Il est fréquent d’avoir recours à la radiothérapie dans le traitement des mélanomes, en adjuvant ou en métastatique, mais les résultats cliniques sont suboptimaux, car ces tumeurs présentent souvent des mutations de RAF/RAS, activant alors la voie MAPK de façon constitutive. Nous avons donc étudier si le Trametinib, un inhibiteur allostérique puissant et sélectif de MEK1/2, est en mesure d’augmenter l’efficacité de la radiothérapie. Des tests clonogéniques ont été effectués sur des lignées de mélanomes humaines mutées pour BRAF (A375), NRAS (D04,WM1631), KRAS (WM1791c) ainsi que sur une lignée sauvage (PMWK). Les effets du Tramétinib avec ou sans irradiation (IR) sur les protéines effectrices de MEK ont été quantifiés par western-blot. Les effets de l’addition du Trametinib sur le cycle cellulaire, la réparation de l’ADN, la catastrophe mitotique et la senescence ont respectivement été analysés par cytométrie de flux, étude des foyers γH2Ax, et marquage de l’activité de la β-galactosidase. Enfin, des souris immunodéficientes xenogreffées avec des cellules D04 ont été traitées par IR fractionnée après gavage de Trametinib, et la croissance tumorale a été monitorée.Une augmentation de la cytocoxité en présence de l’ajout de Trametinib à l’ IR a été observée pour toutes les lignées, exceptée PMWK. Le taux de radiosensibilisation des cellules étaient respectivement de 1.70, 1.32, 1.22, et 1.70 pour A375, D04, WM1361 et WM1791c. Le Trametinib bloquait de façon efficace la phosphrylation de ERK à des doses de l’ordre du nanomolaire. Ceci corrélait avec un arrêt prolongé des cellules en phase G1, et une réduction de la phase S, connue pour être radiosésistante, ceci jusqu’à 48 heures après IR. Dans les groupes cellulaires prétraités par Trametinib, une population plus importante de cellules étaient positives pour la β-galactosidase, et deux médiateurs majeurs de la sénescence, p53 et pRb se trouvaient être activés. Les souris recevant le traitement combiné (Trametinib 1mg/kg et IR sur 3 jours) avaient un volume tumoral réduit en comparaison du groupe recevant du Trametinib seul (p=0.016), ou une IR seule (p=0.047). Il n’y avait pas de toxicité notable dans le groupe recevant le traitement combiné.Le Trametinib radiosensibilise les lignées cellulaires de mélanomes mutées pour RAF/RAS en induisant un arrêt prolongé en phase G1 du cycle cellulaire, provoquant ainsi une sénescence prématurée. Associer Trametinib et IR semble être parfaitement toléré, mais ne ralentit la croissance tumorale que modestement in vivo. / Radiotherapy is used frequently in patients with melanoma, but results are suboptimal as these tumours frequently exhibit constitutive activation of the MAPK pathway through mutations involving RAS/RAF. Thus, we studied whether Trametinib, a potent and selective allosteric inhibitor of the MEK1/2 enzymes could improve efficacy of radiotherapy.Clonogenic survival assays were carried out in human BRAF (A375), NRAS (D04,WM1631), KRAS (WM1791c) mutant and wild type (PMWK) melanoma. The effects of Trametinib with and without irradiation (IR) on protein levels of MEK effectors were quantitated by immunoblot analyses. Cell cycle effects, DNA damage repair, mitotic catastrophe and senescence were measured using flow cytometry, γH2Ax, nuclear fragmentation and β-galactosidase staining, respectively. Additionally, nude mice with D04 flank tumours were treated with fractionated RT after gavage with Trametinib and monitored for tumours’ growth. All cell lines but PMWK exhibited enhanced cytotoxicity with IR and Trametinib compared to either agent alone. The sensitizer enhancement ratios were 1.70, 1.32, 1.22, and 1.70 for A375, D04, WM1361 and WM1791c, respectively. Trametinib efficiently blocked IR-induced phosphorylation of ERK at doses in the nanomolar range. This increased susceptibility correlated with a prolonged G1 arrest and reduction in the radioresistant S phase up to 48 hours following IR. A larger population of senescence activated β-galactosidase-positive cells was seen in the Trametinib pretreated group, and this correlated with an activation of two of the major mediator of induced senescence, p53 and pRb. Mice receiving the combination treatment (Trametinib 1mg/kg and IR ober 3 days) showed a reduced mean tumour volume compared with mice receiving Trametinib alone (p=0.016), or IR alone (p=0.047). No overt signs of drug toxicity were observed.Trametinib radiosensitized RAF/RAS mutated melanoma cells to radiation by inducing a prolonged G1 arrest and premature senescence. Combining Trametinib and IR is well tolerated but only moderately induces tumour growth inhibition in vivo.

