Les enfants traités pour un médulloblastome cérébelleux peuvent présenter des troubles cognitifs, en particulier de la mémoire de travail, qui entravent les apprentissages et la scolarité. Une meilleure compréhension des bases anatomo-fonctionnelles du cervelet et de son engagement dans la mémoire de travail est essentielle pour minimiser les effets secondaires du traitement et améliorer la qualité de vie des patients. Pour cela, une étude multicentrique française a été conduite.Les objectifs de cette thèse étaient de : (i) mener une étude clinico-radiologique chez les patients en confrontant les résultats des tests neuropsychologiques avec les lésions cérébelleuses macroscopiques identifiées par IRM anatomique; (ii) cartographier par IRMf BOLD l'engagement du cervelet dans la MDT chez les sujets sains ; (iii) cartographier par IRMf BOLD la réorganisation corticale chez les patients lors des mêmes tâches de MDT. Des tâches de n-back ont été utilisées selon un plan factoriel modulant la modalité sensorielle (visuelle ou auditive) et la nature (non-verbale ou verbale) de l'information à mémoriser.L'introduction de cette thèse est une revue exhaustive de la littérature sur les apports des nouvelles méthodes d'IRM dans l'exploration des troubles cognitifs chez les enfants pris en charge pour un médulloblastome cérébelleux.Deux études comparatives cas-témoins multicentriques ont été réalisées chez des sujets droitiers en combinant les données des explorations cliniques, neuropsychologiques et d'imagerie.• La 1ère étude a été conduite sur des IRM 1.5T avec des tâches 1-back. Douze sujets sains et 9 patients ont été inclus mais 4 patients et 4 sujets sains ont secondairement exclus, principalement à cause de mouvements excessifs et de problèmes techniques. Les analyses des IRMf ont donc porté sur 8 sujets sains (4 garçons de 11,11,9 ans) et 5 patients (5 garçons de 11,91,0 ans). • La 2ème étude a été conduite sur des IRM 3T avec des tâches 2-back. Quinze sujets sains et 3 patients ont été inclus mais 6 sujets sains ont été exclus à cause d'une anxiété, une précocité et des problèmes techniques. Les analyses des IRMf ont donc porté sur 9 sujets sains (7 garçons de 11,6±2,2 ans) et 3 patients (1 garçon de 14±0,6 ans).Les résultats montrent :(i) l'existence de troubles de la mémoire de travail visuo-spatiale chez les patients ;(ii) l'existence de lésions macroscopiques du lobe postérieur gauche du cervelet chez les patients ;(iii) l'engagement du lobe postérieur gauche du cervelet lors des tâches de MDT non-verbale et l'engagement du lobe postérieur droit du cervelet lors des tâches de MDT verbale chez les sujets sains ;(iv) l'engagement cérébral (cortex préfrontal, pariétal et temporo-occipital) lors des tâches de MDT chez les patients suggérant l'existence d'une réorganisation corticale.Pour conclure, ce travail souligne l'importance du lobe postérieur gauche du cervelet pour la MDT non-verbale chez les enfants droitiers. Cette information devrait être prise en compte lors de la planification opératoire des enfants opérés pour un médulloblastome cérébelleux. / Children treated for cerebellar medulloblastoma may have cognitive impairment, particularly in working memory, perturbing their school performance.A better understanding of anatomo-functional background of the cerebellum and its involvement in working memory are essential to minimize treatment side effects and to improve the patients' quality of life. A French multicenter study was therefore conducted.The objectives of this thesis were: (i) To conduct a clinico-radiological study in the patients by comparing the neuropsychological data with resected cerebellar lesions identified by anatomical MRI; (ii) To map the involvement of the cerebellum in working memory by fMRI BOLD; (iii) To map cortical reorganization of patients at the same working memory tasks by fMRI BOLD. For this, N-back tasks, following a factorial design modulated in sensory modality (visual or auditory) and in nature of information (verbal or nonverbal) to memorize, were used. In the introduction of this thesis, a comprehensive review of the literature on the contributions of new MRI methods is intended to explore the cognitive disorders in children treated for medulloblastoma.Two comparative case-control phases of this study were performed upon right-handed subjects:• The first study was conducted by 1.5T MRI with 1-back tasks. Twelve healthy subjects and 9 patients were included, but 4 patients and 4 healthy subjects were secondarily excluded, mainly because of excessive movement and technical problems. FMRI analysis was therefore focused on 8 healthy subjects (4 males, 11.1 1.9 year olds) and 5 patients (5 boys, 11.91.0 year olds).• The second study was carried out by 3T MRI with 2-back tasks. Fifteen healthy subjects and 3 patients were included, however, 6 healthy subjects were excluded due to anxiety, precocity and technical problems. FMRI analysis was applied in 9 healthy subjects (7 boys, 11.6±2.2 year olds) and 3 patients (1 boy, 14 ± 0.6 year olds).The results demonstrated: (i) the existence of visuo-spatial WM disorders in the patients; (ii) the existence of macroscopic lesions in the left posterior cerebellar lobe in patients; (iii) the involvement of the left posterior cerebellar lobe during nonverbal WM tasks and the involvement of the right posterior cerebellar lobe during verbal WM tasks in healthy subjects; (iv) the cerebral implication (prefrontal cortex, parietal and temporo-occipital) during WM tasks in the patients suggests the cortical reorganization. To conclude, this work highlights the importance of the left posterior cerebellar lobe in non-verbal WM of right-handed children. This information should be taken into account for the planning procedure in children operated for cerebellar medulloblastoma.

