L'asthme est une maladie chronique des bronches caractérisée par une inflammation de la paroi bronchique, une hyperréactivité bronchique ainsi qu'une obstruction variable. L'éosinophile contribue à la physiopathologie de l'asthme en sécrétant divers médiateurs pro-inflammatoires, notamment les cysteinyl-leucotriènes (CysLT), qui initient et perpétuent la cascade inflammatoire. Des antagonistes des récepteurs des CysLT comme le Montelukast (MTK) ont été développés afin de diminuer les symptômes associés à l'action des leucotriènes. De récentes études ont démontré que le MTK agit sur des fonctions cellulaires par des mécanismes encore inconnus. Ainsi, nous avons postulé que le MTK agissait sur certaines fonctions de l'éosinophile. Nous avons démontré que le MTK inhibe la biosynthèse de LTC4 chez l'éosinophile sanguin. Toutefois, les mécanismes d'inhibition du MTK restent à élucider. Cette étude a permis de comprendre davantage la régulation de la biosynthèse de LTC4 chez l'éosinophile sanguin.

L'inflammation est un processus important dans lequel le systeme immunitaire reagit a un irritant. Plus precisement, l'inflammation aide a defendre le corps humain contre les agents pathogenes. Cependant, une inflammation chronique et incontrolee peut entrainer des pathologies telles que l'atherosclerose, l'asthme et le cancer. L'enzyme 5-lipoxygenase (5-LO), codee par le gene ALOX5, est principalement exprimee par les leucocytes et joue un role central dans la reaction immunitaire. C'est la premiere enzyme engagee pour la biosynthese de leucotrienes (LT) a partir de l’acide arachidonique. L'activite biologique des LT est diverse, mais principalement le LTB4 induit une chimiotaxie des phagocytes et la liberation d'effecteurs antimicrobiens, alors que les cysteinyl leucotrienes (LTC4, LTD4 et LTE4) induisent la bronchoconstriction et la permeabilite vasculaire. Cette these porte sur 1) les effets biologiques des metabolites du LTB4 sur les fonctions des neutrophiles et sur 2) les mecanismes par lesquels l’expression de la 5-lipoxygenase est regulee dans les monocytes dans le contexte de la defense de l’hote et de l’atherosclerose. Specifiquement, le LTB4 est rapidement degrade en 20-OH- et 20-COOH-LTB4 par les neutrophiles humains. Bien que ces metabolites se lient au recepteur BLT1 avec une haute affinite, ils sont generalement consideres comme inactifs car compare au LTB4, ils activent considerablement moins les leucocytes. Par consequent, le premier objectif de cette these etait d'evaluer les effets biologiques du 20-OH- et du 20-COOH-LTB4 sur les fonctions des neutrophiles humains telles que la migration, la biosynthese des leucotrienes et la production d'effecteurs antimicrobiens. Ensuite, des etudes anterieures ont montre que la differenciation des cellules myeloides avec la 1,25-dihydroxyvitamine D3 et le TGF-β est associee a une forte augmentation de l'expression de la 5-LO. Etant donne que les lipopolysaccharides (LPS) induisaient egalement la maturation cellulaire entrainant une expression accrue du CD14, nous avons emis l'hypothese que le LPS pourrait moduler l'expression de la 5-LO dans des lignees monocytaires. En consequence, notre deuxieme objectif etait d'etudier l'impact du LPS sur l'expression de la 5-LO et la biosynthese des LT. Fait important, cette etude a ete la premiere a rapporter une induction de l’activite transcriptionnelle du promoteur ALOX5 d’une maniere agoniste-dependante. Enfin, une interaction entre l'apport alimentaire en acides gras polyinsatures (PUFA) et des mutations naturelles du promoteur ALOX5 a ete associee a un risque accru de maladies cardiovasculaires. Par contre, des etudes anterieures utilisant des essais rapporteurs avaient opte pour des modeles cellulaires non-humains ou 5-LO-negatifs afin d'etudier la regulation de la transcription de la 5-LO impliquant les polymorphismes du promoteur. Par consequent, en utilisant notre modele d’essais rapporteurs precedemment valide dans des cellules monocytaires humaines, le troisieme objectif de ma these etait de comparer l'activite transcriptionnelle des variants du promoteur ALOX5 distincts en presence ou en l'absence d'une supplementation en PUFA dans les cellules Mono Mac 6. En conclusion, nous avons cherche a mieux comprendre les mecanismes impliques dans la regulation transcriptionnelle de l'expression de la 5-LO et dans la reponse des neutrophiles aux metabolites du LTB4. Nos donnees contribuent a la comprehension du role crucial de la 5-LO et de ses produits sur la defense de l'hote et les maladies. / Inflammation is an important process where the immune system