京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(エネルギー科学) / 甲第25397号 / エネ博第476号 / 新制||エネ||89(附属図書館) / 京都大学大学院エネルギー科学研究科エネルギー基礎科学専攻 / (主査)教授 片平 正人, 教授 森井 孝, 教授 河本 晴雄 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Energy Science / Kyoto University / DFAM

A vinhaça é o principal subproduto na fabricação do álcool e o que possui maior quantidade de nutrientes em sua composição. Seu poder poluente, cerca de cem vezes maior que esgoto doméstico, é decorrente da sua riqueza em matéria orgânica, baixo pH, corrosividade, elevadas DBO e DQO, além de cor escura e cheiro característico. A aceitação crescente no uso de fungos basidiomicetos em processos de tratamento e/ou biorremediação se deve por apresentarem um sistema enzimático extracelular capaz de romper uma grande quantidade de ligações químicas. Espécies do gênero Pleurotus sp. são conhecidas pela produção de enzimas lignolíticas como manganês-peroxidase, peroxidases e lacases. Também são reportados como alimentos por possuírem como seus maiores constituintes carboidratos e proteínas, seguidos de minerais e baixos teores de gorduras. O presente estudo teve por objetivo avaliar a atividade enzimática de quatro fungos basidiomicetos cultivados em meio de vinhaça líquido e sólido, bem como avaliar as propriedades nutricionais dos micélios como fonte de alimento para peixes da espécie D. rerio. Os fungos Pleurotus sajor-caju CCB 020, Pleurotus sp. CCB 068, P. flabellatus CCB 396 e Pleurotus shimeji, foram cultivados em meio sólido e líquido de vinhaça para análise de atividade enzimática e para crescimento micelial durante 15 dias. A atividade enzimática foi determinada de acordo com protocolo de Szklars et al. (1989) e Kuwahara et al. (1984) a cada 3 dias. Os fungos foram liofilizados e oferecidos aos peixes na proporção de 2% do peso corpóreo dos mesmos e nas quantidades de 50% fungo + 50% ração e 100% fungo em cinco réplicas comparando com um grupo controle tratado com 100% ração por um período de 28 dias. As quatro espécies de Pleurotus apresentaram crescimento satisfatório em meio contendo 100% de vinhaça após 15 dias, sendo obtidos maiores valores com Pleurotus sp. CCB 068 (16,27g). Além disso, observou-se o clareamento e diminuição de turbidez da vinhaça pelos fungos P. sajor-caju CCB 020 e P. shimeji. Em relação à atividade enzimática, os maiores valores para lacase foram obtidos em meio de vinhaça + ágar pelo fungo P. sajor-caju (1.247, 43 UI g-1MS -12º dia) e para peroxidase apresentou, ao 6º dia, atividade de 676,02 UI g-1MS. O mesmo fungo obteve maior valor de MnP no 15º dia de cultivo (318,94 UI L-1) em meio de vinhaça líquido. As análises bromatológicas apresentaram valores nutritivos satisfatórios para os fungos quando comparados à ração comercial, apresentando menores valores somente para proteínas. O teste de alimentação com D. rerio durante 28 dia mostrou que houve perda de biomassa, não significativa estatisticamente e, os valores de sobrevivência dos peixes foram de 100% em todos os tratamentos, indicando que os fungos testados cultivados em vinhaça não apresentaram toxidade. Foi concluído que o uso de fungos do gênero Pleurotus sp. cultivados em vinhaça, além de reduzir compostos tóxicos deste subproduto, é eficiente na produção de enzimas de interesse industrial e seus micélios podem ser inclusos na dieta de animais como suplementos nutricionais. / The vinasse is the principal subproduct in the manufacture of alcohol and the one who has the high amount of nutrients in your composition. Its pollutant power, about a hundred times higher than domestic waste, is due to its richness in organic matter, low pH, corrosivity, high BOD and QOD, in adittion to dark color and characteristic odor. The growing acceptance in the use of basiomycetes fungi in the treatment process and/or bioremediation must be present for an extracellular enzymatic system capable of breaking a large number of chemistry bonds. Species of the gender Pleurotus sp. are known for the lignolytic enzyme production like manganese peroxidase, peroxidases and laccases. Are also reported as food because they have as your major constituint carbohydrates and proteins, follow by minerals and low levels of fat. This study aimed to evaluate the enzymatic activity of four basidiomycetes fungi grown in liquid and solid vinasse medium, and to evaluate the nutricional properties of micelium as a food source for fishes D. rerio. The fungi Pleurotus sajor-caju CCB 020, Pleurotus sp. CCB 068, Pleurotus flabellatus CCB 396 and Pleurotus shimeji were grown in solid and liquid vinasse médium for enzymatic activity assay and for micelial grow during 15 days. The enzyme activity was determined according to protocol Szklars et al. (1989) and Kuwahara et al (1984) every 3 days. The fungi were liophilized and offered tho fishes at 2% of body weight and in amounts of 50% of fungus + 50% ration and 100% of fungus in five repetitions compared with a control group treated with 100% ration for 28 days. The four species of Pleurotus shown satisfactory growth in vinasse médium after 15 days, with highest values with Pleurotus sp. CCB 068 (16,27 g). Besides, was observed the bleaching and tubidity reduction by P. sajor-caju CCB 020 and P. shimeji fungi. Regarding the enzymatic activity, the highest values for laccase was obtained by P. sajor-caju (1.247,43 UI g -1 DM - 12th day) and peroxidase presented, at the 6th day, the activity of 676,02 UI g-1DM. The same fungus had the highest value for MnP on the 15th day of cultivation (318,94 UI L-1) in liquid vinasse médium. The bromatological analysis showed satisfactory nutritional values for the fungi when compared to commercial ration, with lowers values only for proteins. The feeding test with D. rerio during 29 days showed that was biomass loss, but not statisticaly significant, and the survival values of fish were 100% in all treatments, indicating that the tested fungi grown in vinasse showed no toxicity. It was concluded that the use of Pleurotus sp. fungi grown in vinasse, besides the reduction of toxic compounds of this subproduct, is effective in the production of industrial interest enzymes and their micelium can be included in the diet of animals as nutritional suplements.