Le médulloblastome, un type hautement agressif de tumeur cérébrale pédiatrique, est l'un des cancers dont le pronostic est le plus sombre dû à la difficulté de s'y attaquer directement et efficacement. L'avenir de la recherche en oncologie repose sur notre capacité à mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la progression d'un néoplasme afin d'identifier les joueurs clés impliqués dans le phénotype invasif tumoral ainsi que de nouvelles cibles nous permettant de tirer profit de ces failles. L'une de celles-ci est la métalloprotéase MMP-9, qui est surexprimée de manière constitutive dans la plupart des cas de cancers et qui contribue fortement au phénomène d'angiogénèse ainsi qu'à la migration invasive des cellules tumorales. Une des voies de signalisation régulant l'expression de la MMP-9 passe par le facteur nucléaire NF-kB, qui est aussi intimement liée à la régulation de COX-2, un médiateur important de l'inflammation dans le microenvironnement tumoral. Sachant que le ciblage pharmacologique de chacune de ces fonctions contribue à la régression tumorale, il apparait pertinent d'évaluer le caractère thérapeutique in vitro de deux agents pharmacologiques, le propranolol ainsi que le lupeol, dont les potentiels anti-tumoraux et anti-inflammatoires respectifs ont été rapportés. Les mécanismes moléculaires à la base de leur activité demeurent cependant peu documentés. Nous avons donc émis l'hypothèse que, premièrement, le propranolol puisse inhiber la sécrétion de MMP-9 indispensable à la cancérogénèse en bloquant la voie de signalisation NF-kB et que, dans un deuxième temps, le lupeol modulerait négativement l'inflammation au site tumoral en bloquant la synthèse de COX-2 possiblement via la voie NF-kB. Pour ce faire, nous stimulerons in vitro la voie de signalisation NF-kB à l'aide d'un agent pro-carcinogène, le PMA, dans un modèle cellulaire tumoral de type DAOY. Les phénotypes invasifs et inflammatoires résultants seront par la suite évalués en réponse aux traitements pharmacologiques. Nos résultats démontrent que le propranolol inhibe l'activation de la voie NF-kB induite par un agent carcinogène de manière dépendante de la dose, diminuant conséquemment la sécrétion de MMP-9. Le mécanisme de notre agent affecte aussi deux autres voies de signalisation cruciales à la cancérogénèse, soit la voie des MAPK et de PI3K/AKT, sans toutefois induire l'apoptose des cellules traitées. Notre seconde hypothèse s'est cependant avérée inexacte puisque, bien que le lupeol module effectivement la voie NF-kB et l'expression de COX-2, elle le fait à la hausse en synergie avec notre agent carcinogène, le PMA. Ces recherches nous ont par contre permis de comprendre une nouvelle modulation du lupeol dans notre modèle néoplasique et d'analyser l'axe de signalisation MT1-MMP, dont la contribution était suspectée, à l'inflammation. De plus, nous avons associé une autre partie du mécanisme moléculaire du lupeol via l'expression de la protéine chaperonne HuR indispensable à la stabilisation du transcrit primaire de MMP-9. En conclusion, nous avons démontré un nouvel axe signalétique par lequel ces agents pharmacologiques affectent le développement tumoral. Ces données dénotent l'importance de cibler la voie NF-kB afin d'atténuer à plusieurs niveaux le phénotype tumoral et proposent l'implication de cibles thérapeutiques originales telles que les récepteurs β-adrénergiques dans la cancérogénèse. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Médulloblastome, MMP-9, NF-kB, propranolol, récepteurs β-adrénergiques, COX-2, inflammation, lupeol

Le médulloblastome est la plus fréquente des tumeurs pédiatriques malignes du cerveau et est divisé en quatre sous-groupes moléculaires. Le groupe Sonic Hedgehog (SHH), caractérisé par l’activation de la voie SHH, présente une surexpression du facteur de transcription basique hélice-boucle-hélice Atoh1. Atoh1 est essentiel pour le développement du cervelet et plus spécifiquement pour la formation des précurseurs des cellules granulaires, qui sont aussi la cellule d’origine du médulloblastome SHH. Dans le médulloblastome SHH, Atoh1 agit comme un facteur pro-tumoral en collaboration avec la voie SHH. De plus, l’inhibition des niveaux protéiques d’Atoh1 inhibe la prolifération tumorale in vitro et in vivo. Etant donnée l’importance de la protéine Atoh1 dans la formation du médulloblastome SHH, Atoh1 pourrait être une cible thérapeutique potentielle pour traiter le médulloblastome SHH. Cependant, les mécanismes de régulation d’Atoh1 sont encore mal connus.Les modifications