Orientador: Jose Andres Yunes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T09:06:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vasconcellos_JairaFerreirade_D.pdf: 12382146 bytes, checksum: 9d05fdf79968e31e12ded32312675286 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A leucemia linfóide aguda (LLA) é a neoplasia mais freqüente na infância. As interações dos blastos da LLA com as células do estroma da medula óssea (MO) têm um impacto positivo na sobrevivência das células e resistência a quimioterapia. A LLA estimula as células do estroma da MO que reciprocamente promovem a sobrevivência da leucemia. Para identificar moléculas envolvidas na interação leucemia-microambiente foi realizada análise do perfil de expressão gênica de células mesenquimais (MSC) da MO estimuladas com células primárias da LLA. O estímulo da LLA nas MSC ativou várias quimiocinas próinflamatórias, incluindo CCL2 e IL-8. Os níveis plasmáticos de CCL2 e IL-8 em crianças com LLA ao diagnóstico foram significativamente maiores do que em controles normais. A maioria das amostras de LLA primária expressou transcritos dos receptores de CCL2 e IL-8. Ensaios funcionais in vitro demonstraram que a LLA não é afetada pela adição de CCL2, IL- 8 ou anticorpos neutralizantes. Porém ambas as quimiocinas demonstraram estimular a sobrevivência das MSC em meio sem soro e aumentar sua proliferação em meio com quantidades limitadas de soro. Para explorar o efeito da IL-8 no microambiente da MO leucêmica foi sintetizado um antagonista do receptor CXCR2 da IL-8, denominado SB225002 (N-(2-hydroxy-4-nitrophenyl)-N'-(2-bromophenyl)urea). O SB225002 demonstrou efeito deletério contra as linhagens da LLA (Nalm6, REH, Jurkat, CEM e Molt4). Mas nem todas as linhagens da LLA sensíveis ao SB225002 expressaram o receptor CXCR2, sugerindo que seu mecanismo de ação ocorreria através de receptor alternativo. Recentemente foi descrito que o SB225002 também se liga a outros receptores acoplados a proteína G, dentre eles os receptores da histamina e dos canabinóides. Ambos foram testados in vitro e o receptor CNR2 dos canabinóides demonstra desempenhar função no mecanismo de ação do SB225002. Além disso, para identificar moléculas envolvidas na resposta celular ao SB225002 foi realizada a análise do perfil de expressão gênica de células Jurkat tratadas com SB225002. Eventos celulares de resposta inicial ao SB225002 incluíram (i) ativação de phospho-p44/42 ERK e (ii) ativação de GLIPR1 que demonstrou mediar a indução de morte do SB225002. Em conclusão, este trabalho indica a importância das quimiocinas CCL2 e IL-8 no microambiente da LLA, e demonstra o potencial do SB225002 como agente antileucêmico. / Abstract: The interactions of Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) blasts with bone marrow (BM) stromal cells have a positive impact on leukemia cell survival and resistance to chemotherapy. ALL stimulates BM stromal cells, which reciprocally promote leukemia cell survival. To identify molecules critically involved in leukemia-microenvironment crosstalk, we performed gene expression profiling analyses of primary BM mesenchymal stem cells (BMMSC) following stimulation by primary ALL cells. Leukemia stimulation of BMMSC up regulated the expression of several inflammatory chemokines, including CCL2 and IL-8. Secretion of these molecules was confirmed by ELISA assays of in vitro co-culture experiments and in BM plasma samples from pediatric ALL patients. Most primary ALL samples were found to express mRNA for CCL2 and IL-8 receptors. In vitro functional studies revealed that primary ALL cells co-cultured with BMMSC were not affected by addition of CCL2, IL-8 or neutralizing antibodies to these chemokines. On the other hand, both chemokines were found to enhance BMMSC survival in serum-free medium and to increase their proliferation in serum-starved conditions. To further explore the effect of IL-8 in the ALL-BM microenvironment the CXCR2 -IL-8 receptor-antagonist SB225002 ( N - ( 2 - hydroxyl - 4 - nitrophenyl ) - N' - ( 2 - bromophenyl ) urea) was synthesized. SB225002 had a deleterious effect against ALL cell lines (Nalm6, REH, Jurkat, CEM, and Molt4). Suprisingly, not all the ALL cells lines that were sensitive to SB225002 expressed CXCR2 receptor. This find suggested that the SB225002's mechanism of action occurred through a different receptor. SB225002 