Les mélanomes malins (MM) constituent le deuxième type de cancer le plus fréquent chez les jeunes adultes canadiens (entre 20 et 44 ans) ainsi qu’un des rares cancers dont l’incidence augmente annuellement. À moins que les MM ne soient excisés à temps par chirurgie, les chances de survie des patients sont pratiquement nulles puisque ce type de tumeur est très réfractaire aux traitements conventionnels. Il est bien connu que l’exposition aux rayons ultraviolets (UV), induisant des photoproduits génotoxiques, est une déterminante majeure dans l’acquisition de MM. À cet effet, la réparation par excision de nucléotides (NER) est la ligne de défense principale contre le développement des mélanomes puisqu’elle est la voie de réparation prépondérante en ce qui a trait aux dits photoproduits. Malgré cela, la contribution potentielle de défauts de la NER au développement des MM dans la population normale n’est toujours pas bien établie. Notre laboratoire a précédemment développé une méthode basée sur la cytométrie de flux qui permet de mesurer la NER en fonction du cycle cellulaire. Cette méthode a déjà mise en évidence qu’une déficience de l’activité de la protéine ATR peut mener à une déficience de la NER exclusive à la phase S dans des fibroblastes humains. Pareillement, nous avons démontré que plusieurs lignées cellulaires cancéreuses modèles comportent une déficience en NER en phase S, suggérant qu’une telle déficience puisse caractériser certains types de cancers. Nous avons voulu savoir si une déficience en NER en phase S pouvait être associée à une proportion significative de mélanomes et si le tout pouvait être attribuable à une diminution de l’activité d’ATR. Nos objectifs ont donc été de : (i) mesurer l’efficacité de la NER en fonction du cycle cellulaire dans les MM en comparaison avec les mélanocytes primaires, (ii) vérifier si le niveau d’activité d’ATR corrèle avec l’efficacité de la NER en phase S dans les lignées de MM et (iii) voir si un gène fréquemment muté dans les mélanomes (tels PTEN et BRAF) pouvait coopérer avec ATR pour réguler la NER en phase S dans les mélanomes. Nous avons démontré que 13 lignées de MM sur 16 ont une capacité grandement diminuée à réparer les photoproduits induits par UV spécifiquement en phase S. De plus, cette déficience corrèle fortement avec une réduction de l’activation d’ATR et, dans plusieurs lignées de MM, avec une phosphorylation d’Akt plus importante. L’utilisation d’ARN interférent ou d’un inhibiteur du suppresseur de tumeurs PTEN, a permis, en plus d’augmenter la phosphorylation d’Akt, de réduire la réparation des photoproduits et l’activation d’ATR dans les cellules en phase S. En addition, (i) l’expression ectopique de la protéine PTEN sauvage dans des lignées déficientes en PTEN (mais pas d’une protéine PTEN sans activité phosphatase) ou (ii) l’inhibition pharmacologique d’Akt a permis d’augmenter la réparation en phase S ainsi que l’activation d’ATR. En somme, cette étude démontre qu’une signalisation d’ATR dépendante de PTEN/Akt amenant à une réparation déficiente des photoproduits génomiques causés par les UV en phase S peut être déterminante dans le développement des mélanomes induits par UV. / Malignant melanoma (MM) is the second most frequent neoplasia among young Canadian adults (aged 20-44); moreover the incidence of this disease continues to rise annually at an alarming rate. Unless primary melanoma is diagnosed early and promptly resected the patient prognosis is dismal since this deadly tumour type metastasizes extremely aggressively and is highly refractory to conventional treatment protocols. It is well established that exposure to UV light, and subsequent induction of genotoxic DNA photoproducts, is a primary determinant in the initiation of MM. Furthermore nucleotide excision repair (NER) clearly represents a critical frontline defence against MM because it is the only human pathway designed to remove the aforementioned DNA photoproducts. Despite this, the potential contribution of NER defects to sporadic MM development in the general population has remained unclear. Our laboratory previously developed a novel flow cytometry-based assay to evaluate the efficiency of NER as a function of cell cycle. This method was employed to demonstrate that functional ATR kinase is strictly required for NER during S phase in primary human fibroblasts. Intriguingly we also reported that many model tumour cell lines are deficient in NER uniquely in S phase populations, raising the possibility that such a defect might be characteristic of certain types of cancers. We therefore hypothesized that a significant proportion of human MM cell lines may exhibit reduced NER capacity specifically during S phase, and that this in turn might be attributeable to reduced ATR signaling. To test this hypothesis, three