T cell effector functions depend on focused secretion. This is accomplished by secretory vesicle (SV) clustering around the microtubule organizing center (MTOC) and MTOC translocation to the specialized site of cell-cell contact - the immunological synapse (IS). The dynein molecular motor has been implicated in both processes. To investigate the roles of dynein and dynein-associated proteins we used Jurkat cells expressing fluorescent CTLA-4 for SV tracking and molecular traps targeting dynein subunits to show that dynein intermediate chain (DIC) and the light chain LC8 are needed for both SV clustering and MTOC translocation. We also found that immunostaining with different anti-DIC antibodies labeled different pools of dynein at the IS in activated Jurkat cells. To discern how dynein separately accomplishes both MTOC and SV activities we cloned DIC cDNAs from Jurkat cell mRNA and obtained two isoforms, DIC2B and DIC2C. However, both isoforms were concentrated around the MTOC and formed a ring-like structure at the IS. We also saw little difference in dynein-binding proteins that co-immunoprecipitated with each isoform. We then investigated the roles of the dynactin component p150Glued and Lis1 protein in MTOC translocation and SV clustering. Surprisingly, p150Glued was concentrated around the MTOC but was not present at the IS. SVs marked by CTLA-4 showed clustering defects while MTOC translocation was not significantly affected in p150Glued siRNA knockdown cells. On the other hand, Lis1 immunostaining labeled a ring at the IS where it mimicked the distribution of the dynein ring thought to be involved in MTOC translocation. MTOC translocation was potently blocked in Lis1 siRNA knockdown cells but dynein recruitment was only slightly disrupted and there was no visible effect on actin localization at the IS. Overexpression of Lis1 or expression of Lis1 deletion mutants interfered with MTOC translocation and interfered with dynein recruitment, while actin was still localized at the IS. However, studies of calcium flux in response to T cell receptor (TcR) stimulation showed that these mutant-expressing cells had deficiencies in cell signaling from the TcR. These results suggest that MTOC translocation and SV clustering are mediated by dynein but likely involve different dynein-binding proteins. / text

Les récepteurs d'antigènes des lymphocytes T (TCR) sont assemblés au cours du développement précoce de ces cellules dans le thymus suite à des recombinaisons complexes de gènes. Le réarrangement d'une chaine beta des TCR fonctionnelle (pré-TCR) déclenche des voies de signalisation intracellulaires qui entrainent la survie, l'expansion et la maturation des thymocytes. Par ailleurs, l'engagement des TCR à la surface des lymphocytes T (LT) matures par des antigènes conduit également à des cycles de prolifération qui permettent le développement de réponses immunitaires efficaces. Ces évènements cellulaires s'accompagnent de remaniements importants du réseau de microtubules et une redistribution des moteurs moléculaires, tels que la dynéine, qui véhiculent les structures cellulaires sur ces réseaux. Les mécanismes moléculaires et les conséquences physiologiques de ces remaniements sont peu connus dans les LT. Lis1 est un régulateur de la dynéine qui est mis à contribution dans la migration neuronale et la prolifération des cellules souches au cours du développement neural. Son rôle au sein du tissu lymphoïde est peu connu. Dans ce travail, nous avons utilisé des modèles de souris spécifiquement déficients en Lis1 dans les LT afin d'étudier les fonctions moléculaires, cellulaires et physiologiques de cette protéine dans ces cellules. Nous montrons que Lis1 joue un rôle essentiel dans le développement précoce des LT et dans l'homéostasie des LT matures. La déficience en Lis1 n'affecte pas le réarrangement de la chaine beta ou les évènements de signalisation déclenchés par le pré-TCR ou le TCR. Cependant, la prolifération des thymocytes ayant passé la beta-sélection ou des LT matures dont le TCR a été engagé, est fortement impactée. L'analyse fine de la mitose indique que la déficience en Lis1 ralentit fortement le processus mitotique, contrarie les remaniements intracellulaires conduisant à la métaphase et entraîne la répartition asymétrique du matériel génétique dans les cellules filles. L'analyse des réseaux de microtubules montre que l'absence de Lis1 entraîne l'amplification du nombre de centrosomes et l'augmentation des cellules multipolaires au cours de la mitose. Enfin, nous montrons que Lis1 favorise l'interaction de la dynéine avec la dynactine, indiquant que Lis1 joue un rôle important dans les LT pour relier la dynéine aux structures cellulaires qu'elle véhicule. En conclusion, nous avons montré que Lis1 est importante dans la distribution du matériel génétique au cours de la prolifération des thymocytes doubles négatifs et des lymphocytes T périphériques. / The T cell receptor (TCR) is assembled during the early development of T lymphocytes in the thymus after complexe genetic recombinations. The rearrangement of a functional TCR beta-chain (pre-TCR) triggers intracellular signaling pathways that cause the survival, expansion and maturation of thymocytes. The commitment of the TCR to the surface of mature T cells after antigen recognition also leads to proliferation allowing the development of effective immune responses. These cellular events go along with significant reorganization of the microtubule networks and a redistribution of molecular motors, such as dynein, which transport the cellular structures via this network. The molecular mechanisms and physiological consequences of the reorganization are poorly understood in T cells. Lis1 is a dynein regulator involved in neuronal migration and stem cells proliferation during neural development. Its role in lymphoid tissue is still unknown. In this study, we used mouse models specifically Lis1-deficient in T cells to study the molecular, cellular and physiological functions of this protein in T cells. We identifiy that Lis1 plays an essential role in the early development of T cells and in the homeostasis of mature cells. Lis1 deficiency does not affect beta-chain rearrangement or signaling events triggered by pre-TCR or TCR, but leads to the blockage of thymocyte cell division that have undergone beta-selection or mature T cells stimulated. Fine analysis of mitosis indicates that the deficiency of Lis1 strongly slows down the mitotic process, counteracts the cell changes leading to the metaphase and leads to asymmetric distribution of the genetic material in the daughter cells. Microtubule networks analysis shows that the absence of Lis1 induces centrosomes amplification and increase of multipolar cells during mitosis. Finally, we show that Lis1 promotes the dynein-dynactin interaction, indicating that Lis1 plays an important role in T cells to bind dynein to the cell structures it carries. In conclusion, we here described that Lis1 is important for the distribution of genetic material during double negative thymocyte and peripheral lymphocyte proliferation.