responds to an irritant. Specifically, inflammation helps defend the human body against pathogens. Chronic and uncontrolled inflammation, however, can lead to pathologies such as atherosclerosis, asthma, and cancer. The 5-lipoxygenase enzyme (5-LO), which is encoded by the ALOX5 gene, is mostly expressed by leukocytes and plays a central role in the immune reaction. It is the first committed enzyme for the biosynthesis of leukotrienes from arachidonic acid. The biological activity of leukotrienes is diverse, but mainly LTB4 induces phagocyte chemotaxis and the release of anti-microbial effectors, whereas the cysteinyl leukotrienes (LTC4, LTD4 and LTE4) increase bronchoconstriction and vascular permeability. This thesis focuses 1) on the biological effects of LTB4 metabolites on neutrophil functions and 2) on the mechanisms by which 5-lipoxygenase expression is regulated in monocytes in the context of host defense and disease. Specifically, LTB4 is rapidly degraded into 20-OH- and 20-COOH-LTB4 by human neutrophils. Although these metabolites bind to the BLT1 receptor with high affinity, they are generally considered inactive because they are considerably less capable of activating leukocytes in comparison to LTB4. Therefore, the first objective of this thesis was to evaluate the biological effects of the LTB4 metabolites, 20-OH- and 20- COOH-LTB4, on human neutrophil functions like migration, leukotriene biosynthesis, and production of antimicrobial effectors. Furthermore, previous studies found that the differentiation of myeloid cells with 1,25-dihydroxyvitamin D3 and TGF-β is associated with a strong increase in 5-LO expression. Since the endotoxin lipopolysaccharide (LPS) also induced cell maturation resulting increased CD14 expression, we hypothesized that LPS may modulate 5-LO expression in monocytic cell lines. In consequence, our second objective was to investigate the impact of LPS on 5-LO expression and LT biosynthesis. Importantly, this study was the first to report an agonist-dependent induction of ALOX5 promoter transactivation. Lastly, an association between dietary intake of polyunsaturated fatty acids (PUFA) and naturally occurring mutations in the ALOX5 promoter has been linked to an increased risk of cardiovascular diseases. Unfortunately, prior studies using reporter gene assays opted for both non-humans or 5-LO-negative cell models to study the transcriptional regulation of 5-LO expression in relations to the promoter polymorphisms. Therefore, by using our previously validated gene reporter model in human monocytic cells, the third objective of my thesis was to compare the reporter construct activity of distinct ALOX5 promoter variants in the presence or absence of PUFA supplementation in Mono Mac 6 cells. In conclusion, we sought to better understand the mechanisms involved in the transcriptional regulation of 5-LO expression and in the neutrophil response to LTB4 metabolites. Consequently, our data increases the comprehension of the crucial role of 5-LO and its products on host defense and diseases.

Les médiateurs lipidiques de l'inflammation comprennent plusieurs familles de molécules biologiquement actives, incluant le leucotriène B₄ (LTB₄) et le facteur activant les plaquettes (PAF). Ces médiateurs s'avèrent être particulièrement importants dans la pathogenèse de maladies inflammatoires comme l'arthrite. Effectivement, ils participent directement au recrutement et à l'activation des neutrophiles au site inflammatoire. La biosynthèse du LTB₄ et du PAF implique la phospholipase A₂ de groupe IVA (cPLA₂α); en effet, cette enzyme libère les substrats nécessaires à la biosynthèse de ces médiateurs à partir des phospholipides membranaires. Les mécanismes de régulation de la cPLA₂α sont encore aujourd'hui peu compris. Cette présente étude visait à mieux comprendre et à élucider de nouveaux mécanismes de régulation de la cPLA₂α, première enzyme impliquée dans la biosynthèse du LTB₄ et du PAF dans les neutrophiles humains. Les résultats démontrent que, dans les neutrophiles humains, l'activité de la cPLA₂α est inhibée par son produit, l'acide arachidonique (AA) et que l'AA induit la translocation de l'enzyme aux membranes. Nos résultats suggèrent également une interaction directe du produit (AA) avec l'enzyme et que cette interaction se fait probablement au site catalytique. Les résultats de cette étude ont permis de révéler un nouveau mécanisme de régulation de la cPLA₂α jamais identifié, la régulation négative de la cPLA₂α par l'AA. Le site d'interaction de l'AA sur l'enzyme lors de cette régulation reste à être confirmé.