major specific aims were proposed: (i) To measure the efficiency of NER as a function of cell cycle among a panel of human MM cell lines and in primary melanocytes; (ii) To investigate whether any correlation exists between NER status and ATR activity during S phase in human MM cell lines; (iii) To investigate whether frequently mutated genes in melanoma (eg., PTEN, BRAF) might cooperate with ATR to regulate S phase-specific NER in MM cell lines. We were able to demonstrate that, in fact, 13/16 MM cell lines display remarkably diminished capacity to remove UV-induced DNA photoproducts specifically during S phase. Furthermore this defect correlates strongly with reduced activation of ATR kinase and, for a majority of MM, higher Akt phosphorylation levels. RNAi-mediated knockdown of the PTEN tumour suppressor, while stimulating Akt phosphorylation as expected, also engenders reductions in both photoproducts repair and ATR activation in S phase cells. In addition, (i) ectopic expression in PTEN-null strains of wild type PTEN but not of PTEN variants deficient in phosphatase activity, or (ii) pharmacological inhibition of Akt, significantly rescue S phase-specific repair as well as ATR activation. Our data indicate that reduced PTEN/Akt-dependent ATR signaling leading to defective repair of UV DNA photoproducts uniquely during S phase may represent an heretofore unrecognized major determinant in sunlight-induced melanoma development.

La protéine suppresseur de tumeur p53 est soumise à de complexes régulations transcriptionnelles et posttraductionnelles. La découverte d’isoformes de p53 a introduit un degré de complexité supplémentaire auxmécanismes de régulation des fonctions de p53. On dénombre à ce jour douze isoformes qui diffèrent de p53dans leurs domaines N- et C-terminal. Cependant, les modes d’expression et de fonction de ces isoformes restentà être clarifiés.Dans cette thèse, nous nous sommes intéressés aux deux isoformes Δ40p53 et Δ133p53, en analysant leurinteraction avec p53 et en mesurant leur expression dans les mélanomes, un type de cancer où p53 est trèsrarement mutée. Nous montrons que Δ40p53 peut moduler l’activité de p53 avec un effet bi-phasique, tantôtactivateur ou répresseur du niveau d’expression et des fonctions de p53. Δ133p53 est produite par un promoteurP2 localisé dans le gène TP53. Nous avons montré qu’en réponse à un stress génotoxique, l’expression de Δ133p53 est régulée par p53, qui se lie au promoteur P2. Ceci suggère une boucle d’auto-régulation par p53, quiest capable de contrôler l’expression d’une isoforme inhibant ses propres fonctions. Enfin, les isoformes Δ40p53 et Δ133p53 sont surexprimées dans les tumeurs métastatiques de mélanomes comparées aux tumeurs noninvasives,suggérant à ces isoformes un rôle dans l’inactivation de p53 dans les cancers.Ainsi, Δ40p53 et Δ133p53 interagissent avec p53 de façon complexe, avec des effets plus contrastés que lasimple inhibition de l’activité suppressive de p53. Les isoformes de p53 jouent ainsi un rôle majeur dans lesactivités basales de p53, ainsi que dans l’inactivation fonctionnelle de p53 dans les cancers. / The p53 tumour suppressor protein has a highly complex pattern of regulation at transcriptional and posttranslationallevels. The discovery of p53 isoforms has added another layer of complexity to the mechanisms thatregulate p53 functions. Indeed, p53 is expressed as 12 isoforms that differ in their N- and C-terminus due toalternative splicing, promoter or codon initiation usage. So far, there is limited understanding of the patterns ofexpression and of the functions of each of these isoforms.In this Thesis, we have focused on the two major p53 N-terminal isoforms, Δ40p53 and Δ133p53. We haveanalysed their patterns of interactions with the full-length p53 and we have investigated whether their expressioncould be deregulated in melanoma, a cancer type in which TP53 mutations are rare. Our results show that Δ40p53 can modulate p53 function with a bi-phasic effect, acting as a repressor or activator of p53 to control itslevels and activity. Moreover, we demonstrate that the internal P2 promoter produces Δ133p53 and is regulatedby p53 in response to genotoxic stress, identifying a novel auto-regulatory loop by which p53 may control theexpression of an isoform acting as an inhibitor of p53 activities. Finally, we show that mRNAs encoding Nterminalisoforms are often over-expressed in highly metastatic melanoma when compared to non-invasiveforms, suggesting that N-terminal isoforms contribute to functionally inactivate p53. Thus, we propose that Δ40p53 and Δ133p53 modulate p53 functions within dynamic fluctuations of aprotein network. Hence, p53 isoforms may have a major role in basal p53 activities as well as in the functionalinactivation of p53 in cancer cells.