A vinhaça é o principal subproduto na fabricação do álcool e o que possui maior quantidade de nutrientes em sua composição. Seu poder poluente, cerca de cem vezes maior que esgoto doméstico, é decorrente da sua riqueza em matéria orgânica, baixo pH, corrosividade, elevadas DBO e DQO, além de cor escura e cheiro característico. A aceitação crescente no uso de fungos basidiomicetos em processos de tratamento e/ou biorremediação se deve por apresentarem um sistema enzimático extracelular capaz de romper uma grande quantidade de ligações químicas. Espécies do gênero Pleurotus sp. são conhecidas pela produção de enzimas lignolíticas como manganês-peroxidase, peroxidases e lacases. Também são reportados como alimentos por possuírem como seus maiores constituintes carboidratos e proteínas, seguidos de minerais e baixos teores de gorduras. O presente estudo teve por objetivo avaliar a atividade enzimática de quatro fungos basidiomicetos cultivados em meio de vinhaça líquido e sólido, bem como avaliar as propriedades nutricionais dos micélios como fonte de alimento para peixes da espécie D. rerio. Os fungos Pleurotus sajor-caju CCB 020, Pleurotus sp. CCB 068, P. flabellatus CCB 396 e Pleurotus shimeji, foram cultivados em meio sólido e líquido de vinhaça para análise de atividade enzimática e para crescimento micelial durante 15 dias. A atividade enzimática foi determinada de acordo com protocolo de Szklars et al. (1989) e Kuwahara et al. (1984) a cada 3 dias. Os fungos foram liofilizados e oferecidos aos peixes na proporção de 2% do peso corpóreo dos mesmos e nas quantidades de 50% fungo + 50% ração e 100% fungo em cinco réplicas comparando com um grupo controle tratado com 100% ração por um período de 28 dias. As quatro espécies de Pleurotus apresentaram crescimento satisfatório em meio contendo 100% de vinhaça após 15 dias, sendo obtidos maiores valores com Pleurotus sp. CCB 068 (16,27g). Além disso, observou-se o clareamento e diminuição de turbidez da vinhaça pelos fungos P. sajor-caju CCB 020 e P. shimeji. Em relação à atividade enzimática, os maiores valores para lacase foram obtidos em meio de vinhaça + ágar pelo fungo P. sajor-caju (1.247, 43 UI g-1MS -12º dia) e para peroxidase apresentou, ao 6º dia, atividade de 676,02 UI g-1MS. O mesmo fungo obteve maior valor de MnP no 15º dia de cultivo (318,94 UI L-1) em meio de vinhaça líquido. As análises bromatológicas apresentaram valores nutritivos satisfatórios para os fungos quando comparados à ração comercial, apresentando menores valores somente para proteínas. O teste de alimentação com D. rerio durante 28 dia mostrou que houve perda de biomassa, não significativa estatisticamente e, os valores de sobrevivência dos peixes foram de 100% em todos os tratamentos, indicando que os fungos testados cultivados em vinhaça não apresentaram toxidade. Foi concluído que o uso de fungos do gênero Pleurotus sp. cultivados em vinhaça, além de reduzir compostos tóxicos deste subproduto, é eficiente na produção de enzimas de interesse industrial e seus micélios podem ser inclusos na dieta de animais como suplementos nutricionais. / The vinasse is the principal subproduct in the manufacture of alcohol and the one who has the high amount of nutrients in your composition. Its pollutant power, about a hundred times higher than domestic waste, is due to its richness in organic matter, low pH, corrosivity, high BOD and QOD, in adittion to dark color and characteristic odor. The growing acceptance in the use of basiomycetes fungi in the treatment process and/or bioremediation must be present for an extracellular enzymatic system capable of breaking a large number of chemistry bonds. Species of the gender Pleurotus sp. are known for the lignolytic enzyme production like manganese peroxidase, peroxidases and laccases. Are also reported as food because they have as your major constituint carbohydrates and proteins, follow by minerals and low levels of fat. This study aimed to evaluate the enzymatic activity of four basidiomycetes fungi grown in liquid and solid vinasse medium, and to evaluate the nutricional properties of micelium as a food source for fishes D. rerio. The fungi Pleurotus sajor-caju CCB 020, Pleurotus sp. CCB 068, Pleurotus flabellatus CCB 396 and Pleurotus shimeji were grown in solid and liquid vinasse médium for enzymatic activity assay and for micelial grow during 15 days. The enzyme activity was determined according to protocol Szklars et al. (1989) and Kuwahara et al (1984) every 3 days. The fungi were liophilized and offered tho fishes at 2% of body weight and in amounts of 50% of fungus + 50% ration and 100% of fungus in five repetitions compared with a control group treated with 100% ration for 28 days. The four species of Pleurotus shown satisfactory growth in vinasse médium after 15 days, with highest values with Pleurotus sp. CCB 068 (16,27 g). Besides, was observed the bleaching and tubidity reduction by P. sajor-caju CCB 020 and P. shimeji fungi. Regarding the enzymatic activity, the highest values for laccase was obtained by P. sajor-caju (1.247,43 UI g -1 DM - 12th day) and peroxidase presented, at the 6th day, the activity of 676,02 UI g-1DM. The same fungus had the highest value for MnP on the 15th day of cultivation (318,94 UI L-1) in liquid vinasse médium. The bromatological analysis showed satisfactory nutritional values for the fungi when compared to commercial ration, with lowers values only for proteins. The feeding test with D. rerio during 29 days showed that was biomass loss, but not statisticaly significant, and the survival values of fish were 100% in all treatments, indicating that the tested fungi grown in vinasse showed no toxicity. It was concluded that the use of Pleurotus sp. fungi grown in vinasse, besides the reduction of toxic compounds of this subproduct, is effective in the production of industrial interest enzymes and their micelium can be included in the diet of animals as nutritional suplements.

