Gene expression profiling analyses based on microarray technology are widely used in cancer research since many years. Meanwhile, new methods based on high-throughput sequencing methods offers henceforth the possibility to undergo accurate and sensitive analyses necessary for studying normal and cancer cells. Despite the method, the characterization of all coding and non-coding transcripts is a real biological challenge in identifying novel diagnostic and prognostic markers, and for the proper care of patients. In the present work, I had the opportunity to address two different aspects of biology, both convergent toward the identification of aberrantly expressed transcripts in myeloid leukemia. The first aspect was to provide a selection of molecular biomarkers for the characterization of chronic myelomonocytic leukemia (CMML). We developed a gene expression-based prognostic score which identified two clinically distinct groups of patients. We then completed our study with a phenotypic characterization by flow cytometry of aberrant subpopulations constituting the myeloid and granulocytic lineages. A part of this work has been extended to acute myeloid leukemia (AML) patients with normal karyotype. The other aspect was to participate in the implementation of an integrated computational approach in order to characterize novel non annotated RNAs, more likely non-coding. We quantified and characterized the proportion of these transcripts in intergenic regions by exploring Digital Gene Expression (DGE) data. We checked their expression in normal and cancer tissues by crossing with RNA-Seq data, and their conservation and expression in other species.

Les protéines de liaison à l’ARN PUMILIO 1 et 2 (PUM1/2) exercent un rôle central dans le maintien des cellules souches chez les Invertébrés en se fixant, en association avec des partenaires protéiques, sur la région 3’ UTR de certains ARNm, régulant ainsi leur devenir. A ce jour, le rôle de PUM1/2 dans les cellules souches/progénitrices hématopoïétiques (CSPHs) a été peu étudié. La perte de la coordination entre auto-renouvellement et différenciation des CSPHs peut aboutir à des hémopathies chez l'Homme, d’où la nécessité de comprendre les mécanismes sous-jacents. Notre équipe a mis en évidence, par une approche de shARN, que l’invalidation des protéines PUM1/2 dans les CSHs humaines et murines conduit à une réduction de leur expansion, associée à une apoptose accrue et un arrêt du cycle cellulaire en phase G0/G1, et aussi à une perte du potentiel clonogénique in vitro et du potentiel de reconstitution in vivo. L’objectif de notre travail a consisté à : a/ évaluer les effets de la surexpression de PUM1/2 dans les CSPHs, b/ déterminer l’implication de PUM1/2 dans les processus leucémiques, c/ étudier les mécanismes moléculaires responsables de l’activité de PUM1/2 en identifiant les cibles et les partenaires protéiques par une approche de protéomique globale. Nos résultats suggèrent qu’une surexpression modérée de PUM1 (2/3 fois) dans les cellules CD34+ limite la perte du potentiel clonogénique alors qu’une expression plus élevée (5/10 fois et plus) est toxique. L’analyse de l’expression de PUM1/2 par RT-qPCR dans les échantillons de Leucémies Aigue Myeloïdes (LAM) (GOELAMSthèque) montre une augmentation significative dans les échantillons les plus immatures (LAM0-2) comparés aux contrôles sains. La perte de PUM1/2 par shARN dans les cellules primaires de leucémies ainsi que dans des lignées issues de différents processus leucémiques réduit fortement leur survie. La recherche des partenaires associés à PUM par spectrométrie de masse a permis de découvrir Argonaute2 et MOV10 (tous les 2 impliqués dans la machinerie des miRNA), ainsi que des protéines de liaison aux ARNs, ELAV1 déjà connue pour son implication dans le maintien des CSH murines et IMP3, impliqué dans de nombreux cancers et dans la régulation du cycle cellulaire. L’invalidation de IMP3 ou ELAV1 dans les CSPHs conduisent, in vitro, aux mêmes effets observés avec la perte du PUM 1/2, une diminution de l’expansion avec une augmentation de l’apoptose, et la perte du potentiel clonogénique. Enfin, nous avons identifié FoxP1 (Forkhead box P1) comme nouvelle cible directe de PUM1/2, dont le rôle est encore très peu décrit dans l’hématopoïèse. L’étude fonctionnelle de FoxP1 sur les CSPHs par shARN mime les effets observés avec les facteurs PUM1/2. De plus, la surexpression de FoxP1 restaure partiellement les activités antiprolifératives et pro-apoptotiques générées par les shPUM1/2. Enfin, le profil d’expression de FoxP1 dans les LAM corrèle avec le profil d’expression de PUM1/2. Nos résultats confirment le rôle majeur joué par les protéines PUM1/2 en partie via la régulation positive de FoxP1 qui contribue au maintien les CSPHs normales et pathologiques. / Pumilio 1 and 2 (PUM1/2) RNA-binding proteins exert a central role in stem cell maintenance among Invertebrates