The major objective of our group is to understand the mechanism of DNA damage induced by secondary low-energy electrons (LEE) arising from ionizing radiation and its relationship to radiosensitization and radiotherapy. Prof. Sanche has developed a novel low-energy electron irradiation system in which a relatively large area of thin films of DNA constituents can be irradiated with mono-energetic electrons under ultra high vacuum. This permits the irradiation of target DNA and the formation of sufficient degraded material to allow for chemical analysis (HPLC, GC/MS, and LC/MS/MS) of products remaining on the target surface, so as to elucidate the mechanism of LEE-induced DNA damage. My project focuses on simple systems, in which small DNA components nucleosides (dThd), nucleotides (pT, Tp, pTp), oligonucleotides (TT and TTT) and modified oligonucleotides (T5BrUT) are exposed to low-energy electrons, and the subsequent reactions are studied by chemical analysis of the products. My studies revealed three mechanisms of LEE-induced fragmentation reactions in DNA: 1) the terminal phosphate group has a larger cross-section in LEE-induced DNA damage; 2) initial LEE capture and subsequent bond breaking within the intermediate anion depend on the sequence and electron affinity of the bases; and 3) at 10 eV, one electron might induce double events. This study provides a chemical basis for the formation of DNA strand breaks by the interaction of LEE with DNA.

Le traitement concomitant de radiothérapie et de chimiothérapie a amélioré le taux de survie des patients atteints du cancer. Le cisplatine est un des agents chimiothérapeutiques les plus utilisés, mais les mécanismes d'interaction avec la radiation demeurent toujours inconnus. Puisqu'une grande partie de la cellule est constituée d'eau, l'effet indirect de la radiation est alors important. Parmi les radicaux issus de la radiolyse de l'eau, l'électron hydraté est estimé incapable de générer des cassures de brin à l'ADN. Cependant, la modification structurelle et chimique de l'ADN par le cisplatine peut favoriser la cassure de brins. L'étude présentée dans cette thèse a pour but de comprendre le mécanisme d'interaction entre les électrons hydratés et l'adduit de cisplatine-oligonucléotide. Pour cela, différents types d'oligonucléotides contenant une ou deux guanines, soit le site d'attachement du cisplatine, sont utilisés. Cette interaction induit un détachement de l'adduit de cisplatine de l'ADN plutôt que des cassures de brin. Des dommages aux bases de l'ADN ont été observés et quantifiés par chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC). Les résultats montrent une augmentation des dommages aux bases de l'ADN en présence de cisplatine, soit aux guanines ainsi qu'aux sites qui ne sont pas les sites d'attachement de cisplatine. La constante de vitesse de la réaction des électrons hydratés avec le complexe d'oligonucléotide-cisplatine a été mesurée par la technique de radiolyse pulsée. Les résultats montrent une augmentation de cette constante en présence de cisplatine par rapport au cas d'un oligonucléotide en absence de cisplatine.

Puisque l'utilisation des pesticides augmente dans la pratique agricole (Gorse, 2015), il est inévitable que nous allons retrouver ces contaminants dans l'eau de surface qui se trouve à proximité des zones d'épandage. Il est certain que les pesticides ont plusieurs manières d'affecter notre organisme. Cependant, l'effet de ces pesticides sur les différents mécanismes cellulaires est peu étudié. En effet, il est connu que certains pesticides permettent l'activation de gènes régulés par le récepteur à l'hydrocarbure d’aryle (AhR), mais il n'y a peu de documentation par rapport à leur effet sur les dommages à l'ADN. De plus, ces pesticides sont la plupart du temps utilisés en combinaison lors de leur utilisation agricole, mais il n'y a quasiment aucune étude qui est faite sur leurs effets lorsqu'ils sont en combinaison. Ainsi, mon projet de maîtrise se base sur l'hypothèse que certains contaminants présents dans l’environnement ainsi que dans les eaux de surface peuvent, à court et à long terme, perturber deux voies cellulaires, soit celle du récepteur à l'hydrocarbure d’aryle et celle de p53. Pour la première partie de mon projet, je me suis intéressée principalement aux gènes CYP1A1 et CYP1B1, deux enzymes impliquées dans le métabolisme de ces contaminants environnementaux dont l'expression est régulée par AhR. L'activation de ces deux gènes a été mesurée suite à un traitement avec différents ingrédients actifs seuls à haute concentration ou en combinaison à faible concentration. Nous avons démontré que chacun des ingrédients actifs séparément permettent l'activation d’AhR. En plus, lorsque nous les combinons, nous observons une activation synergique d’AhR pour la plupart des combinaisons. Ainsi, leur effet en combinaison est beaucoup plus grand que celui qu'ils ont lorsqu'ils sont seuls. Nous avons aussi déterminé que les pesticides seuls ainsi que les combinaisons permettaient