A vinhaça é um resíduo da produção de álcool após a fermentação do mosto e destilação do vinho, resultando de 10 a 15 litros para cada litro de etanol produzido. Este efluente altamente colorido é um sub-produto rico em nutrientes, principalmente materia orgânica, tendo um alto potencial poluente quando disposto no ambiente. Os fungos ligninolíticos podem ser utilizados para a remediação de poluentes, como a vinhaça, pela ação de enzimas peroxidases. Foram utilizadas em ensaios para descoloração da vinhaça três linhagens de fungos ascomicetos e cinco de basidiomicetos sendo que o basidiomiceto Pleurotus sajor-caju CCB 020 se destacou dos demais. A descoloração foi concomitante com o aumento das atividades de lacase e manganês peroxidase. Entretanto ficou evidende que a lacase é a enzima de maior importância na descoloração. P. sajor-caju é comestível tendo seus valores nutricionais determinados na literatura. A vinhaça desencadeou o processo de estresse oxidativo no fungo, fato observado através da elevação da atividade de enzimas (superóxido dismutase, catalase e glutationa redutase) associadas a mecanismos de detoxificação de espécies ativas de oxigênio. Quando comparado com crescimento em meio sintético, o cultivo submerso de P. sajor-caju em vinhaça demonstrou aumento na produção de biomassa (1,06 g 100 mL-1), e aumento na atividade das enzimas como a lacase (variando entre 400 e 450 UI L-1) alcançada entre o 9° e 10º dia e para MnP alcançada no 12° dia de cultivo (variando de 60 a 100 UI L-1), a 28ºC, com agitação constante. Nos mesmos tratamentos foram observadas reduções de: 82,76% na DQO, de 75,29% da DBO, da coloração em 99,17% e da turbidez em 99,73%, indicando a participação destas enzimas na despolimerização de compostos fenólicos e pigmentos de melanoidinas. Após 15 dias de tratamento com o fungo, foi evidenciada a redução de toxicidade da vinhaça determinada por exposição aos organismos: Pseudokirchneriella subcapitata, Daphnia magna, Daphnia similis e Hydra attenuata. Foi concluído que o uso do sistema vinhaça e P. sajor-caju pode ser aplicado em bioprocessos de remoção de cor e na degradação de compostos complexos da vinhaça, ocorrendo destoxicação e melhora em suas qualidades podendo ser indicada como água de reuso, produção de enzimas lacases e manganês peroxidase e aproveitamento de biomassa. / Vinasse is a residue resulting from the production of alcohol after pulp fermentation and distillation of the wine, ensuing from 10 to 15 liters for each liter of ethanol produced. This high colored effluent is a by-product rich in nutrients, mainly organic matter, having a high pollutant potential when disposed in the environment. Lignolytic fungi can be utilized in the remediation of pollutants, such as vinasse, by the action of peroxidases. Assays for the decolorization of vinasse by three ascomycetes fungi and five basidiomycetes were performed and consequently selecting the fungus Pleurotus sajor-caju CCB 020. The activities of manganese-dependent peroxidases (MnP) and laccases and the quantification of the decolorization after the treatment of the vinasse by P. sajor-caju were evaluated and it was observed that this fungus can be utilized to biodegrade and decolorize the vinasse at a concentration of 100% without the necessity of dilution. P. sajorcaju is an edible fungus with nutritional values determined in the literature. The vinasse trigged the process of oxidative stress in the fungus, fact observed through the elevation of the enzyme activities (superoxide dismutase, catalase and glutathione reductase) associated to mechanisms of detoxifying reactive oxygen species. When compared to the growth in synthetic medium, the tests in submerged vinasse cultivation with P. sajor-caju demonstrated a raise in the biomass production (1,06 g 100 mL-1), and in the enzyme activities such as laccase (varying from 400 to 450 U L-1) reached between the 9th and 10th day of growth and for MnP at the 12th day of cultivation (varying from 60 a 100 U L-1), indicating the participation of these enzymes in the depolymerization of phenolic compounds and melanoidins pigments. In the same treatments were observed reductions of 82,76% in COD, 75% of BOD, 99,17% in the color and 99,73% for the turbidity. After the treatment with the fungus, a reduction in the toxicity was evident through the exposition of Pseudokirchneriella subcapitata, Daphnia magna, Daphnia similis e Hydra attenuata. It was concluded that the system P.sajor caju/vinasse can be utilized as a bioprocess for color removal and degradation of complex molecules. It was observed an improvement in the characteristics and detoxification allowing it to be utilized as reused water, laccase and manganese peroxidase enzymes production and for fungal biomass production with a high nutritional value.