was recently described to also bind histamine and cannabinoid receptors that were investigated in ALL and the CNR2 cannabinoid receptor demonstrated to play a role in SB225002 mechanism of action. To identify molecules involved in the cellular effects promoted by SB225002, gene expression profiling analyses was performed of Jurkat cells treated with SB225002. Early cellular effects enhanced by SB225002 included (i) activation of phospho-p44/42 ERK and (ii) up regulation of GLIPR1 that shown to mediate SB225002-induced apoptosis. In conclusion, this work support a significant role for the chemokines CCL2 and IL-8 in the ALL-BM microenvironment, and demonstrate SB225002's therapeutic potential. / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Orientadores: José Andrés Yunes, Ana Carolina de Mattos Zeri / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituo de Biologis / Made available in DSpace on 2018-08-19T21:00:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Melo_CarolinaPereiradeSouza_D.pdf: 3404055 bytes, checksum: 57f3eb2b6199d017aab0f03512317367 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O uso intensivo e combinado de diferentes quimioterápicos tem permitido a cura de 70-80% das leucemias linfóides agudas (LLA) da infância. A intensidade e o uso das drogas são adaptados ao risco de recaída dos pacientes, aferido ao diagnóstico e nas primeiras semanas do tratamento. Embora existam diferenças, os principais critérios utilizados na estratificação dos pacientes nos grupos de risco são idade, contagem leucocitária, imunofenotipagem e a resposta inicial ao tratamento, mensurada pela citoredução na medula óssea e/ou sangue periférico. Este último, tem se mostrado um fator prognóstico poderoso, independente, que permite identificar pacientes com maior ou menor risco de recaída. Ao mensurar a citoredução, faz-se, indiretamente, uma avaliação in loco, da sensibilidade intrínseca da leucemia à quimioterapia. A proposta deste trabalho foi a implementação do uso da metodologia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) para futura identificação de pacientes de LLA com resistência aos quimioterápicos usados na fase de indução. A implementação do método de RMN foi feito com células (linhagens celulares e células primárias de LLA) em cultura com doses de dois quimioterápicos: Prednisolona (PRED) e L-asparaginase (ASNase). O perfil dos metabólitos presentes no meio de cultura das células tratadas com as drogas foi obtido por meio da análise de espectros de RMN, e buscou-se associá-lo à resistência das células aos quimioterápicos. Os biomarcadores identificados neste trabalho permitiram distinguir tanto as linhagens sensíveis das resistentes quanto pacientes que recaíram dos que entraram em remissão, utilizando a técnica da metabolômica. Além disso, a análise do perfil metabólico permitiu formular algumas hipóteses sobre as vias metabólicas implicadas na resistência às drogas. Experimentos complementares com um maior número de pacientes se fazem necessários. Porém, nossos resultados indicam que este método poderá ser futuramente usado para análise de células de pacientes em tratamento, subsidiando, com maior precisão do que os métodos atuais, a alocação dos pacientes nos grupos de risco / Abstract: Intensive and combined use of different chemotherapic drugs has improved the cure rate of childhood Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) to 70-80%. Drugs use and intensity are determined based on patient relapse risk, which is measured at diagnosis and during the first weeks of treatment. Although differences may exist, the main criteria used to stratify patients in risk groups are age, leukocyte count, immunophenotyping and initial response to treatment, measured by cytoreduction in bone marrow and / or peripheral blood. The latter has proved to be a powerful independent prognostic factor, which allows identification of patients at higher or lower risk of relapse. By measuring cytoreduction, an in situ evaluation of the leukemia intrinsic sensitivity to chemotherapy is done indirectly. The aim of this study was to implement the use of Nuclear Magnetic Resonance (NMR) methodology for future identification of ALL patients resistance to chemotherapeutic agents used in the induction phase. NMR method implementation was done with cells (cell lines and primary ALL cells) kept in culture