post-traductionnelles sont connues pour réguler les niveaux protéiques dans les cellules. Plusieurs types de modifications régulent la dégradation protéique et elles incluent l’ubiquitination et la phosphorylation. Nous avons décidé de nous concentrer dans un premier temps sur le rôle potentiel de la phosphorylation d’Atoh1 sur sa fonction et régulation durant le développement du cervelet et la formation de médulloblastome.Par une analyse de spectrométrie de masse, nous avons identifié douze sites de phosphorylation sur la protéine Atoh1. Parmi ces douze sites, seulement deux, la sérine 328 (S328) et la sérine 339 (S339), sont importantes pour la stabilité et la fonction de la protéine. En effet, les deux mutants de phosphorylation spécifiques de ces deux sites, Atoh1-S328A et Atoh1-S339A, ont une demi-vie plus longue ainsi qu’une activité transcriptionnelle augmentée dans les précurseurs des cellules granulaires par rapport à la forme sauvage d’Atoh1. Nous avons ensuite réalisé une purification d’affinité en tandem différentielle suivie par une analyse par la technologie d’identification protéique multidimensionnelle (MudPIT) pour définir les partenaires phospho-spécifiques d’Atoh1. Nous avons découvert que l’ubiquitine ligase E3 Huwe1 est responsable de la dégradation d’Atoh1 de manière phospho-dépendante dans les progéniteurs des cellules granulaires. Nous avons aussi montré que SHH protège Atoh1 de la dégradation médiée par Huwe1 par l’intermédiaire des phosphatases de la famille des PP2A. De manière importante, ce mécanisme de régulation d’Atoh1 est nécessaire au bon développement du cervelet. De plus, dans le contexte tumoral, un faible niveau d’ARNm d’HUWE1 est associé à une mauvaise survie chez les patients ayant un medulloblastome SHH.Au vu de ces résultats, nous souhaitons étudier plus en détail le rôle de la phosphorylation d’Atoh1 ainsi que la contribution de ce nouveau mécanisme dans le médulloblastome. Nous souhaiterions ainsi exploiter nos résultats pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le médulloblastome SHH. / Medulloblastoma (MB) is the most common pediatric malignant brain tumor and is divided in four subgroups by gene profiling. The well-known subgroup harboring an activation of the Sonic Hedgehog (SHH) pathway shows an upregulation of the proneural basic helix-loop-helix transcription factor Atoh1. Atoh1 is essential for cerebellum development and more specifically for the formation of the granule neuronal progenitors (GNPs), which are the cells of origin of SHH induced MB. In tumoral context, Atoh1 acts as a pro-tumor factor in cooperation with SHH pathway. In addition, the inhibition of Atoh1 protein level prevents MB proliferation in vitro and in vivo. Thus, given the strong implication of Atoh1 protein in MB formation, Atoh1 seems to be a potential therapeutic target to treat SHH MB. However, up to date, mechanisms underlying its regulation remain to be elucidated. Posttranslational modifications are known to regulate protein levels in cells. Several modifications regulate protein turnover including the two most prominent, ubiquitination and phosphorylation. We decided to focus primarily our study on a potential role of Atoh1’s phosphorylation on its function and regulation both during cerebellar development and MB genesis. Using mass spectrometry analysis, we identified twelve phosphorylation sites on Atoh1 protein. Among them, only two, the serine 328 (S328) and serine 339 (S339), were critical for Atoh1 stability and function. The two single phospho-deficient mutants, Atoh1-S328A and Atoh1-S339A, displayed a longer half-life and increased transcriptional activity in granule neuron progenitors when compared to the wild-type form of Atoh1. Next, we employed differential tandem affinity purification followed by Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT) analysis to define Atoh1 phospho-specific partners. We uncovered that the E3 ubiquitin ligase Huwe1 is responsible for Atoh1 degradation in a phospho-dependent manner in granule neuron progenitors. We also discovered that SHH protects Atoh1 against its degradation mediated by Huwe1 through the phosphatases of PP2A family. Importantly, this machinery is required for proper cerebellar development and we highlighted that low levels of HUWE1 are associated with a poor prognosis in patient harboring a SHH medulloblastoma.Given this data, we wish to dissect the role of Atoh1 phosphorylation, and the contribution of this new pathway in MB. We anticipate exploiting our findings to develop new therapeutic strategies in SHH MB.

Le facteur de transcription à homéodomaine Otx2 est essentiel au développement du système nerveux, et en particulier du cervelet, où il est exprimé dans les précurseurs des neurones granulaires (PCGs). Au cours du développement, les PCGs passent par des périodes prolifératives très intenses qui les exposent à la transformation tumorale. Ces cellules seraient ainsi à l’origine de la formation des cancers du cervelet, les médulloblastomes (MBs). Une altération génétique particulière est cependant retrouvée dans plus de 75% des MBs : la surexpression d’Otx2. Cette thèse vise à comprendre le rôle d’Otx2 dans le contrôle de la prolifération dans un contexte normal ou tumoral. D’abord, nous avons entrepris d’identifier et d’isoler ces précurseurs à partir de souriceaux, afin d’analyser leur caractéristiques prolifératives. Nos résultats ont montré que les cellules « Otx2+ » contiennent une fraction proliférative plus importante que les cellules « Otx2-». L’analyse du cycle cellulaire des cellules « Otx2+» montre également que ces dernières présentent des propriétés prolifératives distinctes. Ensuite, nous avons mis en oeuvre une approche de gain et de perte de fonction d’Otx2 dans une lignée de MBs exprimant Otx2 (HD-MB03). Nos résultats indiquent que la surexpression d’Otx2 stimule la prolifération de cette lignée, alors que sa perte de fonction la diminue. Enfin, Nous avons identifié par des analyses protéomiques par spectrométrie de masse des partenaires impliqués dans la régulation du cycle cellulaire, en particulier au niveau des phases S et G2M. Ces résultats suggèrent un mécanisme d’action unique d’Otx2 dans la régulation du cycle cellulaire dans le cervelet et les MBs / The homeobox transcription factor Otx2 is essential for the development of the central nervous system. During cerebellum development, Otx2 is expressed by granule cell precursors (GCPs), which have a high proliferation rate. Deregulation of GCPs proliferation may favor oncogenic processes, as seems to occur in medulloblastoma (MB), a malignant and invasive tumor of the cerebellum. A recurrent genetic alteration in medulloblastoma is the overexpression of Otx2 in 75% of the cases. The objective of this thesis is to study the role of Otx2 in the control of proliferation during normal and oncogenic development of the cerebellum. First, we investigated the role of Otx2 in the control of GCPs proliferation. Our results show that Otx2+ GCPs have an increased proliferation rate compared to «Otx2-» GCPs. In the second part of this work, we tested the oncogenic potential of Otx2 using the medulloblastoma cell line HD-MB03. We performed gain and loss of function experiments to analyze the effect of Otx2 expression on the proliferation of this cell line. Our results indicate that the overexpression of Otx2 increases the proliferation rate of HD-MB03 tumor cells. Conversely, Otx2 silencing significantly decreases it. Finally, to shed the light on the mechanism of action of Otx2 in the control of proliferation in cerebellum and medulloblastoma, we analyzed Otx2 protein partners in both cases by mass spectrometry analysis after immunoprecipating Otx2-protein complexes. We identified several protein partners that play an important role in cell cycle regulation, more specifically in S and G2M phases. Our project shows a pro-proliferative effect of Otx2 in cerebellum and medulloblastoma

Le médulloblastome (MB), une tumeur formée à partir du cervelet en développement, est l’un des cancers pédiatriques malins les plus fréquents. Des profils d’expression géniques ont montré l’existence de quatre groupes distincts de MB qui présentent des profils moléculaires et des pronostics différents. Parmi ces groupes, l’un d’entre eux est caractérisé par une activation de la voie de signalisation Sonic Hedgehog (SHH). Ce groupe de MB provient des précurseurs de neurones en grain lors du développement cérébelleux. Les traitements actuels comprennent la chirurgie, la chimiothérapie ainsi que la radiothérapie, ce qui a pour effet d’altérer les capacités cognitives et sociales des survivants. Ainsi, des efforts considérables ont été mis en œuvre dans le but de trouver des cibles thérapeutiques afin de bloquer spécifiquement les mécanismes tumorigéniques sans affecter le développement normal. De récentes analyses à grande échelle ont révélé le rôle crucial de mécanismes épigénétiques, et en particulier dans le groupe SHH, dans lequel la perte de fonction d’un certain nombre de modificateurs chromatiniens a été identifiée. Ainsi, l'objectif principal de ma thèse est d'étudier l'implication de potentiels candidats modificateur chromatinien, à la fois au cours du développement cérébelleux et lors du MB SHH. Nous avons concentré notre étude sur plusieurs modificateurs de la chromatine qui ont été trouvés mutés dans les MB SHH humains. Nous avons commencé l’étude avec trois modificateurs chromatiniens sélectionnés selon (i) leur impact sur la survie, (ii) leur expression au cours du développement du cervelet, (iii) leur expression dans les MB SHH humains et nous sommes finalement concentré sur un.Afin d'étudier ce candidat, un objectif important de ma thèse a été de développer des outils fiables. Dans ce contexte, nous avons développé des modèles de souris knock-out conditionnelles et le système CRISPR-cas9 dans le développement cérébelleux postnatal afin d'étudier l'impact de la perte du candidat à la fois dans le développement du cervelet et dans le MB SHH. Ensuite, nous nous sommes intéressés aux mécanismes moléculaires contrôlés par ce modificateur de la chromatine. Plus précisément, nous avons défini (i) l’interactome, et (ii) des cibles transcriptionnelles spécifiques qui nous ont aidé à comprendre comment une protéine impliquée dans la modification de la chromatine peut favoriser l’état tumoral. En conclusion, ces travaux permettent de mettre en évidence comment la perte de la fonction de modificateur chromatinien spécifique peut différemment affecter le destin cellulaire dans le développement normal cérébelleux et dans le MB SHH et soulève la question d’une prise en charge plus personnalisée des patients atteints de MB SHH. / Medulloblastoma (MB), a tumor arising from the developing cerebellum, is one of the most common malignant pediatric brain tumors. Gene expression profiling showed the existence of four groups of MB with distinct molecular profiles and patient outcomes. Among these groups, one of them is associated with an activation of the Sonic Hedgehog (SHH) pathway.This specific group is thought to arise from cerebellar Granule Neuron Progenitors (GNPs) during cerebellar development. The actual treatment is heavy and consists of surgery, chemotherapy as well as radiotherapy impairing social and cognitive ability of survivors. Thus, considerable effort has been made in order to find drug targets that would specifically block tumorigenic mechanisms without affecting normal development.Recent large scale analysis revealed the crucial role of epigenetic mechanisms, and especially in the SHH group of MB in which loss of function mutation of several chromatin modifiers has been identified. Thus, the main goal of my PhD is to study the involvement of potential candidate chromatin modifiers both during cerebellar development and in SHH MB.We focused our study on several chromatin modifiers that were found mutated in human SHH MB. We began to study three chromatin modifiers that were selected according to (i) their impact on survival, (ii) their expression during cerebellar development, (iii) their expression in human SHH MB and finally we selected one for further functional validation.In order to study this candidate, one important goal of my PhD has been to develop reliable tools. In that context, we developed conditional knock-out mice models and the CRISPR-Cas9 system in postnatal cerebellar development in order to study the impact of the loss of this chromatin modifier both in cerebellar development and SHH MB initiation. Then, we investigated the molecular mechanisms controlled by this chromatin modifier. In particular, we defined (i) the interactome, and (ii) specific target genes that helped us understanding how a protein implicated in chromatin modification can favor tumors. In conclusion, this work provides insights into how the loss of function of a specific chromatin modifier can differentially affect cell fate in the context of normal cerebellar development and in SHH MB, stressing the question of a more personalized patient care.

Pendant le développement du cervelet, les progéniteurs des neurones granulaires (PNG) nécessitent la présence du cil primaire pour proliférer en réponse à Sonic Hedgehog (SHH). En effet, la prolifération dérégulée des PNGs peut conduire à la formation d'une tumeur pédiatrique maligne appelée SHH-médulloblastome (MB), de ce fait comprendre comment le cil primaire est régulé dans les PNGs est crucial.Nous montrons que le facteur de transcription Atoh1 contrôle la présence du cil primaire dans les PNGs in vitro et in vivo. En particulier, la suppression du cil primaire par l’inactivation génétique de gènes impliqués dans la ciliogenèse (par exemple, Kif3a ou Ift88) empêche Atoh1 de maintenir les PNGs en prolifération, ce qui indique qu’Atoh1 favorise l’expansion des PNGs en maintenant la présence du cil primaire. D’un point de vue moléculaire, Atoh1 contrôle la formation du cil primaire en régulant le bon positionnement peri-centrosomal des satellites centriolaires (SC), complexes protéiques essentiels pour la ciliogenèse. L'inactivation de Atoh1 dans les PNGs perturbe en effet la distribution subcellulaire des SCs, altérant ainsi inévitablement la ciliogenèse. Cette nouvelle fonction de Atoh1 est gouvernée par la régulation transcriptionnelle directe d'un composant clé des SCs, Cep131. L’expression ectopique de Cep131 dans les PNGs restore les effets liés à l'inactivation d'Atoh1, rétablissant la localisation correcte du SC et comme conséquence la présence d’un cil primaire.De plus, nous avons montré que cette voie Atoh1-SC-cil primaire-SHH contrôlant la prolifération des PNGs est également conservée dans le contexte du SHH-MB, où Atoh1 est surexprimée et essentielle pour sa formation et sa maintenance.Ces données révèlent un mécanisme par lequel la ciliogenèse est régulée dans des progéniteurs de neurones, offrant de nouvelles informations sur la neurogenèse dans le cervelet et sur la pathogenèse du SHH-MB. / Cerebellar granule neuron progenitors (GNPs) require the primary cilium to proliferate in response to Sonic Hedgehog (SHH) during cerebellar development. As aberrant proliferation of GNPs may lead to SHH-type medulloblastoma (SHH-MB), a pediatric brain tumor, understanding which mechanisms control ciliogenesis in GNPs represents a major interest in the field. Here, we show that the proneural bHLH transcription factor Atoh1 controls the presence of primary cilia in GNPs both in vitro and in vivo, thus maintaining GNPs responsive to the mitogenic effects of SHH. Indeed, loss of primary cilia induced via knockdown of specific ciliary components (e.g. Kif3a and Ift88) abolishes the ability of Atoh1 to keep GNPs in proliferation in vivo. Mechanistically, Atoh1 controls ciliogenesis by regulating the proper peri-centrosomal clustering of centriolar satellites (CS), large multiprotein complexes working as essential machineries for ciliogenesis. Knockdown of Atoh1 in GNPs perturbs CS subcellular distribution, leading to impairment of ciliogenesis. Luciferase reporter assays and chromatin immunoprecipitation experiments indicate that Atoh1 can directly regulate the expression of Cep131, a key CS core component. Importantly, ectopic expression of Cep131 in GNPs depleted of Atoh1, is sufficient to restore proper CS localization and consequent primary cilia formation, indicating that the Atoh1-Cep131-CS axis is responsible for ciliogenesis in GNPs.In addition, we further demonstrated that these functions of Atoh1 are conserved in the context of SHH-MB, where Atoh1 is typically overexpressed and acts as a lineage-dependent transcription factor.These data reveal a mechanism whereby ciliogenesis is regulated in neuron progenitors providing novel insights into cerebellar neurogenesis and pathogenesis of SHH-MB.

Le médulloblastome (MB) est la plus fréquente des tumeurs cérébrales malignes pédiatriques qui représentent la première cause de mortalité par cancer chez l’enfant. Malgré les avancées des nouveaux traitements, les risques de récidive, séquelles et décès après traitement restent importants. Le récepteur de neuropiline-1 (NRP-1) a été récemment impliqué dans la progression tumorale des MBs et semble jouer un rôle important dans le phénotype des cellules souches cancéreuses (CSCs). Le ciblage de cette molécule pourrait ainsi présenter un intérêt thérapeutique dans le traitement des MBs. Nous avons sélectionné des cellules souches de MB capables de former des médullosphères (MS) à partir de 3 lignées cellulaires (DAOY, D283-Med et D341-Med). Ces modèles ont été caractérisés par l’expression de neuropilines (NRP-1 and NRP-2) et de marqueurs phénotypiques (CD133，CD15 et NF-M). Les résultats ont montré une augmentation significative de l’expression de NRP-1 par les cellules cultivées en médullosphères confortant notre stratégie de ciblage. L’impact du traitement de ces cellules par un composé innovant ciblant spécifiquement NRP-1, le MR438, a été ensuite évalué in vitro seul et association avec la radiothérapie notamment sur l’étude de la capacité d’auto-renouvellement des CSCs de MBs. Nous avons mis en évidence une diminution de la capacité d’autorenouvellement des cellules souches de MBs après exposition au MR438 avec une radiosensibilité augmentée pour les 3 modèles cellulaires. In vivo, le composé MR438 a été evalué sur des modèles de xénogreffes hétérotopiques chez la souris nude et montre un effet radiopotentialisant significatif pour les tumeurs issues de la lignée Daoy avec une tendance à la diminution de la progression tumorale pour les 2 autres lignées. De façon intéressante, le composé MR438 induit une diminution significative du nombre de cellules souches pour l’ensemble de nos modèles. Par conséquent, le composé semblerait induire les cellules souches vers un phénotype différencié au moins pour la lignée DAOY, même si les mécanismes n’ont pas pu être clairement élucidé. En conclusion, l’inhibition de NRP-1 via MR438 semble stimuler la différenciation des cellules souches cancéreuses pouvant à terme réduire la progression du MB et apporter un bénéfice en association avec la radiothérapie. L’evaluation du composé sur des modèles orthotopiques de MB permettrait d’obtenir des informations quant à son efficacité sur des modèles plus proche de la physiopathologie tenant compte de sa distribution au niveau cérébral / Medulloblastoma (MB) is the most common malignant pediatric brain tumors which is the leading cause of cancer death in children. Despite the progress of new treatments, the risk of recurrence, morbidity, and death after treatment remain important. The neuropilin-1 receptor (NRP-1) has recently been implicated in tumor progression of MBs, which seems to play an important role in the phenotype of cancer stem cells (CSCs). Targeting this molecule could thus present an interesting therapeutic value in the treatment of MB. We have selected cancer stem like cells of MBs in the form of medullospheres (MSs) from 3 cell lines (DAOY, D283-Med and Med-D341). These models were characterized by expression of neuropilins (NRP-1 and NRP-2) and phenotypic markers (CD133, CD15 and NF-M). Results showed a significant increase of the expression of NRP-1 by our CSCs models cultured in MSs that confirms our targeting strategy. The impact of the treatment of these cells with an innovative compound specifically targeting NRP-1, MR438, was then evaluated in vitro alone and in association with radiotherapy, especially on the study of the capacity for self-renewal. A decrease of self-renewal capacity for MB stem cells after exposition of MR438 with an increase of radiosensitivity for the 3 cell models in vitro was demonstrated. In vivo, MR438 was evaluated on heterotopic xenograft models in nude mice and showed a significant augmentation of radiosensitivity for DAOY tumors with a tendency to decrease tumor progression for the other 2 cell lines. Interestingly, the compound MR438 induced a significant decrease in the number of stem cells for all of our models. The compound appeared to induce CSCs to a differentiated phenotype at least for the DAOY cells, although mechanisms could not be clearly elucidated. In conclusion, inhibition of NRP-1 via MR438 seems to stimulate the differentiation of CSCs that may eventually reduce the progression of MB and bring a benefit in association with radiotherapy. Evaluation of this compound on orthotopic models of MB would provide information on its effectiveness on models closer to the physiopathology taking into account its distribution at the cerebral level

Le médulloblastome est la tumeur du système nerveux central la plus répandue et la plus meurtrière chez l’enfant. Malgré de bons taux de survie globale, le traitement du médulloblastome est confronté à deux problèmes cliniques majeurs: les survivants présentent souvent des séquelles graves et irréversibles causées par les traitements, et certains sous-groupes de la maladie répondent mal au traitement. Dans ce travail, nous avons cherché à traiter les deux problèmes en améliorant l'efficacité/tolérance de la radiothérapie dans des modèles précliniques de médulloblastome grâce à l’utilisation d’AsiDNA, un inhibiteur de la réparation de l'ADN déjà testé dans des essais cliniques. Nous avons caractérisé l'effet des molécules AsiDNA sur la réponse à l’irradiation des cellules tumorales, in vitro et in vivo. Nous avons observé qu'AsiDNA peut pénétrer dans les jeunes cerveaux et des tumeurs cérébrales après administration systémique. Aucune preuve d’augmentation de la toxicité liée à l‘irradiation n’a été observée. De plus, l’addition d'AsiDNA aux doses létales de radiations délivrées dans le cerveau murin en développement semble protéger la toxicité radio-induite. Nos résultats démontrent que la combinaison d'AsiDNA avec l’irradiation augmente la survie des animaux greffés avec un modèle de médulloblastome sur le flanc ou dans le cervelet. Les analyses de transcriptome indiquent qu’AsiDNA amplifie les modifications de la transcription induites par les radiations d’une manière similaire à une augmentation de dose. Ses effets sont indépendants de la cellule d'origine ou du statut de TP53. Les données obtenues suggèrent qu’AsiDNA est une drogue qui pourrait potentiellement améliorer la prise en charge des enfants ayant des tumeurs cérébrales et leur qualité de vie. / Medulloblastoma is the most common central nervous system malignancy in pediatric oncology. Despite good overall survival rates, medulloblastoma treatment plans face two major clinical problems: survivors of medulloblastoma often present severe and irreversible sequela caused by the treatments and, certain subgroups of the disease will respond poorly to the treatments. In this work we aimed at tackling both clinical issues by improving radiotherapy efficacy in medulloblastoma preclinical models using a DNA repair inhibitor in clinical trials, AsiDNA. We have characterized the effect of AsiDNA in combination with radiation in vitro and in vivo studies. We have observed that AsiDNA can penetrate young brains and brain tumors through systemic delivery. No evidences of additional radiation-associated brain toxicity were observed. In addition, combination of AsiDNA treatments to lethal doses of radiation delivered in developing murine brain seem to protect from the radiation-induced toxicity. Our results show that the combination of AsiDNA to radiation improves survival of subcutaneous and orthotopic models of medulloblastoma. Transcriptome analysis on medulloblastoma cell lines indicate that AsiDNA intensifies the transcriptional response to radiation resembling the increase in radiation doses. This effect is independent of the cell of origin or TP53 status of the cells. The obtained results indicate that AsiDNA may be a good candidate to improve the efficacy of treatment protocols and quality of life of medulloblastoma patients.

Les facteurs de transcription de la famille MAF sont impliqués d’une part au cours du développement dans des processus de différenciation terminale et d’autre part dans la carcinogenèse. Un découplage fonctionnel est observé. En effet, les gènes cibles mis en jeu au cours des processus cancéreux et de différenciation terminale semblent différents. L'activité oncogénique des protéines MAF dépend du contexte cellulaire. Ainsi, il a été proposé qu'elles exercent leur activité oncogénique dans des tissus où elles ne sont pas exprimées normalement. De plus, leur pouvoir transformant est régulé par phosphorylation. Mon travail de thèse a porté sur le rôle oncogénique de ces protéines en étudiant ces deux aspects. J'ai identifié le rôle oncogénique de NRL, un membre de la famille MAF, dans le Médulloblastome et j'ai étudié la régulation par phosphorylation des MAF dans le Myélome Multiple. L’activité oncogénique du facteur de transcription NRL, connu pour son rôle dans la différenciation terminale d’un type cellulaire de la rétine, n’avait jamais été établie. Alors que NRL n'est pas exprimé dans le cervelet sain, des études de transcriptome ont montré que NRL est surexprimé dans un sous-groupe agressif de médulloblastome, une tumeur pédiatrique du cervelet. J’ai montré pour la première fois que NRL est un oncogène. Il participe directement à la carcinogénèse de médulloblastomes, en protégeant les cellules de l’apoptose, à travers la régulation d’un membre anti-apoptotique de la famille BCL, BCL-XL. L’inhibition des protéines BCL pourrait constituer une stratégie thérapeutique potentielle dans des Médulloblastomes de mauvais pronostic et résistants aux traitements classiques.Au sein du laboratoire, un projet, auquel j’ai participé, a porté sur la régulation de l’activité oncogénique des facteurs de transcription MAF, dans des Myélomes Multiples, de mauvais pronostic. Ce travail établit que l’activité oncogénique de deux membres de la famille MAF, MAFB et c-MAF, est régulée par phosphorylation induite par la Ser/Thr kinase GSK3. La phosphorylation des facteurs de transcription MAF augmente leur activité oncogénique et paradoxalement induit leur dégradation par le protéasome. Ce travail a permis d’identifier un mécanisme de résistance potentiel de ces tumeurs et de proposer une nouvelle approche thérapeutique, basée sur l’inhibition de la phosphorylation des protéines MAF. / MAF (MusculoAponeurotic Fibrosarcoma) transcription factors are involved in terminal differentiation during normal development, and also in oncogenesis. A functional uncoupling is observed between these two functional activities. Indeed, target genes involved in cancer or terminal differentiation look different. The oncogenic activity of MAF proteins is dependent on the cellular context. Thus, it was suggested that they exert their oncogenic activity in tissues where they are not normally expressed. In addition, their transforming ability is regulated by phosphorylation. My work focused on the oncogenic role of these proteins by studying these two aspects. I identified the oncogenic role of NRL, a member of the MAF family in Medulloblastoma and I studied the regulation by phosphorylation of MAF in Multiple Myeloma.The oncogenic activity of the transcription factor NRL, known for its role in the terminal differentiation of a cell type in the retina, has never been established. While NRL is not expressed in the healthy cerebellum, transcriptome studies showed that NRL is overexpressed in an aggressive subgroup of medulloblastoma, a pediatric tumor of the cerebellum. I showed for the first time that NRL is an oncogene. NRL is directly involved in the carcinogenesis of medulloblastoma, protecting cells from apoptosis through regulation of an anti-apoptotic member of the BCL family, BCL-XL. Inhibition of the protein BCL could be a potential therapeutic strategy for medulloblastoma with a poor prognosis and resistant to conventional therapies.In the laboratory, I also participated in a project which focused on the regulation of the oncogenic activity of transcription factors, MAF, in rarely curable multiple myeloma. This work establishes that the oncogenic activity of two MAF members, MAFB and c-MAF, are regulated by phosphorylation-induced Ser/Thr kinase GSK3. Phosphorylation of transcription factors MAF increases their oncogenic activity and paradoxically induces their degradation by the proteasome. This work has identified a potential mechanism of resistance of these tumors providing a new therapeutic approach, based on the inhibition of MAF protein phosphorylation.

Le médulloblastome est une des tumeurs les plus fréquentes du système nerveux central chez l’enfant. Son impact clinique, ainsi que les effets secondaires engendrés par les traitements actuels, sont significatifs en matière de morbidité et de mortalité. La caractérisation moléculaire des tumeurs du système nerveux central a grandement évolué, et ce, particulièrement en ce qui concerne le médulloblastome. Des travaux antérieurs ont permis d’établir qu’un des sous-groupes de médulloblastome est caractérisé par l’activation de la voie sonic hedgehog. La mutation la plus fréquente menant à ce sous-type de médulloblastome est la mutation du gène suppresseur de tumeur PTCH1. Grâce au modèle de souris Ptch1+/-, des données issues de notre laboratoire ont permis de caractériser le développement de cette tumeur comme étant en deux étapes. Ce travail porte sur la caractérisation du mécanisme par lequel cette première étape, soit la perte d’hétérozygotie de Ptch1, survient. Tout d’abord, nous revisitons le rôle in vivo du corécepteur Boc dans la tumorigenèse. Selon nos résultats, la modulation de Boc ne semble pas avoir un impact significatif sur le développement tumoral dans des expériences de transplantation orthotopiques. Ensuite, nous démontrons que le ligand Shh augmente le dommage à l’ADN, ce qui mène à une hausse des évènements de recombinaisons qui peuvent causer une perte d’hétérozygotie. Nous tentons de moduler l’activité de Rad51 en observant une tendance non statistiquement significative des évènements de recombinaison avec des inhibiteurs de Rad51. Nous démontrons ensuite qu’un inhibiteur de Cdc7 permet la diminution des évènements de recombinaisons ainsi qu’une diminution du stress réplicatif de l’ADN. En intervenant sur le gène Mcm2 grâce à un modèle de souris transgénique, nous parvenons à prouver qu’une diminution de l’action de Mcm2 permet une diminution du stress réplicatif de l’ADN. En somme, la première étape du développement du médulloblastome sonic hedgehog-activé est la perte d’hétérozygotie de Ptch1. Celle-ci est caractérisée par une augmentation du dommage à l’ADN engendrant une hausse des évènements de recombinaison. Plusieurs cibles potentielles de modulation s’avèrent prometteuses pour un éventuel traitement ciblé. / Medulloblastoma is one of the most common central nervous system tumors of the child. Its clinical impact, as well as the adverse effects caused by current treatments, are significant in terms of morbidity and mortality. The molecular characterization of tumors of the central nervous system has greatly evolved, particularly in the case of medulloblastoma. Previous work has established that one of the medulloblastoma sub-groups is characterized by the activation of the sonic hedgehog (Shh) pathway. The most common mutation leading to this medulloblastoma subtype is the PTCH1 tumor suppressor gene mutation. Working with the Ptch1+/- mouse model, data from our la-boratory characterized the medulloblastoma tumorigenesis as a two-step process. This work focuses on the characterization of the mechanism by which this first step, the loss of heterozygosity of Ptch1, occurs. First, we revisit the in vivo role of the Boc coreceptor in the medulloblastoma tumor-igenesis. According to our results, Boc modulation does not seem to have a significant impact on tumor development. Next, we show that the Shh ligand increases DNA dam-age. This leads to an increase in recombination events which predispose to loss of het-erozygosity. We attempt to modulate Rad51 activity and observe a non-statistically sig-nificant trend to decrease recombination events with Rad51 inhibitors. We then demonstrate that Cdc7 inhibition reduces recombination events as well as DNA replica-tive stress. Using an Mcm2 transgenic mouse model, we demonstrate that a reduction in the action of Mcm2 reduces DNA replicative stress. To conclude, the first step in the development of Shh-activated medulloblastoma is the loss of heterozygosity of Ptch1. This is characterized by an increase in DNA damage leading to an increase in recombination events. Several potential modulation targets hold promise for possible targeted therapy.