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This study aimed to experimentally describe the removal of ATZ from a final concentration of 100 mg.L-1 in liquid culture medium, utilizing rot-white fungi as a future contributor in the treatment of wastewater or public water supplies. Initially assessed the tolerance of Trametes villosa, Lentinus edodes, Pycnosporus sanguineus, Pleurotus ostreatus and Pleurotus sp., in PDA (Potato Dextrose Agar) culture with nutritional variations (PDA test standard, PDA 40% and PDA 0%) in the presence of atrazine at a concentration of 100 mg. L-1 and above an application value of 500 mg.L-1. Next conducted a test 2.2-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium 0.02% (ABTS) to assess the production of ligninolytic enzymes. In these stages, the microorganisms showed both tolerance to atrazine toxicity and growth through each nutritional condition assessed, displaying decrease in growth rate at a concentration of ATZ500 mg.L-1.Morphology and mycelial growth were unsatisfactory at a low nutrient concentration (PDA 0%) when compared with PDA test standard and PDA 40%. Following a 24 hour culture period, enzymatic activity was detected through a colored halo around the microorganisms inoculant across all assessed conditions, except for Lentinus edodes and Trametes villosa, which showed activity after 96 hours, the latter only in PDA 0% culture in the presence and absence of herbicide, therefore selected for the ATZ degradation experiments in liquid culture medium. Pleurotus ostreatus and Pleurotus sp. in PDA 40% static condition yielded the highest removal concentration indexes.ATZ concentration decrease was obtained through enzymatic activity, especially that of laccase and manganese peroxidase, by means of adsorption in the biomass of the microorganisms. Atrazine concentration was determined by means of gas chromatography/high resolution mass spectrometry methods. Study results regarding Pleurotus sp., Pleurotus ostreatus and Pycnosporus sanguineus, under two distinct conditions (agitation and statics), showed their great potential in the bioremediation of aquatic environments contaminated by atrazine. / Diante da deterioração dos recursos hídricos e da crescente necessidade de atender aos padrões de qualidade da água, são necessárias alternativas para a remoção de micropoluentes de ambientes aquáticos. Dentre os micropoluentes, destaca-se a atrazina (ATZ), herbicida da classe dos triazínicos, classificado como medianamente tóxico para o ser humano e altamente tóxico para organismos aquáticos, além de ser um potente disruptor endócrino e possível agente carcinogênico. Processos biotecnológicos têm sido utilizados para minimizar os efeitos tóxicos dos poluentes para o ser humano e meio ambiente, cuja finalidade é interação entre os micro-organismos e os produtos produzidos por eles, como enzimas. O presente estudo descreve de forma experimental, a remoção da ATZ na concentração de 100 mg.L-1 em meio líquido, utilizando fungos de decomposição branca, com vistas a futuras aplicações em tratamento de águas residuárias ou de abastecimento. Inicialmente, foi testada a tolerância das espécies Trametes villosa, Lentinus edodes, Pycnosporus sanguineus, Pleurotus ostreatus e Pleurotus sp., em meio de cultura sólido contendo Batata, Dextrose e Agar (BDA) com variações nutricionais (BDA padrão, BDA 40% e BDA 0%) e atrazina nas concentrações de 100 mg.L-1 e 500 mg.L-1. Posteriormente, foi realizado ensaio com 2,2 –Azino-bis (3- etilbenzotiazolina-6 – ácido sulfônico) diamônia 0,02% (ABTS), para avaliação da produção de enzimas ligninolíticas. Nessas etapas, os micro-organismos apresentaram tolerância à toxicidade da atrazina, cresceram em cada condição nutricional avaliada com redução na velocidade de crescimento na concentração ATZ 500 mg.L-1. A morfologia e o desenvolvimento micelial não foram satisfatórios na baixa concentração de nutrientes (BDA 0%) quando comparados com os meios BDA padrão e BDA 40%. Após o período de 24 horas de cultivo, foi observada atividade enzimática com aparecimento do halo de coloração em torno do inóculo dos micro-organismos em todas as condições avaliadas, exceto as espécies Lentinus edodes e Trametes villosa que apresentaram atividade após 96 horas, e este último somente em meio de cultivo BDA 0%, na ausência e presença do herbicida, por isso não foram selecionados para os experimentos da degradação da ATZ em meios de cultura líquido. Os maiores índices de remoção foram obtidos com as espécies Pleurotus ostreatus e Pleurotus sp., no meio BD 40% em condição estática (87,5% e 87,3%), respectivamente. Os menores valores de remoção foram de 47,2% pela espécie Pycnosporus sanguineus e 53,8% pelo fungo Pleurotus sp. em BD 0%, também na condição estática. A redução da concentração da atrazina foi obtida pela atividade enzimática, com destaque para a lacase e manganês peroxidase, e pelo mecanismo de adsorção na biomassa dos micro-organimos. A concentração da atrazina foi determinada por meio do cromatógrafo gasoso com detector de massa. Os resultados dos estudos com as espécies Pleurotus sp., Pleurotus ostreatus e Pycnosporus sanguineus, sob duas condições (agitação e estática), apresentaram grande potencial para serem utilizados na biorremediação de meios líquidos contaminados com atrazina.

A vinhaça é um resíduo da produção de álcool após a fermentação do mosto e destilação do vinho, resultando de 10 a 15 litros para cada litro de etanol produzido. Este efluente altamente colorido é um sub-produto rico em nutrientes, principalmente materia orgânica, tendo um alto potencial poluente quando disposto no ambiente. Os fungos ligninolíticos podem ser utilizados para a remediação de poluentes, como a vinhaça, pela ação de enzimas peroxidases. Foram utilizadas em ensaios para descoloração da vinhaça três linhagens de fungos ascomicetos e cinco de basidiomicetos sendo que o basidiomiceto Pleurotus sajor-caju CCB 020 se destacou dos demais. A descoloração foi concomitante com o aumento das atividades de lacase e manganês peroxidase. Entretanto ficou evidende que a lacase é a enzima de maior importância na descoloração. P. sajor-caju é comestível tendo seus valores nutricionais determinados na literatura. A vinhaça desencadeou o processo de estresse oxidativo no fungo, fato observado através da elevação da atividade de enzimas (superóxido dismutase, catalase e glutationa redutase) associadas a mecanismos de detoxificação de espécies ativas de