La perturbation de la barrière hémo-encéphalique et la migration des lymphocytes de la périphérie vers le système nerveux central (SNC) sont des événements précoces dans la formation des lésions cérébrales de sclérose en plaques (SEP). Dans ce contexte, les lymphocytes passent au travers des barrières hémo-encéphalique ou hémo-méningée pour atteindre le SNC et sont des contributeurs importants dans l’inflammation et les dommages tissulaires. Pour migrer à travers les barrières du SNC, les lymphocytes pathogéniques expriment des molécules d’adhérence. Identifier les acteurs clés à la migration des lymphocytes pathogéniques en estimant la contribution des molécules d’adhérence dans ce processus est la prochaine étape pour le développement de thérapies pour traiter la SEP. L’objectif de ce projet est d’explorer le rôle de deux molécules d’adhérence que sont ALCAM (de l’anglais : activated leukocytes cell adhesion molecule) et DICAM (de l’anglais : dual immunoglobulin domain containing cell adhesion molecule) dans la migration des lymphocytes pathogéniques vers le SNC pendant la SEP. Notre objectif principal se subdivise en deux sous-objectifs. En premier, notre but est de caractériser le rôle d’ALCAM dans le passage des lymphocytes B à travers les barrières du SNC dans un contexte neuroinflammatoire. En second, nous explorons le rôle de DICAM dans la migration des lymphocytes T auxiliaires 17 (TH17) vers le SNC en neuroinflammation. Nous faisons l’hypothèse qu’ALCAM contribue à la migration des lymphocytes B vers le SNC et que DICAM est impliqué dans la migration des lymphocytes TH17 à travers la barrière hémo-encéphalique pendant la SEP. Ces molécules d’adhérence seraient alors impliquées dans la pathogenèse de la SEP et seraient de potentielles cibles thérapeutiques pour traiter cette maladie. Nous avons d’abord utilisé une combinaison de spectrométrie de masse, PCR quantitative, cytométrie de flux et microscopie afin d’explorer l’expression de chacune de ses deux molécules d’adhérence sur les lymphocytes d’intérêt périphériques ex vivo ou différenciés in vitro. Des analyses en cytométrie en flux et microscopie nous ont permis de caractériser leur expression dans le sang périphérique et dans les lésions cérébrales de personnes atteintes de SEP. Ensuite, les expériences d’adhérence en flux et de migration in vitro effectuées en déplétant la molécule d’adhérence d’intérêt ont permis de mettre en évidence leur rôle dans différentes étapes de la migration des lymphocytes à travers les cellules endothéliales des barrières du SNC. Pour finir, le traitement de plusieurs modèles murins de SEP, appelés EAE (de l’anglais : experimental autoimmune encephalomyelitis), avec des anticorps bloquant anti-ALCAM ou anti-DICAM ont permis d’explorer le potentiel effet de tels traitements sur la sévérité de la maladie. Dans la première étude, nos résultats montrent qu’ALCAM est préférentiellement exprimée par les lymphocytes B pro-inflammatoires, mémoires et effecteurs au potentiel pathogénique. En tant que molécule d’adhérence, ALCAM contribue à leur migration à travers les cellules endothéliales des barrières hémo-encéphalique et hémo-méningée chez la souris et l’humain. De plus, nos expériences ont permis de montrer que la fréquence de lymphocytes B ALCAM+ est augmentée dans le sang périphérique des personnes atteintes de SEP et ces cellules sont aussi présentes dans les lésions et les infiltrats méningées en SEP. Finalement, bloquer ALCAM in vivo réduit la sévérité de la maladie EAE en diminuant l’infiltration des lymphocytes B au SNC. Dans la seconde étude, nous avons montré que parmi les sous-types de lymphocytes TH, DICAM est préférentiellement exprimée par les lymphocytes TH17. Dans les lésions de SEP, DICAM et son ligand αVβ3 co-localisent avec des marqueurs de cellules endothéliales suggérant que ces deux molécules pourraient être présentées à la lumière des vaisseaux aux lymphocytes TH17 circulants. Dans le sang périphérique, la fréquence de lymphocytes T CD4+ exprimant DICAM est augmentée chez les personnes atteintes de SEP et cette augmentation corrèle avec l’activité de la maladie. Nos expériences ont montré que DICAM est impliquée dans l’adhérence, l’arrêt et la diapédèse des lymphocytes TH17 à travers les cellules endothéliales de la barrière hémo-encéphalique in vitro et in vivo. Finalement, le traitement de souris EAE avec un anticorps bloquant DICAM permet de réduire la sévérité de la maladie et diminue la migration des lymphocytes TH17 vers le SNC. Nos résultats indiquent un rôle d’ALCAM dans