Les cystéinyl-leucotriènes (cysLTs) sont des médiateurs lipidiques pro-inflammatoires impliqués dans l'asthme, liant trois récepteurs couplés aux protéines G: CysLT[indice inférieur 1], CysLT[indice inférieur 2] et GPR99. Des polymorphismes de deux de ces récepteurs, CysLT[indice inférieur 1]-G300S et CysLT[indice inférieur 2]-M201V, ont été fortement associés à l’atopie, une prédisposition aux allergies, alors que le polymorphisme CysLT[indice inférieur 1]-I206S n’y est pas significativement associé. Il a été montré précédemment que le variant CysLT[indice inférieur 2]-M201V avait une signalisation diminuée. L'objectif du projet était d'étudier la signalisation cellulaire des variants CysLT[indice inférieur 1]-G300S et CysLT[indice inférieur 1]-I206S, ainsi que l’interaction du variant CysLT[indice inférieur 1]-G300S avec le récepteur CysLT[indice inférieur 2]-M201V. La lignée cellulaire HEK-293 a été transfectée avec les ADNs plasmidiques codant pour des récepteurs de type sauvage et mutants. L’expression de surface des récepteurs a été vérifiée par cytométrie en flux. La production d’inositol phosphates (IPs) et la transactivation des promoteurs de l’IL-8 et de l’IL-13 ont été mesurées par essai IP-1 et essai luciférase, respectivement, en réponse au LTD[indice inférieur 4] et LTC[indice inférieur 4]. Ensuite, la phosphorylation de principaux effecteurs de signalisation (Erk1/2, p65, p38 et c-Jun) suite à l’activation des récepteurs par le LTD[indice inférieur 4], a été évaluée par immunobuvardage Western. Enfin, l’interaction entre les récepteurs a été étudiée par des expériences de BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) et BiFC (Bimolecular Fluorescent Complementation), en plus d’expériences de type fonctionnel en co-expression. L’expression de surface des récepteurs mutants et de type sauvage est équivalente. Le variant CysLT[indice inférieur 1]-G300S induit une plus forte production d’IPs et une plus grande transactivation des promoteurs de l’IL-8 et de l'IL-13 que le récepteur de type sauvage. De plus, la phosphorylation de Erk1/2 est également augmentée par l’activation de ce variant. Par contre, le récepteur CysLT[indice inférieur 1]-I206S ne montre pas de différence significative dans sa transduction de signal. La co-expression des récepteurs CysLT[indice inférieur 1]-G300S et CysLT[indice inférieur 2]-M201V n’affecte pas leur expression de surface, mais résulte en une faible transactivation du promoteur de l’IL-8 et une production réduite d’IPs en réponse au LTD[indice inférieur 4]. Enfin, les récepteurs ont la capacité d’interagir et de dimériser entre eux. En conclusion, ces résultats suggèrent que le variant CysLT[indice inférieur 1]-G300S induit une plus forte réponse que le récepteur de type sauvage. Cependant, bien qu’il puisse dimériser et interagir avec le variant CysLT[indice inférieur 2]-M201V, ce dernier domine la réponse combinée lorsqu’il est co-exprimé avec le variant CysLT[indice inférieur 1]-G300S.