oxigênio. Quando comparado com crescimento em meio sintético, o cultivo submerso de P. sajor-caju em vinhaça demonstrou aumento na produção de biomassa (1,06 g 100 mL-1), e aumento na atividade das enzimas como a lacase (variando entre 400 e 450 UI L-1) alcançada entre o 9° e 10º dia e para MnP alcançada no 12° dia de cultivo (variando de 60 a 100 UI L-1), a 28ºC, com agitação constante. Nos mesmos tratamentos foram observadas reduções de: 82,76% na DQO, de 75,29% da DBO, da coloração em 99,17% e da turbidez em 99,73%, indicando a participação destas enzimas na despolimerização de compostos fenólicos e pigmentos de melanoidinas. Após 15 dias de tratamento com o fungo, foi evidenciada a redução de toxicidade da vinhaça determinada por exposição aos organismos: Pseudokirchneriella subcapitata, Daphnia magna, Daphnia similis e Hydra attenuata. Foi concluído que o uso do sistema vinhaça e P. sajor-caju pode ser aplicado em bioprocessos de remoção de cor e na degradação de compostos complexos da vinhaça, ocorrendo destoxicação e melhora em suas qualidades podendo ser indicada como água de reuso, produção de enzimas lacases e manganês peroxidase e aproveitamento de biomassa. / Vinasse is a residue resulting from the production of alcohol after pulp fermentation and distillation of the wine, ensuing from 10 to 15 liters for each liter of ethanol produced. This high colored effluent is a by-product rich in nutrients, mainly organic matter, having a high pollutant potential when disposed in the environment. Lignolytic fungi can be utilized in the remediation of pollutants, such as vinasse, by the action of peroxidases. Assays for the decolorization of vinasse by three ascomycetes fungi and five basidiomycetes were performed and consequently selecting the fungus Pleurotus sajor-caju CCB 020. The activities of manganese-dependent peroxidases (MnP) and laccases and the quantification of the decolorization after the treatment of the vinasse by P. sajor-caju were evaluated and it was observed that this fungus can be utilized to biodegrade and decolorize the vinasse at a concentration of 100% without the necessity of dilution. P. sajorcaju is an edible fungus with nutritional values determined in the literature. The vinasse trigged the process of oxidative stress in the fungus, fact observed through the elevation of the enzyme activities (superoxide dismutase, catalase and glutathione reductase) associated to mechanisms of detoxifying reactive oxygen species. When compared to the growth in synthetic medium, the tests in submerged vinasse cultivation with P. sajor-caju demonstrated a raise in the biomass production (1,06 g 100 mL-1), and in the enzyme activities such as laccase (varying from 400 to 450 U L-1) reached between the 9th and 10th day of growth and for MnP at the 12th day of cultivation (varying from 60 a 100 U L-1), indicating the participation of these enzymes in the depolymerization of phenolic compounds and melanoidins pigments. In the same treatments were observed reductions of 82,76% in COD, 75% of BOD, 99,17% in the color and 99,73% for the turbidity. After the treatment with the fungus, a reduction in the toxicity was evident through the exposition of Pseudokirchneriella subcapitata, Daphnia magna, Daphnia similis e Hydra attenuata. It was concluded that the system P.sajor caju/vinasse can be utilized as a bioprocess for color removal and degradation of complex molecules. It was observed an improvement in the characteristics and detoxification allowing it to be utilized as reused water, laccase and manganese peroxidase enzymes production and for fungal biomass production with a high nutritional value.

Orientadores: Lucia Regina Durrant, Alexandre Nunes Ponezi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-20T15:30:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_IvanJoseSantana_M.pdf: 1134875 bytes, checksum: 88af103bdbd26ade9ec5e063cbd582c5 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: 17a-etinilestradiol (EE2), carbamazepina (CBZ) e ibuprofeno (IBU) são substâncias farmacêuticas muito utilizadas em todo o mundo e vêm sendo frequentemente detectadas em estações de tratamento de efluentes e em águas naturais em vários países, inclusive no Brasil. A grande preocupação da presença destes fármacos em quantidades residuais na água potável e nos ambientes aquáticos são os potenciais efeitos adversos para a saúde humana e animal. O objetivo principal deste trabalho foi avaliar o potencial de fungos ligninolíticos e bactérias para degradar esses três compostos, individualmente. Linhagens de bactérias e fungos ligninolíticos foram crescidas em meio mineral com os fármacos, na presença ou ausência de glicose. Primeiramente, foi realizada uma seleção com o objetivo de escolher linhagens bacterianas e fúngicas com maior capacidade de degradação dessas drogas, avaliando a necessidade da presença de glicose para que a degradação ocorresse. As linhagens que apresentaram maior capacidade de degradar tais compostos foram selecionadas e, em seguida, foram realizados ensaios com o intuito de se otimizar o período de incubação, visando-se uma maior porcentagem de degradação no menor período de incubação possível. Posteriormente, foram realizadas análises de atividade das enzimas lacase, lignina peroxidase (LiP) e manganês peroxidase (MnP) produzidas pelos fungos selecionados e foi avaliada a participação dessas na degradação dos fármacos. A atuação das enzimas do Citocromo P450 na degradação dos fármacos foi avaliada por meio da adição de piperonil butóxido (PB), o qual inibe esse complexo enzimático. A toxicidade dos fármacos e seus metabólitos para a bactéria Vibrio fischeri também foram avaliadas. A quantificação dos fármacos em todas as amostras foi realizada por meio de cromatografia líquida de alta eficiência. EE2 foi totalmente degradado por todos os fungos avaliados, sem a necessidade de glicose no meio de cultivo; no entanto, nenhuma das bactérias estudadas foi capaz de degradá-lo significativamente. Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm linhagem P1 foi selecionado para os ensaios subsequentes. Após 6 dias, foi encontrada atividade de MnP igual a 5122,11 U.L-1. A lacase teve como atividade 307,69 U.L-1, valor encontrado após 4 dias de incubação. Não foi detectada atividade da enzima LiP em nenhum dos tempos analisados. Apesar da detecção de atividade dessas enzimas, elas não foram capazes de degradar o EE2 na ausência do micélio fúngico. Nos ensaios de toxicidade foi encontrada uma CE50 igual a 76% para o EE2 e os metabólitos não apresentaram toxicidade. Trametes sp. linhagem BNI foi a selecionado para degradar CBZ, sendo a glicose necessária para o processo de biodegradação. Após 28 dias de incubação, houve 42% de degradação de CBZ. A atividade máxima de lacase foi de 1740,17 U.L-1, sendo encontrada após 21 dias de incubação. LiP teve como atividade máxima 663,08 U.L-1, valor encontrado após 14 dias de incubação. Não foi detectada atividade da enzima MnP em nenhum dos tempos analisados. Não houve a degradação de CBZ utilizando apenas o caldo enzimático. A presença de PB inibiu totalmente a degradação de CBZ. CBZ e seus metabólitos não apresentaram toxicidade. Nenhuma das bactérias foi capaz de degradar CBZ. IBU foi totalmente degradado por todos os fungos avaliados sem a necessidade de glicose no meio de cultivo, sendo Trametes sp. linhagem BNI selecionado para os ensaios posteriores. Após 2 dias de incubação, BNI foi capaz de degradar totalmente IBU. Lacase foi a única enzima que teve atividade detectada nesse ensaio, sendo a atividade máxima detectada igual a 478,18 U.L-1, no sexto dia de incubação. Não foi detectada degradação de IBU utilizando apenas o caldo enzimático e a presença de PB no meio não inibiu a degradação deste fármaco. Nos ensaios de toxicidade foi encontrada uma CE50 igual a 86% para o IBU e os metabólitos não apresentaram toxicidade. Staphylococcus arlettae e Bacillus megaterium foram capazes de degradar significativamente IBU na presença de glicose. B. megaterium foi selecionado para os ensaios subsequentes. Após 3 dias, essa linhagem foi capaz de degradar todo IBU disponível no meio. Nos ensaios de toxicidade para os metabólitos do processo de biodegradação por B. megaterium, o IBU apresentou uma CE50 inicial igual a 47% e os metabólitos não apresentaram toxicidade. Esses resultados comprovam que fungos ligninolíticos e bactérias são capazes de degradar fármacos encontrados em matrizes ambientais, sendo plausível a utilização destes micro-organismos, ou suas enzimas, em sistemas de tratamento de água e esgoto / Abstract: 17a-ethinylestradiol (EE2), carbamazepine (CBZ) and ibuprofen (IBU) are pharmaceutical drugs used worldwide and have been frequently detected in wastewater treatment plants and in natural waters in several countries, including Brazil. The major concern about the occurrence of these drugs in trace amounts in drinking water and aquatic environments are the potential adverse effects on human and animal health. The main objective of this study was to assess the potential of ligninolytic fungi and bacteria to degrade these 3 compounds individually. Bacteria and ligninolytic fungi strains were grown on mineral medium with these drugs and with or without glucose. A selection was carried out to choose bacterial and fungal strains with capacity to degrade these drugs and if an addition of a carbon source (glucose) was needed for degradation. Strains with greater capacity to degrade these compounds were selected and assays were performed in order to optimize the incubation time to obtain the highest degradation rate in the shortest incubation time. Subsequently, the enzymatic activities of laccase, lignin peroxidase (LiP) and manganese peroxidase (MnP) produced by the selected fungi was assessed. Also, the action of these enzymes in the degradation of the drugs was evaluated. The involvement of cytochrome P450 enzymes in degradation of the pharmaceutical drugs was evaluated by the addition of piperonyl butoxide (PB), which inhibits this enzyme complex. The toxicity of the drugs and metabolites to Vibrio fischeri were also evaluated. The quantification of the drugs was performed by high performance liquid chromatography. EE2 was completely degraded by all fungi without glucose in the medium, however none of the studied bacteria was capable to degrade it significantly. Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm strain P1 was selected for subsequent tests. The maximum enzyme activity produced by P1 was 5122.11 UL-1 for MnP after 6 days and 307.69 UL-1 for lacase after 4 days, while LiP activity was not detected. Although the detection of the enzymes activity, they were not able to degrade EE2 without the fungal mycelia. Toxicity studies showed the half maximal effective concentration (EC50) value equal to 76% to EE2 prior to fungal treatment, after this no toxicity was observed. Trametes sp. strain BNI was selected to degrade CBZ, and glucose was shown to be necessary for the biodegradation process. After 28 days of incubation, 42% of CBZ was degraded. The maximum laccase activity was 1740.17 UL-1, after 21 days of incubation. LiP maximum activity was 663.08 UL-1, found after 14 days of incubation, while MnP activity was not detected. There was no CBZ degradation using only the enzymatic supernatant. The addition of PB completely inhibited the degradation of CBZ. CBZ and its metabolites did not show toxicity. IBU was completely degraded by all fungi without glucose in the medium, and Trametes sp. strain BNI was selected for further analyses. 17a-ethinylestradiol (EE2), carbamazepine (CBZ) and ibuprofen (IBU) are pharmaceutical drugs used worldwide and have been frequently detected in wastewater treatment plants and in natural waters in several countries, including Brazil. The major concern about the occurrence of these drugs in trace amounts in drinking water and aquatic environments are the potential adverse effects on human and animal health. The main objective of this study was to assess the potential of ligninolytic fungi and bacteria to degrade these 3 compounds individually. Bacteria and ligninolytic fungi strains were grown on mineral medium with these drugs and with or without glucose. A selection was carried out to choose bacterial and fungal strains with capacity to degrade these drugs and if an addition of a carbon source (glucose) was needed for degradation. Strains with greater capacity to degrade these compounds were selected and assays were performed in order to optimize the incubation time to obtain the highest degradation rate in the shortest incubation time. Subsequently, the enzymatic activities of laccase, lignin peroxidase (LiP) and manganese peroxidase (MnP) produced by the selected fungi was assessed. Also, the action of these enzymes in the degradation of the drugs was evaluated. The involvement of cytochrome P450 enzymes in degradation of the pharmaceutical drugs was evaluated by the addition of piperonyl butoxide (PB), which inhibits this enzyme complex. The toxicity of the drugs and metabolites to Vibrio fischeri were also evaluated. The quantification of the drugs was performed by high performance liquid chromatography. EE2 was completely degraded by all fungi without glucose in the medium, however none of the studied bacteria was capable to degrade it significantly. Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm strain P1 was selected for subsequent tests. The maximum enzyme activity produced by P1 was 5122.11 UL-1 for MnP after 6 days and 307.69 UL-1 for lacase after 4 days, while LiP activity was not detected. Although the detection of the enzymes activity, they were not able to degrade EE2 without the fungal mycelia. Toxicity studies showed the half maximal effective concentration (EC50) value equal to 76% to EE2 prior to fungal treatment, after this no toxicity was observed. Trametes sp. strain BNI was selected to degrade CBZ, and glucose was shown to be necessary for the biodegradation process. After 28 days of incubation, 42% of CBZ was degraded. The maximum laccase activity was 1740.17 UL-1, after 21 days of incubation. LiP maximum activity was 663.08 UL-1, found after 14 days of incubation, while MnP activity was not detected. There was no CBZ degradation using only the enzymatic supernatant. The addition of PB completely inhibited the degradation of CBZ. CBZ and its metabolites did not show toxicity. IBU was completely degraded by all fungi without glucose in the medium, and Trametes sp. strain BNI was selected for further analyses / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestre em Ciência de Alimentos

A cana-de-açúcar é uma das matérias primas para a produção de açúcar e álcool. Durante o processo de produção, é gerado como subproduto (ou resíduo) o bagaço, que possui várias aplicações, entre elas a geração de energia, fertilizantes, produção de combustíveis e ração animal. O bagaço da cana-de-açúcar é composto principalmente por materiais lignocelulósicos, possuindo como constituintes principais a celulose, a hemicelulose e a lignina. A lignina é um dos materiais mais recalcitrantes na natureza e, conseqüentemente, dificulta o acesso de enzimas aos carboidratos fermentáveis, reduzindo a eficiência da degradação da celulose e da fermentação. Uma das vias de degradação da lignina ocorre através da ação de enzimas produzidas por fungos de degradação branca, marrom e macia. Essas enzimas são capazes de degradar e expor a celulose e a hemicelulose, que, por sua vez são prontamente utilizadas por outros microrganismos. Para que isso ocorra, esses fungos promovem um processo de oxidação de compostos fenólicos e não fenólicos da molécula de lignina por meio de enzimas ligninolíticas extracelulares entre elas a lacase e a manganês peroxidase (MnP), em baixa velocidade, porém com grande eficiência. O presente trabalho tem como objetivo avaliar diferentes tratamentos químicos alcalinos (NaOH e Ca(OH)2) e biológicos (Penicillium sp. e Aspergillus niger) por microscopia óptica, eletrônica de transmissão e de varredura com o intuito de promover uma alteração física na estrutura da fibra do bagaço de cana-de-açúcar. Os resultados foram avaliados pelas técnicas de microscopia demonstrando que a ação dos tratamentos químicos, principalmente do NaOH + Ca(OH)2, provocou uma eficiente desestruturação das fibras em comparação aos outros tratamentos. Em relação às atividades enzimáticas, o pré-tratamento do bagaço com NaOH +. Ca(OH)2 associado ao A. niger mostrou ser mais eficiente para a produção de lacase. Já para a atividade enzimática de MnP, o tratamento controle (bagaço autoclavado) foi o que apresentou maior eficiência. Para Penicillim sp., a atividade enzimática da lacase não aprsesentou diferença significativa entre os pré-tratamentos bagaço autoclavado e NaOH + Ca(OH)2, no entanto, quando comparados aos pré-tratamentos com NaOH e Ca(OH)2 foram os mais eficientes para a produção dessa enzima. Para a enzima MnP, o pré-tratamento associado às duas bases foi mais eficiente. / Sugarcane is one of the raw materials used for sugar and alcohol production. During the production process, bagasse is generated as a subproduct (or residue), which has a large range of application, as electric power generation, fertilizers, combustible production and animal feeding. Sugarcane bagasse is mainly composed by lignocellulosic material, containing as main component cellulose, hemicelluloses and lignin. Lignin is one of the most recalcitrant naturally found molecules, and, consequently, hardens the access of enzymes to fermentable carbohydrates, decreasing the efficiency of cellulose degradation and fermentation. One of the lignin degradation pathways occurs throughout the action of enzymes produced by white-rot, brown and soft-rot fungi. These enzymes are able to degrade lignin, exposing cellulose and hemicelluloses, which get available for other microorganisms. In order to perform this process, these fungi promote an oxidation process of phenolic and non-phenolic compounds of the lignin molecule, by the lignolytic extracellular enzymes. Among them are the enzymes laccase and manganese peroxidase (MnP), which have a slow rate activity, however of high efficiency. The present work has as objective to evaluate different alkaline chemical (NaOH and Ca(OH)2) and biological (Penicillium sp. and Aspergillus niger) treatments by optic microscopy, scanning electron microscopy and transmission electronic microscopy to promote alteration on the physical structure of the sugarcane bagasse fiber. The results were evaluated by the microscopy technique, showing that the activity of the chemical treatments, in special of NaOH + Ca(OH)2 promoted an efficient loss of structure of fibers in comparison to the other treatments. In respect to the enzymatic activity, the bagasse pre-treated with NaOH + Ca(OH)2, in association with A. Niger showed to be more efficient for laccase production. Meanwhile, for the MnP enzymatic activity, the control treatment (only autoclaved bagasse) was that presented the highest efficiency. For Penicillium sp., the laccase enzymatic activity did not present any significant difference among the pre-treatments autoclaved bagasse (control) and NaOH + Ca(OH)2. However, when compared to the pretreatments with NaOH and Ca(OH)2, they were more efficient for the production of the referred enzyme. For MnP, the pre-treatments associated to both alkalis had an increased efficiency.