No description available.

Le terme de CLIP-170 désigne la protéine de lien cytoplasmique de 170 KDa, isolée par Rickard et Kreis (1990). In vitro, elle constitue un lien statique entre les endosomes et les microtubules (MTs). En chacun des points où la CLIP-170 est localisée, elle se co-distribue avec le complexe moteur dynéine/dynactine (D/D). Les auteurs ont initialement établi un modèle de fonctionnement de concert de ces trois protagonistes : la CLIP-170 établirait le lien initial entre le cargo et le MT. Le complexe D/D serait recruté sur le cargo. Une fois le moteur associé au MT, le lien statique serait levé, rendant possible le mouvement. Ce modèle offrait une explication aux données d'immunolocalisation. Toutefois, le fonctionnement de concert de la CLIP-170 et du moteur moléculaire nécessitait que l'on puisse trouver une interaction entre les protagonistes. Les travaux présentés dans cette thèse apportent pour la première fois la preuve d'une interaction indirecte entre le complexe D/D et la CLIP-170. LIS1 est une protéine codée par le gène causal du syndrome de Miller-Dieker, une forme de lissencéphalie de type I. Elle sert d'adaptateur entre le domaine carboxy-terminal de la CLIP-170 et le complexe moteur dont elle régule l'activité. Nos résultats établissent que le domaine d'interaction de la CLIP-170 avec LIS1 est requis pour l'adressage de la première aux kinétochores prémétaphasiques. Il est nécessaire à l'adressage de LIS1 (et du complexe moteur) aux bouts (+) des MTs interphasiques. Nous présentons deux nouvelles approches permettant d'interférer avec le fonctionnement de la CLIP-170 tant en interphase qu'en mitose : la microinjection d'anticorps dirigés contre les domaines extrêmes de la protéine, ainsi que l'utilisation de siRNA dirigés contre l'ARNm la codant. Combinées aux techniques de suivi de protéines fluorescentes par vidéomicroscopie 3D développées au laboratoire, elles permettront d'interférer avec le fonctionnement de la CLIP-170 et de définir ainsi son rôle.

The accurate regulation of cytoplasmic dynein-1 (dynein) is very important since dynein performs multiple functions in cells. In interphase, dynein is responsible for the correct positioning of membrane organelles, such as the Golgi complex and lysosomes. Previous work suggests that dynein's accessory proteins NudEL/Nde1/LIS1¬ may be involved in regulating dynein-dependent organelle movement. This study focuses on how NudEL regulates dynein-driven membrane movement. By using various NudEL fragments, this work presents the first evidence that NudEL is involved in the regulation of dynein-driven ER movement in vitro. Moreover, the in vivo organelle positioning assays also indicate additional regulatory function of NudEL.NudEL fragment (1-157 aa) which contains both the dynein and LIS1 binding domains is sufficient to activate dynein-driven membrane movement, since NudEL1-157 aa activates ER motility in vitro and enhances clustering of the Golgi complex and lysosomes in the peri-nuclear region in vivo. On the other hand, NudEL 96-206 aa containing the LIS1 binding domain alone inhibits ER motility in vitro and causes scattering of the Golgi complex and lysosomes in vivo, indicating an inhibition of dynein-dependent organelle movement. The activation of dynein activity requires the recruitment of LIS1 to the dynein complex by NudEL, since NudEL 1-157 aa has strong binding affinity to both LIS1 and dynein whereas NudEL 96-206 aa binds to LIS1 but not dynein which suggests the sequestering of LIS1 from the dynein complex. Interestingly, NudEL 1-206 aa, which also contains both the dynein and LIS1 binding domains, causes the dispersal of the Golgi complex and lysosomes in vivo, but to a lesser extent than NudEL 96-206 aa. The putative NudEL regulatory domain (157 -242 aa, which contains various phosphorylation sits and is less conserved between NudEL and Nde1) in NudEL 1-206 aa may regulate the interaction of LIS1 and the dynein complex, since NudEL 1-206 aa has strong binding affinity to LIS1 and weak binding affinity to dynein. However, further work is needed to understand the exact mechanism by which this putative NudEL domain regulates dynein activity.