L’infiltration d’éosinophiles dans la muqueuse bronchique est une caractéristique majeure de l’asthme. Les protéases sont essentielles pour réguler la migration cellulaire du sang vers la muqueuse bronchique. Les travaux présentés dans cette thèse décrivent quelques mécanismes de la modulation de l’activité protéolytique des éosinophiles. Parmi les nombreuses protéases exprimées par l’éosinophile, la métalloprotéinase de la matrice (MMP)-9 et la plasmine générée via la protéine activatrice de type urokinase (uPA) sont cruciales dans la migration de ces cellules dans les tissus. Cette thèse décrit le mécanisme d’action de deux types de médiateurs lipidiques, les cystéinyl-leucotriènes (cysLTs) et l’acide 5-oxo-6,8,11,14-éicosatétraénoïque (5-oxo-ETE), dans le recrutement des éosinophiles. En présence de 5-oxo-ETE, l’éosinophile migre en sécrétant la MMP-9, la plasmine et exprime plus fortement le récepteur de l’uPA (uPAR). Nous avons démontré que les cysLTs sont impliqués dans la migration sans toutefois influencer la protéolyse. Par contre, le montelukast, un antagoniste du récepteur cysLT de type 1 (CysLT1), diminue l’expression d’uPAR, la sécrétion de MMP-9 et la génération de plasmine. Ces résultats suggèrent que le montelukast ne serait pas un antagoniste neutre du CysLT1, mais un agoniste inverse, quoique cette hypothèse doive être confirmée. Ensuite, pour mieux comprendre comment le 5-oxo-ETE induit la sécrétion de protéases, la signalisation sous-jacente a été étudiée. Les travaux démontrent que la protéine kinase C (PKC)-δ, la PKC-ζ, l’extracellular signal-regulated kinase (ERK)-1/ 2 et la p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) jouent un rôle majeur dans la migration induite par le 5-oxo-ETE. Notamment, l’activation d’ERK-1/2 semble dépendre de la présence de plasminogène dans le milieu. La plasmine générée à partir du plasminogène peut activer ERK-1 /2 et ainsi stimuler la sécrétion de MMP-9. Ces résultats démontrent la complexité de la régulation des protéases chez l’éosinophile et documente le rôle primordial des PKC et des MAPK dans cette modulation. / Infiltration of eosinophils into the bronchial mucosa is a key feature in asthma pathology. With the influence of mediators, eosinophils have the capacity to interact with structural cells, modulate their functions, promote airway remodelling, and activate and recruit other inflammatory cells. Proteases are essential to promote cell migration from blood into tissue and interactions with tissue structural cells and extracellular matrix components. This work presents some of the mechanisms modulating eosinophil protease activity, more specifically the production of MMP-9 and plasmin. Herein, we evaluated the mechanism of action of two lipid mediators, the cysteinyl-leukotrienes (cysLTs) and the 5-oxo-ETE, in eosinophil recruitment. 5-Oxo-ETE elicits eosinophil migration by activating MMP-9 secretion, plasmin generation and by increasing uPAR expression. The cysLTs are also implicated in eosinophil migration but not in protease activation. On the other hand, montelukast, a cysLT type 1 receptor antagonist, decreases uPAR expression, MMP-9 secretion and plasmin generation. These results suggest that montelukast is not a neutral antagonist, but an inverse agonist in eosinophils, although this hypothesis needs to be validated. Thereafter, we were interested in signalling induced by 5-oxo-ETE. Our results demonstrated that protein kinase C (PKC)-δ, PKC-ζ, extracellular signal-regulated kinase (ERK)-1/2 and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) play a major role in eosinophil migration. The implication of ERK-1/2 seems to depend on plasminogen presence in the medium. Plasmin generated from plasminogen activates ERK-1/2 and stimulates MMP-9 secretion. These results demonstrate the complex regulation of eosinophil proteases and the essential implication of PKC and MAPK in this process.