la migration des lymphocytes B et que DICAM, préférentiellement exprimé par les TH17, médie leur migration vers le SNC. Bloquer ALCAM ou DICAM sont deux stratégies permettant de réduire l’accès au SNC de différents sous-types de cellules pathogéniques pendant la neuroinflammation. Ainsi, elles sont toutes deux de potentielles cibles thérapeutiques pour réduire la sévérité et la progression de la SEP. / Disruption of the blood-brain barrier and migration of lymphocytes from the periphery to the central nervous system (CNS) are early events in lesion formation during multiple sclerosis (MS). Lymphocytes readily cross the blood-brain barrier (BBB) and the blood-meningeal barrier (BMB) to infiltrate the CNS and are important contributors to inflammation and tissue damage. To migrate through the brain barriers, pathogenic lymphocytes express adhesion molecules. Identifying key players in lymphocyte migration by understanding the role of adhesion molecules is the next step to develop novel therapies to treat MS. The objective of this project is to explore the role of two distinct adhesion molecules ALCAM (activated leukocytes cell adhesion molecule) and DICAM (dual immunoglobulin domain containing cell adhesion molecule) in pathogenic lymphocytes migration to the CNS during MS. This thesis subdivides in two main objectives. First, we aim to characterize ALCAM role in B lymphocyte migration to the CNS during neuroinflammation. Second, we aim to explore DICAM role in T helper 17 (TH17) lymphocytes migration to the CNS in neuroinflammation. We hypothesized that ALCAM plays a role in B lymphocytes migration to the CNS during MS and that DICAM is involved in TH17 lymphocytes migration through the blood-brain barrier during MS. Those adhesion molecules might be involved in MS pathogenesis and therefore could become new therapeutic targets to treat MS. We first used mass spectrometry, quantitative PCR, flow cytometry and confocal microscopy to explore expression profiles of ALCAM and DICAM by peripheral lymphocytes subpopulations ex vivo and differentiated in vitro. Flow cytometry and confocal microscopy analysis also revealed how those adhesion molecules are expressed by lymphocytes in peripheral blood and brain lesions of people living with MS. Then, we performed flow adhesion and migration assay of lymphocytes depleted for the adhesion molecule of interest allowing us to address their role in multitstep migration process through brain barriers endothelial cells. Finally, using five distinct murine experimental autoimmune encephalomyelitis models (EAE), we explored how blocking ALCAM or DICAM in vivo could affect lymphocytes migration to the SNC and disease severity. In the first manuscript, we described that ALCAM is preferentially expressed by B lymphocytes with memory, pro-inflammatory and effector phenotypes. Functionally, ALCAM is involved in B lymphocyte migration through both the BBB and the BMB in mouse and human. Interestingly, we showed that ALCAM expressing B lymphocytes are increased in peripheral blood of people living with MS and they are recovered in meningeal and parenchymal MS lesions. Last, blocking ALCAM in vivo alleviates EAE severity by reducing B lymphocyte infiltration to the CNS. In the second manuscript, we showed that TH17 lymphocytes preferentially express DICAM and can adhere both to DICAM and its ligand αVβ3. Moreover, DICAM and αVβ3 are both overexpressed by inflamed brain endothelial cells. In MS lesions, we described that both molecules colocalize with endothelial cell markers suggesting that it could be presented to the vessel lumen to the circulating TH17 lymphocytes. In peripheral blood, we showed that DICAM+ memory CD4+ T lymphocytes frequency is increased in people living with MS and it correlates with active form of the disease. Then, we described DICAM as a player in TH17 lymphocyte adhesion, arrest and migration through BBB endothelial cells in vitro and in vivo. Last, we showed that treating mice with a neutralizing DICAM antibody in several distinct models of EAE, reduced disease severity and TH17 cell migration to the SNC. Our data provide evidence of the role of ALCAM in memory B lymphocyte migration and that DICAM is preferentially expressed by TH17 cells and mediate their migration to the CNS during neuroinflammation. Collectively, our findings indicate that blocking ALCAM or DICAM are two ways to restrict different pathogenic cells access to the CNS during neuroinflammation and thus potentially to reduce the severity and worsening of a disease like MS.