Pac1/LIS1, an essential tip tracking protein of the WD40 super family, is required to target cytoplasmic dynein to the plus ends of astral microtubules in budding yeast. Pac1/LIS1 protein is composed of two regions: a small coiled-coil domain and a highly conserved WD40 repeat domain. Because of in vivo data suggesting the motor domain of Dyn1 interacts with Pac1, I attempted to locate the region of Pac1/LIS1 essential for binding to Dyn1/HC by utilizing PCR-mediated site directed mutagenesis. PCR-generated site directed Pac1(S226P) mutant appears to bind Dyn1/HC, allowing it to localize to the microtubule plus ends; whereas, Pac1(H197R) and Pac1(D379H) mutants appear to disrupt motor localization. I further hypothesized that Dyn1/HC would bind to either the coiled-coil domain or the WD40 repeat domain. Using truncated Pac1 constructs, I have observed that neither the coiled-coil domain nor the WD40 repeat domain alone is sufficient to recruit Dyn1/DHC to the plus ends of the cytoplasmic microtubules. Additionally, if I dimerize the WD40 repeat domain with a GST fusion tag, I observed that Dyn1/HC colocalized with the truncation at the spindle pole bodies. This result indicates that Pac1 must dimerize with its coiled-coil domain prior to interacting with Dyn1/HC. Furthermore, the WD40 dimer, is unable to track microtubule plus-ends; indicating that the very N-terminus of Pac1 is important for other interactions responsible for recruiting the Pac1/Dyn1 complex to the astral microtubule plus end.

La CLIP-170 (Cytoplasmic Linker Protein of 170 kDa) est requise, in vitro, pour l'établissement d'un lien statique entre les endosomes et les microtubules (MTs). Elle se localise, in vivo, aux bouts « plus » des MTs en croissance et semble participer ainsi à la capture de ces derniers au cortex cellulaire et aux kinétochores. Elle contribue au contrôle de la dynamique des MTs et semble aussi recruter le complexe moteur dynéine cytoplasmique/dynactine sur les extrémités « plus » des MTs, via son domaine carboxy-terminal. La CLIP-170 s'associe également aux kinétochores d'une façon dépendante du complexe dynéine/dynactine et de son domaine C-terminal. Ce domaine C-terminal contient deux motifs de type « doigt de zinc » (proximal et distal) probablement impliqués dans des interactions avec d'autres protéines.<br />Nous rapportons ici la démonstration d'une interaction directe entre la CLIP-170 et LIS1, une protéine capable, par ailleurs, d'interagir directement avec le complexe dynéine/dynactine. LIS1 est mutée chez de nombreux patients atteints d'une lissencéphalie de type I et semble jouer le rôle de co-facteur activateur de la dynéine cytoplasmique. Nous avons montré que cette interaction dépendait du doigt de zinc distal de la CLIP-170 et nous avons apporté des éléments indiquant une possible régulation de cette interaction par phosphorylation.<br />L'étude des fonctions cellulaires potentielles de cette interaction nous a permis de mettre en évidence un enrichissement de LIS1 aux extrémités « plus » des MTs. Elle a fourni des éléments substantiels laissant supposer que cette localisation, comme celle de la dynactine au même endroit, était dépendante du domaine C-terminal de la CLIP-170. Par ailleurs, nous avons démontré que la localisation de la CLIP-170 sur le kinétochore dépendait de son domaine d'interaction avec LIS1, et que le recrutement de LIS1 au même site dépendait du complexe dynéine/dynactine. L'ensemble de ces données suggère que LIS1 constitue un adaptateur entre la CLIP-170 et le complexe moteur dynéine/dynactine.<br />Parallèlement, nous avons initié l'étude de protéines LIS1 qui présentent chacune une mutation ponctuelle dans diverses régions conservées. Ces mutations ponctuelles ont été découvertes chez des patients atteints d'une lissencéphalie de type I plus ou moins sévère. Par des approches biochimiques, moléculaires et cellulaires, nous avons montré que, selon la sévérité de la maladie, les différentes propriétés de LIS1 (repliement, stabilité, localisations sub-cellulaires, interaction avec ses partenaires et liaison aux MTs) étaient plus ou moins affectées. À l'occasion de cette étude, nous avons également identifié les domaines de LIS1 impliqués dans l'interaction avec les MTs et d'autres partenaires comme les sous-unités catalytiques du PAFAH(I) (Platelet-Activating Factor Acétylhydrolase).