Les récepteurs couplés de protéines G (RCPG) sont des capteurs biologiques polyvalents responsables de la majorité des réponses cellulaires aux hormones et neurotransmetteurs ainsi que des sens de la vue, de l'odorat et du goût. La transduction des signaux est associée à un ensemble de changements dans la structure tertiaire des récepteurs entraînant l'activation de partenaires intracellulaires dont les protéines G. La dimérisation est un élément central du mode de fonctionnement des RCPG ; cependant, son influence sur la façon dont le signal est transmis est encore mal définie.Nous avons utilisé ici le récepteur BLT1 du leucotriène B4 comme modèle afin d'analyser les changements de conformation au cours de l'activation. Pour cela, nous avons produit le récepteur suivant une approche qui consiste à l'exprimer dans les corps d'inclusion bactériens puis à le renaturer à l'aide de détergents et/ou surfactants originaux. L'accès au récepteur purifié nous a permis de montrer que la protéine G induit une asymétrie dans les changements de conformation au sein de l'homodimère de BLT1. De plus, nous avons pu établir que l'activation de la protéine G se fait essentiellement par le protomère ayant fixé l'agoniste (cis-activation). Enfin, nous avons montré que la forme monomérique du récepteur est parfaitement capable d'induire l'activation de la protéine G, même si le dimère apporte une modulation de la réponse. Ceci indique qu'un monomère de récepteur possède tous les déterminants moléculaires nécessaires à la transmission du signal. L'ensemble de ces résultats apporte un éclairage nouveau sur la façon dont les dimères de RCPG fonctionnent et peuvent moduler la réponse biologique. / G-protein coupled receptors are versatile biological sensors that are responsible for the majority of cellular responses to hormones and neurotransmitters as well as for the sense of sight, smell and taste. Signal transduction is associated with a set of changes in the tertiary structure of the receptor that are recognized by the associated intracellular partners, in particular the G proteins. There is compelling evidence that GPCR can assemble as dimers but the way these assemblies function at the molecular level is still under investigation.We used here the leukotriene B4 receptor BLT1 as a model to analyze the conformational changes occurring during activation. To this end, we first produced the receptor in E. coli inclusion bodies and subsequently folded it back to its native state in vitro using original membrane mimetics. Using the purified dimeric receptor, we showed that (i) the G protein induces an asymmetric arrangement of the BLT1 homodimer where each of the protomers is in a distinct conformation, and (ii) the G protein is cis-activated, i.e. the protomer that binds the agonist also activates Gα. Finally, we brought evidence that, although the dimer fully activates its G protein partner, the monomer has per se all the molecular determinant for an efficient functioning. All these data are original evidence that sheds light into the way GPCR dimers are activated and in turn modulate G protein-mediated signaling.

La réaction inflammatoire est un processus complexe et essentiel à la défense de l'hôte contre l'infection et le dommage tissulaire. Le déclenchement de la réponse inflammatoire s'effectue entre autre suite à l'activation de récepteurs appelés récepteurs ± toll-like ¿ par des molécules d'origine microbienne ou provenant des tissus endommagés. Le premier leucocyte circulant à atteindre le site inflammatoire est le neutrophile. Le recrutement du neutrophile de la circulation sanguine jusqu'au tissu est un processus finement régulé qui nécessite l'interaction du neutrophile avec 1'endothelium vasculaire. Les médiateurs lipidiques de l'inflammation, les leucotriènes et le facteur activateur des plaquettes, peuvent être produits par les neutrophiles et les cellules endothéliales et régulent plusieurs aspects indispensables au recrutement des neutrophiles soit leur adhésion, transmigration et chimiotaxie. Les travaux présentés dans cette thèse ont mené au développement d'un modèle de migration transendothéliale des neutrophiles humains in vitro permettant l'étude du rôle des médiateurs lipidiques dans la migration des neutrophiles. Les résultats obtenus au cours de ces expériences montrent que la présence d'une matrice extracellulaire dans le modèle de migration transendothéliale augmente l'impact du leucotriène B4 et du facteur activateur des plaquettes dans la migration des neutrophiles. L'utilisation de ce modèle de migration transendothéliale in vitro a également permis de démontrer que la production de novo du leucotriène B4 et du facteur activateur des plaquettes a un rôle clé dans la migration des neutrophiles induite par différents ligands des récepteurs ± toll-like ¿. En effet, l'inhibition de la biosynthèse ou le blocage des récepteurs du leucotriène B4 et du facteur activateur des plaquettes dans ce modèle réduit significativement (jusqu'à 90%) la migration transendothéliale des neutrophiles induite par les ligands des récepteurs ± tolllike ¿. Ce rôle majeur du leucotriène B4 et du PAF dans le recrutement des neutrophiles a également été confirmé in vivo dans le modèle de la poche d'air dorsale chez la souris. Les travaux présentés dans cette thèse contribuent donc significativement à l'amélioration des connaissances concernant les mécanismes régulant le recrutement des neutrophiles lors de la réponse inflammatoire.