by binding the 3'UTR of mRNA targets in association with protein partners, thus regulating mRNA stability/translation. Nothing is known regarding normal and pathologic hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Loss of coordination between self-renewal and differentiation of HSPCs can lead to leukemia in humans, hence the need to understand the mechanisms. Our team has highlighted the fundamental role played by the post-transcriptional regulators Pumilio (PUM) 1/2 on normal HSPC properties. By a shRNA approach, PUM 1/2 knockdown in human and murine HSPCs leads to: a/ a reduced expansion associated with an increased apoptosis and a cell cycle arrest in G0/G1 phase, b/ the loss of their clonogenic capacity and their in vivo reconstitution potential. The objective of our work is to: a/ evaluate the effects of PUM 1/2 overexpression in HSPC, b/ determine PUM1/2 involvement in leukemic processes; c/ investigate the molecular mechanisms responsible of PUM activity in HSPC by identifying protein targets and partners. Our results showed that a moderate overexpression of PUM1 (2 to 3 fold) in normal CD34+ HSPCs limits the loss of their clonogenic potential, while a higher expression (5 to 10 fold or more) is toxic. The expression analysis of PUM1/2 transcripts in Acute Myeloid Leukemia (AML) (GOELAMSthèque) showed a significant increase in the most immature samples (AML0-2) as compared to healthy controls. PUM1/2 knockdown by shRNA in AML cells significantly reduced their survival. The same effect was observed in cell lines from several leukemic processes. We identified various PUM-associated partners by mass spectrometry, Argonaute2 and MOV10 (involved in the miRNA machinery), and the RNA-binding proteins IMP3 (involved in several cancer and in cell cycle regulation) and HuR/ELAV1 (already known to be involved in murine HSPCs maintenance). IMP3 or ELAV1 knockdown in HSPCs in vitro lead to the same effect of a PUM1/2 invalidation, a decreased expansion with an increased apoptosis and the loss of clonogenic potential. Finally, we identify the forkhead box P1 (FOXP1) transcription factor as a new direct target up-regulated by PUM1 and PUM2. Functional study of FoxP1 knockdown by shRNA in HSPCs mimic PUM1/2 activities. Moreover, FOXP1 overexpression partially rescued shPUM antiproliferative and pro-apoptotic effects. Also, the PUM1/2 and FOXP1 expression levels in leukemic primary cells were measured by RT-qPCR and revealed a positive correlation. Our results reveal that PUM1/2 are direct positive regulators of FOXP1 which contributes to the maintenance of normal and leukemic HSPCs.

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) du sujet âgé sont les plus fréquentes des leucémies aiguës. Bien que de physiopathologie hétérogène, elles partagent un pronostic défavorable. L’azacitidine est devenue un des traitements de référence pour les patients jugés inéligibles pour une chimiothérapie intensive mais les critères de sélection des patients entre ces deux approches sont controversés. L’identification de biomarqueur prédictif de réponse à l’azacitidine doit permettre de rationnaliser ce choix thérapeutique. Les facteurs pronostiques classiques d’une cohorte de 334 patients atteints de LAM manquent de précision pour guider la meilleure stratégie pour un patient donné. A partir du séquençage de 224 patients traités par azacitidine, nous montrons un impact défavorable des mutations de TP53 sur la survie globale, quel que soit leur caractérisation fonctionnelle. Le séquençage des exomes de 49 patients selon leur réponse à l’azacitidine (26 répondeurs et 23 non répondeurs), suivi du re-séquençage ciblé de 4 polymorphismes chez 175 patients a montré un impact positif du polymorphisme rs7622799 de MECOM sur la survie globale sous azacitidine. / Elderly patients with acute myeloid leukemias (AML) represent the most frequent acute leukemias. Although they differ in their pathophysiology, they all share an adverse prognosis. Azacitidine has become one of the reference low-intensity frontline therapy for patients deemed unfit for intensive chemotherapy. Patients selection between these 2 options remains controversial. Predictive biomarkers of response to azacitidine should allowed to rationalize this decision making. Classical prognosis factors of a cohort of 334 newly diagnosed AML lack of precision to determine the optimum strategy for any individual patient. By sequencing of a 224-patients series of azacitidine-treated AML patients, we demonstrate an adverse impact of TP53 mutation on overall survival, irrespective of the functional characterization of p53 mutants. Exome sequencing of 49 patients with extreme phenotype as defined by their response under azacitidine (26 responders versus 23 non-responders), followed by targeted sequencing of 4 common polymorphisms in a validation set of 175 patients, showed a positif impact of MECOM rs7622799 on overall survival.