with two chemotherapic drugs: prednisolone (PRED) and L-asparaginase (ASNase). NMR spectra analysis provided information about the metabolic profile of drug treated cells culture medium, which was associated with the cells resistance to chemotherapic drugs. The biomarkers identified in this study allowed distinguishing, not only between the resistant and sensitive strains, but also between relapsed patients and those ones who remained in remission, using the metabolomics technique. Furthermore, analysis of the metabolic profile allowed the formulation of some hypotheses about the metabolic pathways involved in drug resistance. Further experiments with larger numbers of patients are needed. However, our results indicate that this method can be used for future analysis of patients treated cells, supporting, with greater precision than current methods, the allocation of patients into risk groups / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador : Irene Lorand-Metze / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-18T21:02:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lopes_LuizFernando_M.pdf: 1769021 bytes, checksum: 2e3ed72bd95352cbd2d349e686cbc53e (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: Fizemos uma avaliação retrospectiva de 18 crianças com pré-leucemia entre 320 pacientes que foram encaminhados ao Departamento de Pediatria do Hospital A.C.Camargo - São Paulo - entre janeiro de 1984 a dezembro de 1991 com diagnóstico prévio de leucemia para ser confirmado ou afastado. Leucemia linfocítica aguda foi confirmada em 227 pacientes e leucemia não linfocítica aguda em 54. Entre os 18 pacientes que foram classificados com pré-leucemia 8 apresentavam síndrome mielodisplásica, 7 leucemia mielóide crônica (mielodisplasia proliferativa) e 3 crianças desenvolveram LLA após quadro de pancitopenia imitando anemia aplástica severa. As síndrome mielodisplásicas foram classificadas de acordo com os critérios FAB e encontramos 5 RAEB, 2 LMMoC e 1 caso SMD secundária. Um "score" foi feito com contagem do sangue periférico e com a citologia da medula óssea. Os casos foram analisados e comparados com as LLA, LMA, LMC e as anemias aplásticas. Os dados clínicos, alargamento de fígado e baço, a sobrevida e a evolução destes pacientes foram também estudados. Os achados morfológicos dos casos analisados com SMD foram similares aos dados referidos na literatura para os casos de adultos. Nas crianças porém sua incidência foi menor. Em nossa série com SMD os tipos RAEB foram os mais frequentes e de comportamento mais agressivo. Alguns pacientes com pancitopenia imitando anemia aplástica desenvolveram LLA. Tal situação é diferente do quadro de SMD hipocelular encontrada entre os adultos onde a transformação é para LMA. / Abstract: A retrospective evaluation of 18 pre-leukemia in children was made among 320 patients that were referred to the Pediatric Department at A.C.Camargo Hospital in São Paulo - between January 84- December 91 with previously diagnostic of leukemia to be confirmed. Lymphoblastic leukemia was confirmed in 227 patients and non lymphoblastic leukemia in 54. Among the 18 patients that were classified as pre-leukemia, 8 had myelodysplastic syndrome, 7 chronic myeloid leukemia and 3 developed ALL after pancitopenia. The MDS patients was classified acording to the FAB criteria and 5 were RAEB, 1 MMoCL and 1 case was secundary MDS. A score was done with the peripheral blood counts and with the bone marrow slides. Were analysed and compared with the ALL, ANLL, CML and aplastic disease. The clinical manifestations,the liver and spleen enlargement, the survival and follow up was also studied. The morphological findings among the MDS patients was similar with adults patients, as mentioned in the literature, but the incidence is lesser. The RAEB type was more frequent and more agressive disease. Some cases with pancytopenia simulating aplastic anemia developed ALL. This situation is different from the hipocelular MDS were the patients in these cases developed AML latter. / Mestrado / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Jose Andres Yunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T05:42:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Laranjeira_AngeloBrunelliAlbertoni_M.pdf: 2767287 bytes, checksum: 8b66a1e06cad088fa256103c24e955a7 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A