Presque toutes les cellules nucléées expriment des peptides associés au CMH I (HLA I chez l’humain)(MAP) qui sont échantillonnés à partir du protéome cellulaire et transportés vers la surface cellulaire pour inspection par les lymphocytes T CD8. En tant que tel, la collection de MAP à la surface des cellules, ou immunopeptidome, informe les lymphocytes T CD8 de l’état cellulaire interne. L’immunosurveillance du cancer repose sur la capacité des lymphocytes T CD8 à reconnaître les MAP anormaux sur les cellules tumorales et à les éliminer tout en épargnant les cellules saines. Par conséquent, l’existence du cancer indique que bien souvent, les lymphocytes T CD8 spécifiques à la tumeur sont impuissants, dysfonctionnels ou incapables d’exercer leur fonction. Les vaccins anticancéreux peuvent actionner la destruction des tumeurs en stimulant la reconnaissance des MAP anormaux. Toutefois, le développement de vaccins anticancéreux efficaces est entravé par le manque de MAP exploitables, ou antigènes tumoraux (TA), exprimés exclusivement sur les cellules tumorales. La recherche et l’identification de TA ont été largement limitées aux MAP dérivés de mutations non synonymes situées dans des exons canoniques codant pour des protéines. Ces régions génomiques ne représentent que 2% du génome humain. Le fait que les MAP puissent potentiellement dériver de la traduction non canonique de toutes les régions génomiques n’a été pleinement compris que récemment. Ici, nous avons utilisé la protéogénomique pour découvrir des TA exploitables dérivés de produits de traduction canoniques et non canoniques partagés au sein ou entre divers types de cancers humains. Premièrement, nous avons utilisé des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) pour identifier les MAP associés à la pluripotence (paMAP) étant partagés par les cellules cancéreuses. Les antigènes pluripotents sont exprimés dans les tissus embryonnaires et absents des tissus adultes sains, mais anormalement réexprimés par les cellules cancéreuses. Ainsi, bien qu'ils ne soient pas mutés, les paMAP constituent des cibles idéales et spécifiques au cancer. Nous avons identifié un ensemble de 48 paMAP dérivés de transcrits codants et non codants (48 %) impliqués dans le maintien de la pluripotence et exprimés de manière aberrante dans plusieurs types de cancer. Ainsi, bien qu’elles proviennent de différents types de cellules et de tissus, des tumeurs 4 distinctes convergent vers un programme transcriptionnel associé à la pluripotence. En effet, l’expression des paMAP dans les cancers est corrélée à l’hypométhylation récurrente de leurs gènes sources, la présence d’aberrations génomiques courantes et l’adoption par les tumeurs de stratégies d’évasion immunitaire communes. Enfin, comme plusieurs paMAP sont immunogènes, leur utilisation comme cibles dans des vaccins anticancéreux pourrait entrer en synergie avec les inhibiteurs disponibles des voies d'évasion immunitaire et améliorer le traitement de plusieurs cancers agressifs. Ensuite, nous avons évalué l’ensemble des TA ayant un potentiel thérapeutique dans deux types de tumeurs présentant une charge mutationnelle particulièrement élevée, le mélanome et le cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC). Nous avons constaté que les TA mutés (mTSAs) représentent une minorité (1 %) des TA exploitables dans ces deux types de cancer. Cela peut s'expliquer par une faible expression d'ARN de la plupart des mutations non synonymes ainsi que par leur localisation en dehors des régions génomiques les plus efficaces pour la génération de MAP. En revanche, 99 % des TA dérivent de séquences génomiques non mutées spécifiques au cancer (aeTSA), surexprimées dans le cancer (TAA) ou spécifiques à la lignée cellulaire d'origine (LSA, exprimés par les mélanocytes ou par les cellules épithéliales pulmonaires, pour le mélanome et le NSCLC, respectivement). Tout comme les paMAP, environ 50 % des aeTSA identifiés dans le mélanome et le NSCLC proviennent de séquences non canoniques et sont régulés de manière épigénétique. Alors que les mTSA sont exclusivement spécifiques à chaque patient patient, les aeTSA sont partagés entre les échantillons tumoraux. De plus, leur absence dans les tissus normaux, leur abondance et leur capacité à activer les lymphocytes T CD8 en font des cibles idéales pour traiter les mélanomes et les NSCLC. En conclusion, cette thèse fournit un aperçu de la biogenèse de différents types de TA dans diverses cohortes de patients et ouvre la voie au développement d’immunothérapies ciblées et efficaces contre une grande variété de cancers. / Nearly all nucleated cells express MHC I (HLA I in humans)-associated peptides (MAPs) which are sampled from the cellular proteome and