l'observation de l’interaction croisée entre AhR et le récepteur à l'oestrogène (ER[alpha]). Pour la deuxième partie de mon projet, j'ai vérifié si les pesticides utilisés à haute concentration ainsi que les différentes combinaisons à faible concentration entraînent l’activation du point de contrôle des dommages à l’ADN. Le carbaryl, le linuron et le bromoxynil sont les trois seuls pesticides permettant l’activation de ce point de contrôle à haute concentration. Toutes les combinaisons de pesticides à faibles concentrations ne permettent pas l’activation de ce point de contrôle. Ainsi, tous les pesticides testés à haute concentration permettent l’activation d’AhR, mais seulement certain d’entre eux permettent l’activation du point de contrôle des dommages à l’ADN. Cela montre donc que les pesticides ont plusieurs cibles dans la cellule et que selon le pesticide étudié, les cibles changent. La dernière partie de mon projet consistait à vérifier l’impact sur AhR des contaminants environnementaux présent dans la rivière Saint-François le 26 septembre 2016 sur AhR. Les contaminants ont été extraits et concentrés avant d'être testés sur des cellules en culture. Les contaminants présents dans l'eau de rivière permettent l'activation d’AhR. En conclusion, mes études permettent de mieux comprendre l'effet de ces cinq pesticides sur ces deux mécanismes cellulaires. Des études plus approfondies sont nécessaires afin de comprendre l'ensemble des mécanismes affectés par ces pesticides

Il a été démontré que les électrons de basse énergie (EBE) peuvent induire des cassures simple brin (CSB) à l'ADN, via la formation d'anions transitoires qui décroissent par attachement dissociatif, ou dans d'autres états électroniques dissociatifs menant à la fragmentation. Afin d'effectuer une étude complète des effets des électrons de basse énergie sur la matière biologique, il est nécessaire de comprendre leur mécanisme d'interaction non seulement avec l'ADN, mais avec les constituants de son environnement. Les histones sont une composante importante de l'environnement moléculaire de l'ADN. Leur charge positive leur permet de s'associer aux groupements phosphate anionique de l'ADN. Le rôle principal de ces protéines basiques consiste à organiser l'ADN et l'empaqueter afin de former la chromatine. Les cations sont une autre composante importante de la cellule; ils jouent un rôle dans la stabilisation de la conformation B de l'ADN in vitro par leurs interactions avec les petits et grands sillons de l'ADN, ainsi qu'avec le groupement phosphate chargé négativement. Avec les histones, ils participent également à la compaction de l'ADN pour former la chromatine. Cette étude a pour but de comprendre comment la présence d'ions organiques (sous forme de Tris et d'EDTA) à proximité de l'ADN modifie le rendement de cassures simple brin induit par les électrons de basse énergie. Le Tris et l'EDTA ont été choisis comme objet d'étude, puisqu'en solution, ils forment le tampon standard pour solubiliser l'ADN dans les expériences in vitro (10mM Tris, 1mM EDTA). De plus, la molécule Tris possède un groupement amine alors que l'EDTA possède 4 groupements carboxyliques. Ensemble, ils peuvent se comporter comme un modèle simple pour les acides aminés. Le ratio molaire de 10 :1 de Tris par rapport à l'EDTA a pour but d'imiter le comportement des histones qui sont riches en arginine et lysine, acides aminés possédant un groupement amine chargé positivement additionnel. Des films d'ADN de différentes épaisseurs, possédant entre 0 et 32 ions organiques/ nucléotide, ont été irradiés avec des électrons de 10eV. Les dommages induits par les électrons, sous forme de cassures, ont été détectés par électrophorèse. Nous avons démontré que le rendement de cassure simple brin diminuait de façon dramatique en fonction du nombre d'ions organiques/ nucléotide. Aussi peu que 2 ions organiques/ nucléotide sont suffisant pour décroître le rendement de SSB de 70%. Cet effet radioprotecteur est en partie expliqué par l'augmentation de l'épaisseur des films, mais surtout par la modification du champ électrique à proximité de l'ADN, due à l'ajout de molécules chargées positivement. La modification du champ électrique près de l'ADN altère les paramètres de résonance comme le temps de vie de l'anion transitoire et la limite de dissociation, qui influent directement sur la section efficace d'attachement dissociatif. L'effet protecteur peut également être expliqué par la restauration des bases anioniques déshydrogénées induites par l'attachement dissociatif de l'électron sur une base (G(-H)[indice supérieur -]). Ce sont les molécules Tris qui, en transférant un atome d'hydrogène ou un proton, restaurent les bases déshydrogénées et inhibent par le fait même la formation de cassures simple brin. Ces résultats indiquent que les histones peuvent également participer à la réparation de dommages précoces induits à l'ADN avant qu'elles ne mènent à des dommages encore plus nocifs et difficiles à réparer, comme les cassures simples brins.

Parmi les dommages de l'ADN, la cassure double-brin (CDB) constitue la lésion la plus toxique, puisqu'une seule CDB non réparée ou réparée de façon incorrecte peut conduire à la mort cellulaire. Cette toxicité est justement exploitée en clinique pour éradiquer les cellules tumorales. Parmi l'arsenal des molécules utilisées en chimiothérapie, les poisons de topoisomérase I (TOPO1), tel que la camptothécine (CPT), sont capables d'induire un type particulier de CDBs à une seule extrémité, générées lors de la collision entre la fourche de réplication et la TOPO1 bloquée sur l'ADN. Ces cassures sont réparées par recombinaison homologue (RH) puisqu'en absence de seconde extrémité, elles ne peuvent être substrats de la jonction d'extrémités non homologues (JENH) qui, pour ligaturer en nécessite deux. L'hétérodimère Ku, initiateur de la JENH est à la fois un détecteur majeur des CDBs de par son abondance nucléaire et sa forte affinité, et un puissant inhibiteur de la RH. Ainsi, pour la compréhension des mécanismes déterminants le choix de la voie de réparation adaptée à chaque type de CBD, la régulation de la liaison de Ku aux CDBs à une extrémité est donc une question cruciale. Dans ce contexte, mon premier projet de thèse a concerné la compréhension moléculaire du choix de la voie de réparation des CDBs à une extrémité. Par une technique de microscopie à haute résolution, j'ai d'abord montré que l'hétérodimère Ku et son partenaire la DNA-PKcs sont rapidement recrutés au niveau de ces dommages dans l'ADN de cellules humaines. J'ai ensuite démontré que grâce à la phosphorylation de CtIP par ATM et à l'action coordonnée des activités nucléases de MRE11 et CtIP, Ku est relargué des CDBs à une extrémité. La dissociation de la DNA-PKcs des CDBs à une extrémité dépend de sa phosphorylation par ATM au niveau du cluster ABCDE. A l'aide d'un mutant non phosphorylable de ce cluster, j'ai montré que le défaut de dissociation de la DNA-PKcs prévient le relargage de l'hétérodimère Ku dépendant de MRE11. Mes travaux suggèrent toutefois l'existence d'une voie additionnelle pouvant éliminer Ku de plus 50% des CDBs à une extrémité. Enfin, j'ai démontré que la persistance de Ku et de la DNA-PKcs aux extrémités de la cassure ne perturbe ni la résection longue distance ni la formation de filament de RAD51 mais compromet la survie cellulaire. Mon second projet de thèse a consisté à perturber les mécanismes contrôlant le choix de la voie de réparation des CDBs dans le but de potentialiser l'effet de la CPT. Comme l'inhibition d'ATM induit une sensibilisation dramatique des cellules en réplication à la CPT, il devrait être possible d'identifier d'autres sensibilisateurs à la CPT qui désorganiseraient la réparation des CDBs à une extrémité. Sur la base d'un test de cytotoxicité, j'ai réalisé un criblage phénotypique de la chimiothèque du NIH et identifié un antibiotique, la nitrofurantoïne (NTF) et l'hydrocortisone acétate (HCA) capables de potentialiser l'effet de la CPT. Si la sensibilisation par la NTF semble plutôt associée à la génération d'espèces oxygénées réactives (ROS) par nitroréduction de la molécule, celle induite par l'HCA n'a pas été reproduit et est toujours en cours d'investigation. Mes travaux de thèse contribuent à la compréhension des mécanismes du choix de la voie de réparation impliqués dans la tolérance des cellules à la CPT et ouvrent des perspectives de ciblage pour potentialiser son pouvoir anti-cancéreux. / DNA double-strand break (DSB) is the most toxic DNA damage, because a single mis- or un-repaired DSB can lead to cell death. This toxicity is exploited in clinics to eradicate tumoral cells. So, among molecules currently used in chemotherapy, topoisomerase 1 (TOPO1) poisons such as camptothecin (CPT), are able to generate a particular type of DSB bearing one single end (seDSBs); these lesions are created when a replication fork collides with the TOPO1 blocked on the DNA. They are repaired by homologous recombination (HR) because, devoid of a second end, they cannot be ligated by non-homologous end-joining (NHEJ). The Ku heterodimer, the initiator of the NHEJ is both a major detector of the DSBs due to its nuclear abundance and strong affinity, and a powerful HR inhibitor. Therefore, the regulation of Ku binding to one-ended DSB is a crucial question for the understanding of mechanisms determining the choice of the suitable DSB repair pathway. In this context, my first thesis project aimed at deciphering the molecular mechanisms responsible for the DNA repair pathway choice at seDSBs. Firstly, using High Resolution Microscopy, I demonstrated that Ku and DNA-PKcs are rapidly recruited on seDSBs. Then, I showed that ATM-dependent phosphorylation of CtIP and the epistatic and coordinated actions of MRE11 and CtIP nuclease activities are required to limit the stable loading of Ku on seDSBs. I established that DNA-PKcs removal from seDSBs relies on ATM-dependent phosphorylation of the ABCDE cluster. Using a non-phosphorylable mutant of this cluster, I demonstrated that impaired DNA-PKcs removal prevents MRE11 from releasing Ku. However, my work also suggested the existence of an additional mechanism that contributes to prevent Ku accumulation at 50% of seDSBs. Finally, I demonstrated that Ku and DNA-PKcs persistence on seDSBs does not impair long range resection and RAD51 recruitment but compromises cell survival. My second thesis project was dedicated to target the DSB repair pathway choice mechanisms in order to potentiate the effect of CPT. Indeed, since ATM inhibition increases drastically the death of replicative cells treated with CPT, we may identify others sensitizers able to disrupt the repair pathway choice. On the basis of a cytotoxicity assay on mouse embryonic fibroblasts (MEFs), I performed a phenotypic screening of the NIH Clinical Collection and identified the antibiotic nitrofurantoin (NTF) and hydrocortisone acetate (HCA) as a sensitizer of MEFs to CPT. However, sensitization induced by NTF does not depend on Ku but rather seems to rely on Reactive Oxygen Species (ROS) generation by nitroreduction of the molecule and sensitization induced by HCA is not reproducible and is still under investigation. My work contributes to extend the knowledge of the repair pathway choice mechanisms involved in cell tolerance to CPT and opens new opportunities to potentiate its anticancerous property.

Ce mémoire est présenté à la Faculté de médecine et des sciences de la santé de l'Université de Sherbrooke en vue de l'obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.) en radiobiologie (2009). Un jury a révisé les informations contenues dans ce mémoire. Il était composé de professeurs de la Faculté de médecine et des sciences de la santé soit : Darel Hunting PhD, directeur de recherche (département de médecine nucléaire et radiobiologie), Léon Sanche PhD, directeur de recherche (département de médecine nucléaire et radiobiologie), Richard Wagner PhD, membre du programme (département de médecine nucléaire et radiobiologie) et Guylain Boissonneault PhD, membre extérieur au programme (département de biochimie). Le 5-bromodéoxyuridine (BrdU), un analogue halogéné de la thymidine reconnu depuis les années 60 comme étant un excellent radiosensibilisateur. L'hypothèse la plus répandue au sujet de l'effet radio sensibilisant du BrdU est qu'il augmente le nombre de cassures simple et double brin lorsqu'il est incorporé dans l'ADN de la cellule et exposé aux radiations ionisantes. Toutefois, de nouvelles recherches semblent remettre en question les observations précédentes. Ces dernières études ont confirmé que le BrdU est un bon radiosensibilisateur, car il augmente les dommages radio-induits dans l'ADN. Mais, c'est en étant incorporé dans une région simple brin que le BrdU radiosensibilise l'ADN. Ces recherches ont également révélé pour la première fois un nouveau type de dommages produits lors de l'irradiation de l'ADN contenant du BrdU : les dimères interbrins. Le but de ces travaux de recherche est de déterminer si la présence de bromodéoxyuridine dans l'ADN augmente l'induction de bris simple et / ou double brin chez les cellules irradiées en utilisant de nouvelles techniques plus sensibles et spécifiques que celles utilisées auparavant. Pour ce faire, les essais comètes et la détection des foci H2AX phosphorylée pourraient permettre d'établir les effets engendrés par le BrdU au niveau cellulaire. Notre hypothèse (basée sur des résultats préliminaires effectués dans notre laboratoire) est que l'irradiation de l'ADN cellulaire en présence de BrdU augmentera le nombre de bris simple brin sans toutefois augmenter le nombre de bris double brin. Les résultats présentés dans ce mémoire semblent corroborer cette hypothèse. Les nouvelles méthodes d'analyse, soient l'essai comète et la détection des foci [gamma]-H2AX remettent en question ce qui a été dit sur le BrdU au sujet de l'induction des cassures double brin depuis plusieurs années. L'ensemble de ces nouveaux résultats effectué à l'aide de cellules ayant incorporées du BrdU sont en corrélation avec de précédents résultats obtenus dans notre laboratoire sur des oligonucléotides bromés. Ils réaffirment que l'irradiation combinée au BrdU augmente l'induction de bris simple brin mais pas de bris double brin. L'investigation approfondie des mécanismes d'action non élucidés du BrdU au niveau cellulaire et son utilisation à des moments stratégiques pendant le traitement de radiothérapie pourraient accroître son efficacité à des fins d'utilisation clinique.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La presbyacousie est une perte de l'audition liée au vieillissement qui représente la troisième maladie chronique la plus répandue chez les personnes âgées. À ce jour, il est admis que le stress oxydant peut causer des dommages irréversibles à l'ADN et entraîner une sénescence prématurée dans les cellules en cycle. Cependant, il n'existe aucune donnée concernant le rôle des dommages de l'ADN dans la dégénérescence des cellules cochléaires liée à l’âge. En plus le lien entre le stress oxydant, les dommages à l'ADN et le vieillissement des cellules cochléaires demeure obscure.Le premier objet de ce travail était d'élucider le rôle des dommages de l'ADN dans la dégénérescence des cellules cochléaires. Pour ce faire, nous avons utilisé des approches de biologie moléculaire et cellulaire pour identifier des voies de signalisation associées aux lésions de l'ADN dans des explants cochléaires issus de souris âgées de 3 jours traitées au cisplatine (CDDP), molécule connue pour son effet secondaire ototoxique. De plus, nous avons étudié l'implication de p53, un des effecteurs clés de la signalisation des dommages de l'ADN, in vivo en traitant avec le CDDP des souris dont le gène codant pour ce facteur de transcription a été invalidé. Les possibilités de protéger l’audition contre l’effet nocif du CDDP ont été également étudiées en utilisant des inhibiteurs spécifiques ciblant les étapes clés des voies de signalisation. Enfin, nous avons utilisé des modèles murins porteurs de xénogreffes de cancer du sein humain afin de vérifier si les co-traitements permettaient de préserver l’audition sans compromettre l’efficacité anti-tumorale du CDDP. Nos résultats montrent que le CDDP induit des cassures doubles brins de l'ADN dans les cellules ciliées qui sont à l'origine de l'activation de la voie ATM-Chk2-p53 et, in fine, de la mort de ces cellules par apoptose. Nous avons également montré que l'absence de p53 in vivo prévient la perte de l'audition et la dégénérescence des cellules ciliées externes après injection intrapéritonéale de CDDP. L’application systémique ou locale de PFT-α, un inhibiteur de p53 prévient efficacement la perte auditive sans compromettre l’efficacité anti tumorale du CDDP.Le deuxième objectif de ma thèse a reposé sur l’identification des liens existant entre la surproduction des espèces réactives de l'oxygène (ROS), les dommages de l’ADN et l’apparition précoce des marqueurs de la sénescence cellulaire et de la perte de l’audition liée à l’âge. Pour ce faire, j’ai utilisé des explants cochléaires de souris âgées de 3 jours traitées au peroxyde hydrogène (H2O2). L’apparition des dommages à l’ADN et des cellules en sénescence a été étudiée en utilisant des techniques d’immunomarquage et de Western blot. Les résultats ainsi obtenus in vitro ont été ensuite validés in vivo sur les cochlées provenant de souris SAMP8 et de souris SAMR1. Afin de confirmer le rôle du stress oxydant dans l’apparition précoce de la presbyacousie, nous avons utilisé une lignée de souris invalidées pour le gène P66Shc, qui est un gène d'adaptation au stress connu pour ses rôles dans la surproduction de ROS et dans l’inhibition des enzymes antioxydants. Enfin, nous avons évalué la possibilité de prévenir ou de ralentir la perte de l’audition liée à l’âge en traitant les souris SAMP8 avec un mimétique de SOD/catalase, le EUK207. Nos résultats ont montré que: i) la surproduction de ROS est l'un des principaux facteurs causaux de la dégénérescence des cellules sensorielles de la cochlée liée à l’âge ; ii) L’activation de la voie p53-p21 entraînant l’apparition précoce de la sénescence dans les cellules cochléaires post-mitotiques, peut expliquer le vieillissement prématuré de la cochlée; iii) Le EUK207, un piégeur du superoxyde et du peroxyde d'hydrogène peut atténuer la ARHL chez les souris SAMP8. L’ensemble de ces résultats mettent en évidence des stratégies novatrices et efficaces pour la protection de l'audition. / Presbycusis or age-related hearing loss is the third most common chronic disease. It represents a major health issue in our modern society. This is due to its evolving feature and the invalidating character of this disease. To date, it is generally accepted that oxidative stress can cause irreversible DNA damage and lead to premature senescence in cycling cells. However, there is no data on the role of DNA damage in age-related cochlear cell degeneration. Moreover, the link between oxidative stress, DNA damage and cochlear cell aging remains unclear.The main objective of this work was therefore to elucidate the role of DNA damage in the degeneration of cochlear cells. To do this, we used molecular and cellular biology approaches to identify signaling pathways associated with DNA damage in cochlear explants from 3-days old mice treated with cisplatin (CDDP). This antineoplastic drug is cytotoxic by causing DNA damage and is known for its harmful effects on hearing. In addition, we investigated the involvement of p53, one of the key effectors of DNA damage signaling, in vivo by treating p53ko mice with cisplatin. Using specific inhibitors targeting key steps of signaling pathways, hearing protection from the harmful effect of CDDP have also been studied. Finally, we used mouse models carrying xenografts of human breast cancer to check whether the co-treatments we had implemented made it possible to preserve the hearing without compromising the anti-tumor efficacy of the CDDP. Our results show that CDDP induces DNA double-strand breaks in the hair cells that are responsible for the activation of the ATM-Chk2-p53 pathway and, ultimately, for the death of these cells by apoptosis. . We have also shown that the absence of p53 in vivo prevents hearing loss and external hair cells degeneration upon intraperitoneal injection of CDDP. The systemic or local treatment using the p53 inhibitor PFT-α effectively prevents hearing loss without compromising the anti-tumor efficacy of CDDP.The second objective of my thesis was to identify the links between the overproduction of reactive oxygen species (ROS), DNA damage, markers of cell senescence and age-related hearing loss. To do this, I used cochlear explants of 3-days old mice treated with increasing concentrations of hydrogen peroxide (H2O2). The appearance of DNA damage and senescent cells was investigated using immunolabeling and Western blotting technics. The results obtained in vitro were then validated in vivo on cochleae from SAMP8 (Senescence Accelerated Mouse Prone 8) and SAMR1 (Senescence Accelerated Mouse Resistant 1) mice. In order to confirm the role of oxidative stress in the early onset of presbycusis, we used a mouse line invalidated for the P66Shc gene, which is a stress adaptation gene known for its roles in ROS overproduction and in the inhibition of antioxidant enzymes. Finally, we assessed the possibility of preventing or slowing-down age-related hearing loss by treating SAMP8 mice with a SOD/catalase mimetic; EUK207. Our results showed that: i) overproduction of ROS is one of the major causal factors of age-related cochlear sensorial cells degeneration; ii) Activation of the p53-p21 pathway resulting in the early onset of senescence in postmitotic cochlear cells may explain premature aging of the cochlea; iii) EUK207 which is a superoxide and hydrogen peroxide scavenger, can attenuate ARHL in SAMP8 mice.All together our results highlight innovative and effective strategies for hearing protection.

La polyploïdie se caractérise par une duplication du génome entier. Elle inhibe efficacement la prolifération cellulaire et joue pourtant un rôle clé dans les étapes précoces de la tumorigénèse. Comment est-elle capable de promouvoir une instabilité génétique dans les cellules cancéreuses est une question en suspens. J'ai établi un système modèle affectant la cytocinèse pour étudier les conséquences de la polyploïdie dans les cellules souches neuronales (CSN) et dans le disque imaginal de l'aile de drosophile. Les cellules polyploïdes du disque sont rapidement éliminées, les CSN polyploïdes continuent de proliférer. Les CSN polyploïdes sont caractérisées par une instabilité génétique précoce et deux facteurs en sont responsables: les erreurs mitotiques et des dommages à l'ADN. Ces dommages sont issus en partie de l'incapacité des cellules à restreindre leur progression dans le cycle cellulaire après une réplication incomplète de l'ADN. J'ai trouvé que de multiples domaines nucléaires au sein de la même CSN polyploïde pouvaient présenter une asynchronie de leur progression dans le cycle cellulaire. Les domaines nucléaires en retard dans leur progression sont les cibles des lésions à l'ADN au moment de l'entrée en mitose. Les lésions sont réduites après surexpression de Chk1, une kinase de la voie ATR de réponse aux dommages à l'ADN. De plus, la prolifération incontrôlée des CSN polyploïdes génétiquement instables est responsable de leur potentiel tumorigénique dans les essais de transplantation. Mes résultats montrent que la tolérance à la polyploïdie dépend du tissu et qu'une série d'événements contribue à l'instabilité génétique dans les CSN polyploïdes. / Polyploidy, which derives from whole-genome duplication events, is normally a potent inhibitor of cell proliferation, but plays important roles during the early steps of tumorigenesis. However, how the gain of multiple sets of chromosomes promotes the generation of unbalanced karyotypes typical of cancer cells remains to be investigated. Using a number of conditions that affect cytokinesis, I established a model system to study the consequences of polyploidy in the neural stem cells (NSCs) of Drosophila and in the wing disc (WD). Importantly, while polyploidy is rapidly eliminated from the WD, polyploid NSCs continue to proliferate. Polyploid NSCs are characterized by early-onset genetic instability and two sources account for the generation of unstable karyotypes: mitotic errors and high-levels of DNA damage. DNA damage in polyploid NSCs arises, at least in part, from the inability of polyploid cells to restrain cell cycle progression in response to incomplete DNA replication. Surprisingly, I found that multiple nuclear domains in the same polyploid NSC can exhibit asynchrony in cell cycle progression, with delayed nuclear domains experiencing acute DNA damage at mitotic entry. I show that DNA damage in polyploid NSCs can be reduced over-expressing Chk1, the main downstream kinase engaged by ATR in the DNA damage response. I also show that uncontrolled proliferation of genetically unstable polyploid NSCs holds tumorigenic potential in transplantation assays. Overall, my results show that the tolerance to polyploidy is tissue dependent and that a complex network of events contributes to the generation of unbalanced karyotypes in polyploid NSCs.

L'environnement des organismes vivants est par définition fluctuant, toutes variations aléatoires du milieu de vie constituent un stress pour les cellules. Au fil de l'évolution, une forte pression de sélection a façonné le fonctionnement cellulaire jusqu'aux réponses complexes élaborées par les organismes vivants. Mes travaux s'inscrivent autour des mécanismes moléculaires de la réponse au stress et plus particulièrement les stress génotoxiques. La première partie de l'étude décrit finement la réplication de l'ADN en condition de stress réplicatif. Ainsi, nous avons montré que les pools de dNTPs sont limitants pour la progression des fourches de réplication en phase S normale et en stress, et que leurs niveaux conditionnent le programme temporel de réplication. De plus, nous avons mis en évidence un mécanisme d'adaptation au stress réplicatif et aux dommages constitutifs dans des mutants caractérisés par de l'instabilité génétique (CIN) via l'activation du checkpoint de dommage conduisant à l'expansion des pools de dNTPs. Pour finir, nous montrons que l'augmentation des niveaux de dNTPs facilite la réplication en présence de lésions de l'ADN, d'une manière indépendante des ADN polymérases translésionnelles. Le second projet apporte de nouveaux éléments sur le rôle de Crt10 in vivo, préalablement identifié comme un régulateur transcriptionnel des gènes de la Ribonucléotide Réductase (RNR). Nos données indiquent que les mutants crt10Δ ont des niveaux de dNTP similaires à ceux des cellules sauvages, et que cette mutation a un très faible impact sur l'expression des gènes RNR, malgré un phénotype de vitesse de progression des fourches accrue. Nous montrons que le mutant crt10Δ est caractérisé par un défaut d'entrée en phase S et d'initiation des origines de réplication. L'origine de ce défaut pourrait résider dans les fonctions de Crt10 impliquant la régulation de la biosynthèse des ribosomes au sein du complexe Rtt101-Mms1. Le troisième projet identifie MRX (Mre11-Rad50-Xrs2) comme un acteur de la voie de terminaison des ARN non codants. MRX s'associe à des loci recrutant également le complexe de terminaison Nrd1-Nab3-Sen1 à l'échelle du génome entier. L'inactivation de RAD50 se traduit par une perte d'efficacité de terminaison et l'accumulation de transcrits bicistroniques, ainsi qu'une dérégulation du niveau d'ARNs non codants instables (CUT) et de leurs gènes associés. Tout comme Sen1, MRX pourrait intervenir dans la résolution des collisions entre les machineries de transcription et de réplication. / A fluctuating environment is a powerful mean of selection for living organisms, which evolved complex signaling networks to integrate these variations and direct swift and efficient cellular responses. The aim of my work is the identification and characterization of molecular mechanisms involved in the tolerance of replicative stress and DNA damage. First, we show that changes in dNTP pools affect several aspects of replication dynamics in budding yeast. dNTP levels are limiting for normal S-phase progression and determine the temporal program of replication during a replicative stress. Interestingly, we also observed that chromosomal instability (CIN) mutants display expanded dNTP pools due to the constitutive activation of the DNA damage checkpoint. Since increased dNTP levels promote forks progression in the presence of DNA lesions, we propose that CIN mutants adapt to chronic replicative stress by upregulating dNTP pools. Secondly, we bring new lights on the role of Crt10 in vivo, which has been initially identified as a negative regulator of Ribonucleotide Reductase (RNR) genes expression. Deletion of CRT10 neither leads to expanded dNTP pools, nor to a massive deregulation of RNR genes, although crt10Δ cells exhibit faster fork progression. The crt10Δ mutant accumulates at the G1/S transition and exhibits a strong defect of origin firing that could account for its replication phenotype. Moreover, we observed a global decrease in ribosome biogenesis in crt10Δ. The physical interaction of Crt10 with several members of the ribosome biogenesis pathway and its role in the Rtt101-Mms1 complex suggest that Crt10 may regulate ribosome levels in vivo. At last, we identified MRX (Mre11-Rad50-Xrs2) as a bona fide member of the transcription termination of non-coding RNA (ncRNA). ChIP-seq reveals that MRX localized at the same loci than the Nrd1-Nab3-Sen1 complex in vegetative growth. rad50Δ cells exhibit transcriptional read-through and upregulation of unstable cryptic transcripts (CUTs) leading to a misregulation of their associated gene. Finally, MRX seems to be involved in the resolution of branched structures emanating from collision between transcription and replication machineries, as it is the case for Sen1.