A total of 30 fungal fruiting bodies were collected from decaying plant materials (barks and litter) from the wild based on morphological variations. Nine of these fungi purified to monoaxenic cultures were included in the present study and also a type strain Ganoderma lucidum ATCC- 32471. These fungi were screened for lignocellulolytic activities, five of these organisms produced ligninolytic enzymes when exposed to two different concentrations of guaiacol (0.02% and 0.2%) on two different media (MEA and PDA). All ten fungal isolates screened for cellulolytic activity were positive for the production of the cellulase enzyme. The fungal isolates were characterised using morphological and molecular methods. Molecular characterization using ITS1 and ITS4 primers was able to identify these fungal isolates to degrees of accuracy ranging from 98% to 100%. The phylogenetic and lineage analysis showed that the species varied amongst phylum Basidiomycota, Ascomycota and early diverging fungal lineages Mucormycotina. Both monocultures and dual cultures of these 10 fungal species were cultivated for the purpose of spectrophotometrically quantifying and evaluating enzyme production on agricultural waste residues; corn cob, sugar cane bagasse and wheat straw. A pattern of antagonistic invasion interaction was identified to demonstrate increased enzyme production on dual cultures. Four of these fungal species, Trichoderma sp. KN10, Rhizopus microsporus KN2, Fomitopsis sp. KN1 and Coriolopsis sp. KN6 demonstrated tendencies of invasion and replacement in co-cultures. The fungi and their dual cultures showed varying levels of enzyme production. Analysis of mean showed dual culture interactions involving KN10 with values for MnP production approximately at 1.46U/ml compared to monoculture of 0.06U/ml. Further, dual laccase values approximately at 0.09U/ml compared to monocultures of 0.05U/ml. Overall the highest enzyme activity was observed using wheat straw. This study demonstrated and proved that agricultural waste residues can be used for lignocellulytic enzyme production and that antagonistic invasion by some fungi (in particular Trichoderma sp. KN10) in co-cultures can increase production of one or more of the three enzyme laccase, lignin peroxidase and manganese peroxidase. / Environmental Sciences / Ph. D. (Environmental Science)

A cana-de-açúcar é uma das matérias primas para a produção de açúcar e álcool. Durante o processo de produção, é gerado como subproduto (ou resíduo) o bagaço, que possui várias aplicações, entre elas a geração de energia, fertilizantes, produção de combustíveis e ração animal. O bagaço da cana-de-açúcar é composto principalmente por materiais lignocelulósicos, possuindo como constituintes principais a celulose, a hemicelulose e a lignina. A lignina é um dos materiais mais recalcitrantes na natureza e, conseqüentemente, dificulta o acesso de enzimas aos carboidratos fermentáveis, reduzindo a eficiência da degradação da celulose e da fermentação. Uma das vias de degradação da lignina ocorre através da ação de enzimas produzidas por fungos de degradação branca, marrom e macia. Essas enzimas são capazes de degradar e expor a celulose e a hemicelulose, que, por sua vez são prontamente utilizadas por outros microrganismos. Para que isso ocorra, esses fungos promovem um processo de oxidação de compostos fenólicos e não fenólicos da molécula de lignina por meio de enzimas ligninolíticas extracelulares entre elas a lacase e a manganês peroxidase (MnP), em baixa velocidade, porém com grande eficiência. O presente trabalho tem como objetivo avaliar diferentes tratamentos químicos alcalinos (NaOH e Ca(OH)2) e biológicos (Penicillium sp. e Aspergillus niger) por microscopia óptica, eletrônica de transmissão e de varredura com o intuito de promover uma alteração física na estrutura da fibra do bagaço de cana-de-açúcar. Os resultados foram avaliados pelas técnicas de microscopia demonstrando que a ação dos tratamentos químicos, principalmente do NaOH + Ca(OH)2, provocou uma eficiente desestruturação das fibras em comparação aos outros tratamentos. Em relação às atividades enzimáticas, o pré-tratamento do bagaço com NaOH +. Ca(OH)2 associado ao A. niger mostrou ser mais eficiente para a produção de lacase. Já para a atividade enzimática de MnP, o tratamento controle (bagaço autoclavado) foi o que apresentou maior eficiência. Para Penicillim sp., a atividade enzimática da lacase não aprsesentou diferença significativa entre os pré-tratamentos bagaço autoclavado e NaOH + Ca(OH)2, no entanto, quando comparados aos pré-tratamentos com NaOH e Ca(OH)2 foram os mais eficientes para a produção dessa enzima. Para a enzima MnP, o pré-tratamento associado às duas bases foi mais eficiente. / Sugarcane is one of the raw materials used for sugar and alcohol production. During the production process, bagasse is generated as a subproduct (or residue), which has a large range of application, as electric power generation, fertilizers, combustible production and animal feeding. Sugarcane bagasse is mainly composed by lignocellulosic material, containing as main component cellulose, hemicelluloses and lignin. Lignin is one of the most recalcitrant naturally found molecules, and, consequently, hardens the access of enzymes to fermentable carbohydrates, decreasing the efficiency of cellulose degradation and fermentation. One of the lignin degradation pathways occurs throughout the action of enzymes produced by white-rot, brown and soft-rot fungi. These enzymes are able to degrade lignin, exposing cellulose and hemicelluloses, which get available for other microorganisms. In order to perform this process, these fungi promote an oxidation process of phenolic and non-phenolic compounds of the lignin molecule, by the lignolytic extracellular enzymes. Among them are the enzymes laccase and manganese peroxidase (MnP), which have a slow rate activity, however of high efficiency. The present work has as objective to evaluate different alkaline chemical (NaOH and Ca(OH)2) and biological (Penicillium sp. and Aspergillus niger) treatments by optic microscopy, scanning electron microscopy and transmission electronic microscopy to promote alteration on the physical structure of the sugarcane bagasse fiber. The results were evaluated by the microscopy technique, showing that the activity of the chemical treatments, in special of NaOH + Ca(OH)2 promoted an efficient loss of structure of fibers in comparison to the other treatments. In respect to the enzymatic activity, the bagasse pre-treated with NaOH + Ca(OH)2, in association with A. Niger showed to be more efficient for laccase production. Meanwhile, for the MnP enzymatic activity, the control treatment (only autoclaved bagasse) was that presented the highest efficiency. For Penicillium sp., the laccase enzymatic activity did not present any significant difference among the pre-treatments autoclaved bagasse (control) and NaOH + Ca(OH)2. However, when compared to the pretreatments with NaOH and Ca(OH)2, they were more efficient for the production of the referred enzyme. For MnP, the pre-treatments associated to both alkalis had an increased efficiency.