transported to the cell surface for inspection by CD8 T cells. As such, the collection of cell-surface MAPs, or the immunopeptidome, informs CD8 T cells on the inner cell state. Cancer immunosurveillance relies on the capacity of CD8 T cells to recognize abnormal MAPs on tumor cells and eliminate them while sparing healthy cells. Hence, the existence of cancer indicates that tumor-specific CD8 T cells are underpowered, dysfunctional or inhibited from exerting their function. Anti-cancer vaccines can boost tumor killing by stimulating the recognition of abnormal MAPs. The development of effective anti-cancer vaccines is limited by the identification of actionable MAPs, or tumor antigens (TAs), expressed exclusively on tumor cells. The TA search space has been largely limited to MAPs derived from non-synonymous mutations in canonical protein-coding exons which represent a mere 2% of the human genome. That MAPs can derive from the non-canonical translation of potentially all genomic regions has only recently been fully appreciated. Herein, we used proteogenomics to discover actionable TAs derived from canonical and non-canonical translation products shared within or across different types of human cancer. First, we used induced pluripotent stem cells (iPSCs) to identify pluripotency-associated MAPs (paMAPs) shared by cancer cells. Pluripotency antigens are restricted to embryonic tissues and absent from healthy adult tissues but abnormally re-expressed by cancer cells, which makes them ideal tumor-specific targets despite being unmutated. We identified a set of 46 paMAPs derived from coding and allegedly non-coding (48%) transcripts involved in pluripotency maintenance and aberrantly expressed in multiple cancer types. Thus, despite originating from different cell types and tissues, distinct tumor types converged towards a pluripotency-associated transcriptional program. Indeed, the expression of paMAPs across cancers correlated with recurrent source gene hypomethylation, genomic aberrations, and immune evasion properties. Several paMAPs were immunogenic, thus their targeting could synergize with available inhibitors of immune evasion pathways to improve the outcome of multiple aggressive cancers. 7 Next, we evaluated the actionable TA landscape of two tumor types with particularly high mutational load, melanoma and non-small cell lung cancer (NSCLC). We found that mutated TAs (mTSAs) represent a minority (1%) of actionable TAs in both cancer types, which can be explained by a low RNA expression of most non-synonymous mutations and their localization outside genomic regions proficient for MAP generation. By contrast, 99% of TAs derived from unmutated genomic sequences specific to cancer (aeTSAs), overexpressed in cancer (TAAs), or specific to the cell lineage of origin (LSAs, expressed by melanocytes or by lung epithelial cells, for melanoma and NSCLC LSAs, respectively). As for paMAPs, around 50% of aeTSAs in melanoma and NSCLC were non-canonical and were epigenetically regulated. Whereas mTSAs were exclusively patient-specific, aeTSAs were shared among tumor samples and exhibited all characteristics of targetable TAs, including tumor-specificity, high abundance, and immunogenicity. Altogether, this thesis provides insights into the biogenesis of different TA types in various patient cohorts and paves the way for the development of effective TA-based immunotherapies against a large variety of cancers.

This master’s thesis is focused on automating the process of differential leukocyte count in peripherial blood using image processing. It deals with the design of the processing of digital images - from scanning and image preprocessing, segmentation nucleus and cytoplasm, feature selection and classifier, including testing on a set of images that were scanned in the context of this work. This work introduces used segmentation methods and classification procedures which separate nucleus and the cytoplasm of leukocytes. A statistical analysis is performed on the basis of these structures. Following adequate statistical parameters, a set of features has been chosen. This data then go through a classification process realized by three artificial neural networks. Overall were classified 5 types of leukocytes: neutropfiles, lymphocytes, monocytes, eosinophiles and basophiles. The sensitivity and specificity of the classification made for 4 out of 5 leukocyte types (neutropfiles, lymphocytes, monocytes, eosinophiles) is higher than 90 %. Sensitivity of classiffication basophiles was evaluated at 75 % and specificity at 67 %. The total ability of classification has been tested on 111 leukocytes and was approximately 91% successful. All algorithms were created in the MATLAB program.