Les médiateurs lipidiques de l’inflammation dont le leucotriène B4 (LTB4) et le facteur d’activation plaquettaire (PAF) permettent la régulation de la migration des neutrophiles polymorphonucléaires (PMNs) et l’extravasation plasmatique au site inflammatoire. Afin de déterminer leurs rôles dans la régulation de la migration des PMNs au site inflammatoire, nous avons étudié leur effet potentiellement coopératif en utilisant une approche pharmacologique à l’aide d’antagonistes sélectifs des récepteurs du LTB4 et du PAF dans un modèle d’inflammation dermique chez le lapin. Les résultats montrent un effet inhibiteur additif des antagonistes des deux médiateurs lipidiques, lorsque utilisés de façon concomitante, sur la migration des neutrophiles induite par le LTB4, le PAF et aussi sur des médiateurs non-chimiquement apparentés comme le facteur nécrosant des tumeurs (TNFα), ainsi que sur l'inhibition de l’extravasation plasmatique induite par le leucotriène D4, suggérant un rôle régulateur des récepteurs du LTB4 et du PAF dans la migration des PMNs au site inflammatoire. Nous avons déterminé le rôle de ces médiateurs dans la régulation de la migration des PMNs en réponse à une ischémie-reperfusion des membres inferieurs chez le lapin. Les résultats appuient l’hypothèse selon laquelle le LTB4 et le PAF exercent un rôle important dans l’accumulation des PMNs au site inflammatoire. En effet l’administration concomitante des antagonistes des récepteurs de ces deux médiateurs lipidiques a réduit de façon significative la migration des PMNs aux poumons, intestins et foie. Nos résultats contribuent à élucider le rôle du LTB4 et du PAF dans la régulation de l’extravasation des PMNs et du plasma au site inflammatoire. / Inflammatory lipid mediators including leucotriene B4 (LTB4) and platelet activating factor (PAF) regulate the trafficking of polymorphonuclear neutrophils (PMNs) and plasma extravasation at inflammatory sites. To delineate their role in regulating PMNs extravasation, we studied the effect of PAF and/or LTB4 selective receptor antagonists in dermal inflammation induced by a variety of agonists in a rabbit bioassay model. The results show that there is an additive inhibitory effect when the two antagonists are used concomitantly on PMNs dermal accumulation induced by LTB4 and PAF, as well by chemically unrelated agonists including TNFα, in addition to inhibiting plasma extravasation induced by LTD4. These results support a regulatory role of LTB4 and PAF in regulating PMNs trafficking and plasma extravasation at inflammatory sites. Next, we studied the regulatory role of lipid mediators in regulating PMNs trafficking in response to hind limb ischemia-reperfusion. The results show that the administration of both PAF and LTB4 receptor antagonists reduced significantly PMNs migration to the lung, the liver and the intestine. Our results contributed to elucidate the role of LTB4 and PAF in the regulation of PMNs migration and oedema formation at inflammatory sites.

Les médiateurs lipidiques de l’inflammation dont le leucotriène B4 (LTB4) et le facteur d’activation plaquettaire (PAF) permettent la régulation de la migration des neutrophiles polymorphonucléaires (PMNs) et l’extravasation plasmatique au site inflammatoire. Afin de déterminer leurs rôles dans la régulation de la migration des PMNs au site inflammatoire, nous avons étudié leur effet potentiellement coopératif en utilisant une approche pharmacologique à l’aide d’antagonistes sélectifs des récepteurs du LTB4 et du PAF dans un modèle d’inflammation dermique chez le lapin. Les résultats montrent un effet inhibiteur additif des antagonistes des deux médiateurs lipidiques, lorsque utilisés de façon concomitante, sur la migration des neutrophiles induite par le LTB4, le PAF et aussi sur des médiateurs non-chimiquement apparentés comme le facteur nécrosant des tumeurs (TNFα), ainsi que sur l'inhibition de l’extravasation plasmatique induite par le leucotriène D4, suggérant un rôle régulateur des récepteurs du LTB4 et du PAF dans la migration des PMNs au site inflammatoire. Nous avons déterminé le rôle de ces médiateurs dans la régulation de la migration des PMNs en réponse à une ischémie-reperfusion des membres inferieurs chez le lapin. Les résultats appuient l’hypothèse selon laquelle le LTB4 et le PAF exercent un rôle important dans l’accumulation des PMNs au site inflammatoire. En effet l’administration concomitante des antagonistes des récepteurs de ces deux médiateurs lipidiques a réduit de façon significative la migration des PMNs aux poumons, intestins et foie. Nos résultats contribuent à élucider le rôle du LTB4 et du PAF dans la régulation de l’extravasation des PMNs et du plasma au site inflammatoire. / Inflammatory lipid mediators including leucotriene B4 (LTB4) and platelet activating factor (PAF) regulate the trafficking of polymorphonuclear neutrophils (PMNs) and plasma extravasation at inflammatory sites. To delineate their role in regulating PMNs extravasation, we studied the effect of PAF and/or LTB4 selective receptor antagonists in dermal inflammation induced by a variety of agonists in a rabbit bioassay model. The results show that there is an additive inhibitory effect when the two antagonists are used concomitantly on PMNs dermal accumulation induced by LTB4 and PAF, as well by chemically unrelated agonists including TNFα, in addition to inhibiting plasma extravasation induced by LTD4. These results support a regulatory role of LTB4 and PAF in regulating PMNs trafficking and plasma extravasation at inflammatory sites. Next, we studied the regulatory role of lipid mediators in regulating PMNs trafficking in response to hind limb ischemia-reperfusion. The results show that the administration of both PAF and LTB4 receptor antagonists reduced significantly PMNs migration to the lung, the liver and the intestine. Our results contributed to elucidate the role of LTB4 and PAF in the regulation of PMNs migration and oedema formation at inflammatory sites.

Contexte - La prévalence de la maladie de Crohn (MC), une maladie inflammatoire chronique du tube digestif, chez les enfants canadiens se situe parmi les plus élevées au monde. Les interactions entre les réponses immunes innées et acquises aux microbes de l'hôte pourraient être à la base de la transition de l’inflammation physiologique à une inflammation pathologique. Le leucotriène B4 (LTB4) est un modulateur clé de l'inflammation et a été associé à la MC. Nous avons postulé que les principaux gènes impliqués dans la voie métabolique du LTB4 pourrait conférer une susceptibilité accrue à l'apparition précoce de la MC. Dans cette étude, nous avons exploré les associations potentielles entre les variantes de l'ADN des gènes ALOX5 et CYP4F2 et la survenue précoce de la MC. Nous avons également examiné si les gènes sélectionnés montraient des effets parent-d'origine, influençaient les phénotypes cliniques de la MC et s'il existait des interactions gène-gène qui modifieraient la susceptibilité à développer la MC chez l’enfant. Méthodes – Dans le cadre d’une étude de cas-parents et de cas-témoins, des cas confirmés, leurs parents et des contrôles ont été recrutés à partir de trois cliniques de gastro-entérologie à travers le Canada. Les associations entre les polymorphismes de remplacement d'un nucléotide simple (SNP) dans les gènes CYP4F2 et ALOX5 ont été examinées. Les associations allélique et génotypiques ont été examinées à partir d’une analyse du génotype conditionnel à la parenté (CPG) pour le résultats cas-parents et à l’aide de table de contingence et de régression logistique pour les données de cas-contrôles. Les interactions gène-gène ont été explorées à l'aide de méthodes de réduction multi-factorielles de dimensionnalité (MDR). Résultats – L’étude de cas-parents a été menée sur 160 trios. L’analyse CPG pour 14 tag-SNP (10 dans la CYP4F2 et 4 dans le gène ALOX5) a révélé la présence d’associations alléliques ou génotypique significatives entre 3 tag-SNP dans le gène CYP4F2 (rs1272, p = 0,04, rs3093158, p = 0.00003, et rs3093145, p = 0,02). Aucune association avec les SNPs de ALOX5 n’a pu être démontrée. L’analyse de l’haplotype de CYP4F2 a montré d'importantes associations avec la MC (test omnibus p = 0,035). Deux haplotypes (GAGTTCGTAA, p = 0,05; GGCCTCGTCG, p = 0,001) montraient des signes d'association avec la MC. Aucun effet parent-d'origine n’a été observé. Les tentatives de réplication pour trois SNPs du gene CYP4F2 dans l'étude cas-témoins comportant 225 cas de MC et 330 contrôles suggèrent l’association dans un de ceux-ci (rs3093158, valeur non-corrigée de p du test unilatéral = 0,03 ; valeur corrigée de p = 0.09). La combinaison des ces deux études a révélé des interactions significatives entre les gènes CYP4F2, ALOX et NOD2. Nous n’avons pu mettre en évidence aucune interaction gène-sexe, de même qu’aucun gène associé aux phénotypes cliniques de la MC n’a pu être identifié. Conclusions - Notre étude suggère que la CYP4F2, un membre clé de la voie métabolique LTB4 est un gène candidat potentiel pour MC. Nous avons également pu mettre en évidence que les interactions entre les gènes de l'immunité adaptative (CYP4F2 et ALOX5) et les gènes de l'immunité innée (NOD2) modifient les risques de MC chez les enfants. D'autres études sur des cohortes plus importantes sont nécessaires pour confirmer ces conclusions. / Background - The rates of Crohn’s disease (CD) a chronic inflammatory disease of the gastrointestinal tract, among Canadian children are the world’s highest. Interactions between the host microbial–innate-immune-responses are thought to underplay transition from physiological to pathological inflammation. Leukotriene B4 (LTB4) is a key modulator of inflammation and has been shown to be associated with CD. We postulated that key genes involved in the LTB4 metabolic pathway could confer susceptibility for early-onset CD. In this study we implemented a candidate gene approach to test for associations between DNA variants in the ALOX5 and CYP4F2 genes and early-onset of CD. We also explored whether the selected genes demonstrated parent-of-origin effects, influenced CD clinical phenotypes and whether there were gender-gene and gene-gene interactions that determined CD susceptibility. Methods – The study consisted of an exploratory phase (case-parent design) followed by a replication phase (case-control design). Confirmed cases, parents and controls were recruited from three tertiary gastroenterology clinics across Canada. Associations between tag-single nucleotide polymorphisms in the CYP4F2 and ALOX5 genes were examined. Allelic and/or genotype associations were examined using conditional on parental genotype (CPG) analysis for the case-parent data and contingency table and logistic regression for the case-control data. Gene-gene interactions were explored using multi-factor dimensionality reduction (MDR) methods. Results – The first phase of the study was based on 160 trios (case-parent design). CPG analysis for 14 tag-SNPs (i.e. 10 in the CYP4F2 and 4 in the ALOX5 gene, respectively) revealed significant allelic or genotypic associations between 3 tag-SNPs in the CYP4F2 gene (rs1272, p=0.04, rs3093158, p=0.00003, and rs3093145, p=0.02). No associations with ALOX5 tag-SNPs were evident. CYP4F2-haplotype analysis showed significant associations with CD (omnibus test p-value=0.035). Two specific haplotypes (GAGTTCGTAA, p=0.05; GGCCTCGTCG, p=0.001) showed evidence for association with CD. No parent-of-origin effects were observed. The second phase of the study retested the three CYP4F2 SNPs that showed association in the first stage and was based on 223 CD cases and 330 controls. Some indications of association with one SNP i.e. rs3093158 were present (genotypic uncorrected 1-sided p-value=0.03); however this genotype association did not withstand correction. Combining cases from the two phases of the study revealed significant interactions between the CYP4F2, ALOX and NOD2 genes. No gene-gender interactions were obvious nor were the study genes associated with specific clinical phenotypes of CD. Conclusions - Our study suggests that the CYP4F2, a key member of the LTB4 metabolic pathway is a potential candidate gene for CD. Furthermore there was evidence that interactions between adaptive immunity genes (CYP4F2 and ALOX5) and innate immunity genes (NOD2) genes modify risk for CD in children. Further studies on larger cohorts are required to confirm these findings.