resistência intrínseca ou adquirida aos compostos quimioterápicos é uma das mais importantes causas dos insucessos no tratamento das LLAs pediátricas. A interação da LLA com o microambiente da medula óssea contribui para a proliferação e resistência ao regime quimioterápico das células leucêmicas através de uma grande variedade de mecanismos celulares que provavelmente incluem: aumento da expressão de transportadores celulares, aumento no processo de reparo do DNA, diminuição na regulação dos alvos das drogas, mudanças na regulação do ciclo celular e alteração nas vias apoptóticas. No presente estudo observou-se que a interação estabelecida entre células estromais e células de LLA-B, promoveu a ativação destas como avaliado pela análise das moléculas de superfície das células leucêmicas ao longo dos períodos de cultivo, além da sobrevivência e/ou proliferação em mais de 60% dos casos in vitro. A comunicação entre os dois tipos celulares também mostrou a influência do estroma na modulação da expressão transcricional de 17 genes relacionados com a resistência e sensibilidade a quimioterápicos em células de LLA-B. A modulação teve como conseqüência o aumento nos níveis de expressão da maioria dos genes de resistência e a queda de expressão da maioria dos genes de sensibilidade. Sendo assim, a LLA, pela interação com as células estromais, apresentaram uma alteração que as levou a um fenótipo característico de células resistentes. Essa alteração de expressão mediada pelo contato com o estroma foi confirmada por estudos funcionais de dois genes relacionados com a resistência. O gene KCNN4 em linhagens celulares, que quando submetidas à ação do clotrimazol apresentaram maior viabilidade na presença do que na ausência do estroma; e a adição da proteína recombinante IGFBP-7 no sistema de co-cultura promoveu a resistência e até mesmo proliferação na presença da L-asparaginase. Esta proteína também se mostrou atuante na proliferação das células estromais. Estes resultados mostram dois genes de LLA, que quando modulados pelo contato com o estroma podem contribuir com a maior resistência ao regime quimioterápico, podendo vir a ser usados como alvo para posteriores terapias / Abstract: The intrinsic or acquired chemotherapy resistance composites one of the most important causes of failures in the treatment of pediatric ALL. The ALL and bone marrow microenvironment nteraction contributes for the proliferation and resistance to the chemotherapy regimen of leukemic cells probably through a great variety of cellular mechanisms, including increase of the expression of cellular transporters, increase in the process of DNA repair, downregulation of drugs targets, changes in the regulation of cellular cycle and alteration in the apoptotic ways. In the present study it was observed that the interaction established between stromal cells and pre-B ALL, evaluated through analysis of surface molecules in leukemic cells throughout the periods of culture, were important for the survival and/or proliferation in more than 50% of the cases in vitro. This interaction also showed the influence of stroma in the transcriptional profile of 17 genes related with the resistance and sensitivity to chemotherapeutic agents in pre-B ALL cells. The modulation had as consequence the increase in the levels of expression of the majority of the resistance genes and the decrease of expression of the majority of the sensitivity genes. Being thus, these cellular types, for the interaction with the stromal cells, had presented an alteration that took them to one phenotype characteristic of resistant cells. This stroma-mediated alteration was confirmed by functional studies of two genes related with the resistance. Gene KCNN4 three leukemic cell lines, that when submitted to the action of clotrimazole they had presented greater viability in the presence than in the absence of stroma; and the addition of recombinant protein IGFBP-7 in the co-culture system promoted the resistance and proliferation of primary ALL cells in the presence of the L-asparaginase. This protein also induced proliferation of stromal cells. These results show two genes of ALL, that when modulated for the contact with stroma, can contribute with a resistance to the chemotherapic regimen, becoming possible targets for posterior therapies / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular