Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Notre travail a consisté à étudier 2 gènes impliqués dans la réversion tumorale et régulés par P53.<br />Nous avons identifié dans le promoteur du gène siah-1b une séquence sur laquelle P53 se lie in vitro et in vivo. De plus, nous avons montré la fonctionnalité de cet élément de réponse suite à l'induction de P53.<br />La particularité de ce site, dont la structure diffère fortement du consensus de liaison de P53 à l'ADN, ouvre de nouvelles perspectives dans l'analyse des mécanismes régulés par P53.<br />L'étude de la protéine TSAP6 murine a permis de caractériser son expression au niveau tissulaire et intracellulaire. La fonction de TSAP6 n'étant pas bien connue, nous avons entrepris de l'analyser dans des modèles animaux portant un gène tsap6 muté ou invalidé.<br />La mutation du gène tsap6 Gln-395-Lys induit l'apparition d'une microcytose et d'un emphysème pulmonaire chez la souris. La caractérisation des mécanismes conduisant à ces phénotypes est en cours et nous permettra de mieux comprendre la fonction de TSAP6.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La protéine p53 est surtout étudiée pour sa capacité à empêcher la prolifération de cellules dont le génome est endommagé. Toutefois, en analysant les souris p53Δ31/Δ31 qui expriment une protéine p53 hyperactive, notre laboratoire a découvert un rôle inattendu de p53 dans la régulation du métabolisme des télomères. Ces souris modélisent la dyskératose congénitale (DC), un syndrome d’insuffisance médullaire héréditaire (SIMH) causé par un dysfonctionnement télomérique. Mon projet de thèse a combiné les analyses de modèles murins et de lignées cellulaires humaines afin d’approfondir l'étude de cette nouvelle fonction de p53 et de mieux comprendre le rôle de la voie p53 dans le développement des SIMH.En poursuivant notre analyse du modèle murin p53Δ31, nous avons montré que les cellules p53Δ31/Δ31 présentent une diminution d’expression de 12 gènes mutés dans l’anémie de Fanconi (AF), un autre SIMH étroitement lié à la DC. De plus, ces cellules montrent une capacité réduite à réparer les ponts inter-brins de l’ADN, une caractéristique typique de l’AF. Notre étude suggère que l’activation soutenue de p53 pourrait ainsi contribuer aux similitudes cliniques entre ces deux syndromes. Par ailleurs, nous avons identifié par quel mécanisme p53 régule négativement le métabolisme des télomères et la voie Fanconi de réparation de l’ADN. Ce mécanisme de régulation indirect, via p21 et E2F4, est très conservé entre la souris et l’Homme. De fait, les cellules p53Δ31/Δ31 constituent un outil puissant pour identifier de nouvelles cibles de p53 réprimées par ce mécanisme. Ainsi, elles nous ont permis de montrer que deux gènes essentiels pour la structure des centromères sont réprimés par p53.L’activation de p53 est clairement impliquée dans les étapes ultimes d’une insuffisance médullaire, mais le rôle d’une suractivation de p53 dans l’initiation d’un SIMH chez l'Homme reste, à ce jour, controversé. En effet, une mutation inactivatrice de la ribonucléase PARN a été trouvée chez des patients atteints de DC. Il a été proposé que cette protéine déstabilise l’ARNm de p53 tout en favorisant la maturation de l’ARN de la télomérase, si bien que les conséquences d’une inactivation de PARN restent mal comprises. Au cours de ma thèse, j'ai également étudié de nouveaux modèles murins et établi des modèles cellulaires humains pour déterminer l’implication d’une activation de p53 dans l’initiation d’un SIMH chez l’homme. Les résultats en cours, particulièrement prometteurs, devraient notamment déterminer l’impact d’une déficience en Parn sur la voie de régulation de p53.En conclusion, nous avons montré qu’une activation soutenue de p53 conduit à des phénotypes principalement associés aux SIMH. Par ailleurs, nous avons montré que p53 réprime de nombreux gènes impliqués dans la maintenance du génome, ce qui peut sembler surprenant au regard du concept de « gardien du génome » communément attribué à p53, et nous a amené à rediscuter ce concept. Ainsi, les résultats obtenus pendant ma thèse devraient permettre de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’insuffisance médullaire, la suppression tumorale et le vieillissement. / The p53 protein is mostly studied for its capacity to prevent the proliferation of cells with damaged genome. However, while studying p53Δ31/Δ31 mice that express a hyperactive p53 protein, our laboratory uncovered an unexpected role of p53 in the regulation of telomere metabolism. These mice model dyskeratosis congenita (DC), an inherited bone marrow failure syndrome (IBMFS) caused by defects in telomere maintenance. My PhD project combined analyses of mouse models and human cell lines to extend the study of this new function for p53 and to understand the role of the p53 pathway in the development of IBMFS.By extending our analysis of the p53Δ31 mouse model, we revealed that the p53Δ31/Δ31 cells exhibit decreased expression levels for 12 genes mutated in Fanconi anemia (FA), another IBMFS closely related to DC. Furthermore, these cells display a reduced capacity to repair DNA inter-strand crosslinks, a typical feature of FA cells. Our study suggests that a sustained activation of p53 might actually contribute to the clinical overlap between both syndromes. Importantly, we identified the mechanism used by p53 to downregulate telomere metabolism and the FA DNA repair pathway. This regulatory mechanism is indirect, via p21 and E2F4, and largely conserved between mice and humans. In fact, the p53Δ31/Δ31 cells constitute a powerful tool to find p53 target genes downregulated through this regulatory pathway. Accordingly, they were useful to show that two genes essential for centromere structure are also downregulated by p53.p53 activation is clearly involved in the final stages of bone marrow failure, but to-date, the role of p53 hyperactivation in the initiation of IBMFS remains controversial. Indeed, an inactivating mutation of the PARN gene, encoding a ribonuclease, was found in patients with DC. This protein was proposed to destabilize the p53 mRNA while promoting the maturation of the telomerase RNA, so that the consequences of PARN inactivation remain poorly understood. During my thesis, I also studied new mouse models and established human cellular models to determine the contribution of p53 activation in initiating IBMFS in humans. The current results, which are particularly promising, should notably determine the impact of Parn deficiency on the p53 regulatory pathway.In conclusion, we demonstrated that a sustained activation of p53 leads to phenotypes mainly associated with IBMFS. In addition, we showed that p53 suppresses many genes involved in genome maintenance, which may seem surprising in view of the concept of "guardian of the genome" commonly attributed to p53, leading us to revisit this concept. Hence, the results obtained during my thesis should help to better understand the mechanisms involved in bone marrow failure, tumor suppression and aging.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les kinases régulées par les signaux extracellulaires (ERK1/2) régulent une multitude de processus cellulaires, incluant la prolifération, la survie et la différenciation. Ces kinases représentent l’élément terminal de la voie ERK/MAPK, laquelle est activée dans près de 30% de tous les cancers humains et donc généralement perçue comme étant un effecteur critique de la progression tumorale. Cependant, une accumulation d’observations suggèrent que les kinases ERK pourraient également induire la suppression tumorale. Le but premier de cette thèse est de démontrer comment la signalisation par ERK peut contribuer à la suppression tumorale et de concilier les mécanismes impliqués avec son rôle dans la progression du cancer. Puisque nos travaux ont une incidence sur les bénéfices attendus de certaines thérapies actuellement en développement, le deuxième objectif de la thèse est de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour combattre le cancer. Nous avons démontré qu’une hyperactivation des kinases ERK induit la sénescence cellulaire. Le mécanisme implique la dégradation sélective et dépendante du protéasome de nombreuses protéines, ce que nous avons nommé le SAPD (Senescence-Associated Protein Degradation). Ce processus cible des protéines requises pour différentes fonctions cellulaires, incluant la progression du cycle cellulaire, les fonctions mitochondriales et la biogenèse des ribosomes. Ensuite, nos résultats montrent qu’en plus d’inhiber l’établissement de la sénescence, une diminution de la signalisation par les kinases ERK favorise la reprogrammation cellulaire, laquelle permet aux cellules précancéreuses de développer leur tumorigénicité et aux cellules cancéreuses d’acquérir des propriétés attribuables aux cellules souches. Ces observations suggèrent que les mécanismes qui inhibent la voie ERK/MAPK pourraient favoriser l’initiation du cancer, la formation de métastases et la résistance à diverses thérapies. Enfin, nous avons démontré que la metformine, utilisée pour le traitement du diabète, inhibe le facteur de transcription NF-kB. Ce dernier joue un rôle central dans la reprogrammation cellulaire et dans la production de cytokines pro-inflammatoires nocives par les cellules sénescentes. Ainsi, nous émettons l’hypothèse que la metformine pourrait être utilisée en combinaison avec certaines thérapies afin d’éviter les effets secondaires tant d’une inhibition des kinases ERK que d’une hyperactivation. Globalement, les résultats présentés démontrent que l’effet de la voie ERK/MAPK dépend de la force de son activation. Alors qu’une activation modérée peut contribuer à la prolifération de la plupart des cellules, une forte activation induit la sénescence tandis qu’au contraire, une faible activation favorise la reprogrammation des cellules cancéreuses et donc une augmentation de l’agressivité de la tumeur. Cette polyvalence de la voie suggère une certaine prudence face à l’usage des inhibiteurs de la voie ERK/MAPK. Cependant, elle nous motive à travailler au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, lesquelles pourraient inclure la metformine. / The Extracellular Signal-Regulated Kinases (ERK1/2) regulate multiple cellular processes such as proliferation, survival and differentiation. These kinases are the last component of the ERK/MAPK pathway, which is activated in about 30% of all human cancers. Therefore, current thinking proposes that the ERK/MAPK pathway is a critical mediator of tumor progression. However, a steadily growing number of observations suggest that ERK kinases could trigger tumor suppression as well. The first aim of this thesis is to determine how ERK signaling triggers tumor suppression and to try to reconcile these mechanisms with its putative contribution to tumor progression. Since our work has a profound impact on the value of some therapies currently in development, the second aim of the thesis is to propose new strategies to fight cancer. We found that hyperactivation of the ERK kinases induces cellular senescence. Mechanistically, this involves selective proteasome-dependent protein degradation. This “Senescence-Associated Protein Degradation” (SAPD) targets proteins required for several cellular functions, including cell cycle progression, mitochondrial functions and ribosome biogenesis. Furthermore, our results showed that downregulation of ERK signaling not only inhibits the establishment of senescence but promotes cellular reprogramming, thereby allowing precancerous cells to gain tumorigenicity and cancer cells to acquire stem cell-like properties. These results suggest that mechanisms downregulating the ERK/MAPK pathway could promote cancer initiation, metastasis and resistance to multiple therapies. Finally, we demonstrated that the antidiabetic drug metformin targets the transcription factor NF-kB. The latter plays a central role in reprogramming, but also in the generation of deleterious pro-inflammatory cytokines by senescent cells. Hence, we suggest that metformin could be used in combination with other therapies to avoid the side effects of either downregulating or overactivating ERK signaling. Taken together, the results presented in this thesis demonstrate that the outcome of the ERK/MAPK pathway activity depends on signaling strength. While a moderate activation of the pathway may contribute to cell proliferation, a strong activation induces senescence and, conversely, a low activation promotes cancer cell reprogramming. This versatility of the pathway suggests caution with the use of ERK/MAPK pathway inhibitors, but motivates us to develop new therapeutic strategies, which could include metformin.

Le récepteur D de l'interleukine-17 (IL-17RD), également connu sous le nom d'expression similaire aux gènes FGF (SEF), est un membre de la famille des récepteurs de l'IL-17 et une protéine carrefour qui régule principalement négativement les voies de signalisation mitogènes, comme la voie des MAP kinases ERK1/2 et la signalisation immunitaire innée. Au vu du nombre grandissant d’évidences montrant que l'expression d’IL-17RD est régulée à la baisse dans une variété de tumeurs solides, nous et d'autres équipes avons émis l'hypothèse qu'elle pourrait exercer des fonctions de suppression de tumeur. Cependant, le rôle d’IL-17RD dans la biologie tumorale reste à étudier in vivo. Dans une première étude, en combinant l’analyse d’une cohorte longitudinale de vieillissement et d’un modèle de cancer colorectal associé à la colite, nous avons découvert qu’IL-17RD est un véritable gène suppresseur de tumeur in vivo. Nous avons constaté que la perturbation génétique d’Il17rd entraîne une augmentation de la formation de tumeurs dans les deux modèles. De manière intéressante, le développement d'une tumeur dans le modèle de cancer colorectal associé à la colite a été associé à une réponse inflammatoire exacerbée. Parce qu'il est désormais généralement admis que l'inflammation et le cancer sont liés et que nous n’avons observé aucun changement dans la prolifération et l'activation de la voie des MAP kinases ERK1/2 dans les cellules épithéliales intestinales normales ou tumorales lors de l'inactivation génétique de l'IL-17RD, nos résultats établissent l'IL-17RD comme suppresseur de tumeur qui exerce sa fonction en limitant l'étendue et la durée de l'inflammation. Nous avons en outre montré que la perte d’IL-17RD accroît les signalisations du récepteur de type Toll et de l'IL-17A dans les cellules d'adénocarcinome du côlon. Dans une deuxième étude, nous avons évalué l'étendue du potentiel régulateur d'IL-17RD dans l'inflammation. Notre étude révèle qu'IL-17RD régule non seulement l'immunité innée médiée par le TLR et l'IL-17, mais inhibe également l'immunité innée antivirale médiée par les capteurs d'acide nucléique, à savoir la signalisation induite par RIG-I. Ces résultats établissent IL-17RD comme un nouveau régulateur de la réponse immunitaire innée antivirale. En conclusion, nos études sur le rôle d'IL-17RD dans la cancérogenèse et la signalisation immunitaire innée ont établi une fonction suppresseur de tumeur liée à une inflammation accrue in vivo et ont étendu sa fonction inhibitrice à la réponse cytoplasmique antivirale. / Interleukin-17 receptor D (IL-17RD), also known as Similar expression to FGF genes (SEF) is a member of the IL-17 receptor family and a signaling hub that negatively regulates mitogenic signaling pathways, such as the ERK1/2 MAP kinase pathway, and innate immune signaling. With the growing evidence that IL-17RD expression is down-regulated in a variety of solid tumors, we and others hypothesized that it may exert tumor suppressor functions. However, the role of IL-17RD in tumor biology remained to be studied in vivo. In a first study, combining analysis of a longitudinal aging cohort and a colitisassociated colorectal cancer model, we uncovered that IL-17RD is as a bona fide tumor suppressor gene in vivo. We found that genetic disruption of Il17rd leads to increased tumor formation in both models. Interestingly, tumor development in the model of colitisassociated colorectal cancer was associated with an exacerbated inflammatory response. Because it is now generally accepted that inflammation and cancer are linked, and because no change in the proliferation and ERK1/2 MAP kinase activation of normal or tumor intestinal epithelial cells was observed upon genetic inactivation of IL-17RD, our findings establish IL-17RD as a tumor suppressor that exerts its function by limiting the extent and duration of inflammation. We further showed that depletion of IL-17RD enhances Toll-like receptor and IL-17A signaling in colon adenocarcinoma cells. In a second study, we have evaluated the extent of the regulatory potential of IL-17RD in inflammation. Our study reveals that IL-17RD not only regulates TLR and IL-17 mediated innate immunity but also inhibits antiviral innate immunity mediated by nucleic acid sensors, namely RIG-I signaling. Our findings establish IL-17RD as a new regulator of antiviral innate immune response mediated by RIG-I. Altogether, our studies on the role of IL-17RD in carcinogenesis and innate immune signaling have uncovered a tumor suppressor function linked to increased inflammation in vivo and extended its inhibitory function to the antiviral cytoplasmic response.