Dynein is a minus end directed molecular motor required for numerous cellular processes during intracellular transport and mitosis. Pac1/LIS1 and Bik1/CLIP-170 are two proteins required for targeting dynein to cytoplasmic microtubule plus ends in budding yeast. The lab previously proposed a model whereby Pac1/LIS1 binds to the motor domain of dynein heavy chain, Dyn1/HC, forming a complex that interacts with the +TIP protein Bik1/CLIP170 at plus ends. This project focused on using Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) to visualize protein-protein interactions among dynein pathway components in vivo. Budding yeast, Saccharomyces cerevisiae is an ideal system to manipulate dynein as it is a non-essential protein in this system. The BiFC assay fuses two non-fluorescent halves of Venus, a YFP-derivative, to proteins of interest. If an interaction between the proteins occur, the two halves are brought to close proximity and the fluorophore is reconstituted. Cells co-expressing Dyn1-VN with Pac1-VC or Bik1-VC exhibited fluorescent foci associated with microtubule plus ends, the cell cortex and spindle pole bodies (SPBs). Additionally, cells co-expressing Pac1-VC with Bik1-VN exhibited fluorescent foci associated with microtubule plus ends. Cells coexpressing Tub1-VC and Bik1-VN or Dyn1-VN have BiFC signal indicating that both interact with the microtubule directly. Pac-1 coexpressed with Tub1 had no signal above background. These data support that these three components associate at microtubule plus ends. Dyn1 and Pac1 interact with Bik1 at microtubule plus ends. Bik1 serves as a docking platform for the two, but dynein is still able to interact with microtubules, while Pac1 is not.

Cytoplasmic dynein is a microtubule-dependent motor protein which participates in numerous cellular processes. The motor complex consists of two heavy chains, intermediate, light intermediate and 3 families of light chains. Dynein is able to bind to these accessory chains as well as to regulatory proteins which enables the motor protein to fulfil such a variety of cellular processes. The associated light chains participate in long-distance organelle and vesicle transport in interphase and in chromosome segregation during mitosis. However, how these light chains control the activity of the motor protein is still unknown. In this study, I combine molecular genetics and live cell imaging to elucidate the role of the associated dynein light intermediate and light chains in dynein behaviour and early endosome (EE) motility in hyphal interphase cells as well as the anchorage of dynein to the microtubule (MT) plus-end in interphase and mitotic cells. I show that the dynein light intermediate chain (DLIC) as well as the light chain 2 (DLC2, Roadblock) are involved in dynein processivity and EE movement in interphase. The downregulation of either protein results in short hyphal growth which could be caused by a decreased runlength of EE and dynein. In addition, both proteins participate in dynein anchorage to the microtubule plus-end in interphase and mitosis as well as in spindle elongation during mitosis. Each protein causes a decrease of the motor protein dynein at MT plus-ends. Surprisingly, I found only minor or no defects in LC8 or Tctex mutants in the observed functions of dynein. LC8 seems to affect the dynein but not the EE runlength. In this case, dynein is still able to move into the bipolar MT array from where kinesin3 is able to take over EEs and move them towards the cell center. In contrast, Tctex has no effect on dynein or EE runlength or any other observed dynein function in hyphal cells. However, it causes a reduction in spindle elongation. Taken together, DLIC and DLC2 are important for dynein behaviour in long distance transport as well as in spindle positioning and elongation during mitosis. Furthermore, I studied the involvement of the dynein regulators Lis1 and NudE as well as the plus-end binding protein Clip1 (Clip-170 homologue) in the anchorage of dynein to the astral microtubule plus-ends during mitosis. The disruption of the anchorage complex at the astral MT plus-end causes a decrease in dynein number at this site and therefore slower spindle elongation in Anaphase B. Taken together, all three proteins are involved in anchorage of dynein to the astral microtubule tip and the subsequent spindle elongation. Furthermore, these findings also show that Ustilago maydis evolved two different mechanisms to anchor the motor protein to MT plus-ends in hyphal and mitotic cells. The plus-end binding protein Peb1 (EB1 homologue) and the dynein regulator dynactin mediate the dynein anchorage in hyphal cells whereas in mitotic cells the plus-ends binding protein Clip1 and the dynein regulators Lis1 and NudE anchor dynein to astral MT plus-ends.