Les mélanomes malins (MM) constituent le deuxième type de cancer le plus fréquent chez les jeunes adultes canadiens (entre 20 et 44 ans) ainsi qu’un des rares cancers dont l’incidence augmente annuellement. À moins que les MM ne soient excisés à temps par chirurgie, les chances de survie des patients sont pratiquement nulles puisque ce type de tumeur est très réfractaire aux traitements conventionnels. Il est bien connu que l’exposition aux rayons ultraviolets (UV), induisant des photoproduits génotoxiques, est une déterminante majeure dans l’acquisition de MM. À cet effet, la réparation par excision de nucléotides (NER) est la ligne de défense principale contre le développement des mélanomes puisqu’elle est la voie de réparation prépondérante en ce qui a trait aux dits photoproduits. Malgré cela, la contribution potentielle de défauts de la NER au développement des MM dans la population normale n’est toujours pas bien établie. Notre laboratoire a précédemment développé une méthode basée sur la cytométrie de flux qui permet de mesurer la NER en fonction du cycle cellulaire. Cette méthode a déjà mise en évidence qu’une déficience de l’activité de la protéine ATR peut mener à une déficience de la NER exclusive à la phase S dans des fibroblastes humains. Pareillement, nous avons démontré que plusieurs lignées cellulaires cancéreuses modèles comportent une déficience en NER en phase S, suggérant qu’une telle déficience puisse caractériser certains types de cancers. Nous avons voulu savoir si une déficience en NER en phase S pouvait être associée à une proportion significative de mélanomes et si le tout pouvait être attribuable à une diminution de l’activité d’ATR. Nos objectifs ont donc été de : (i) mesurer l’efficacité de la NER en fonction du cycle cellulaire dans les MM en comparaison avec les mélanocytes primaires, (ii) vérifier si le niveau d’activité d’ATR corrèle avec l’efficacité de la NER en phase S dans les lignées de MM et (iii) voir si un gène fréquemment muté dans les mélanomes (tels PTEN et BRAF) pouvait coopérer avec ATR pour réguler la NER en phase S dans les mélanomes. Nous avons démontré que 13 lignées de MM sur 16 ont une capacité grandement diminuée à réparer les photoproduits induits par UV spécifiquement en phase S. De plus, cette déficience corrèle fortement avec une réduction de l’activation d’ATR et, dans plusieurs lignées de MM, avec une phosphorylation d’Akt plus importante. L’utilisation d’ARN interférent ou d’un inhibiteur du suppresseur de tumeurs PTEN, a permis, en plus d’augmenter la phosphorylation d’Akt, de réduire la réparation des photoproduits et l’activation d’ATR dans les cellules en phase S. En addition, (i) l’expression ectopique de la protéine PTEN sauvage dans des lignées déficientes en PTEN (mais pas d’une protéine PTEN sans activité phosphatase) ou (ii) l’inhibition pharmacologique d’Akt a permis d’augmenter la réparation en phase S ainsi que l’activation d’ATR. En somme, cette étude démontre qu’une signalisation d’ATR dépendante de PTEN/Akt amenant à une réparation déficiente des photoproduits génomiques causés par les UV en phase S peut être déterminante dans le développement des mélanomes induits par UV. / Malignant melanoma (MM) is the second most frequent neoplasia among young Canadian adults (aged 20-44); moreover the incidence of this disease continues to rise annually at an alarming rate. Unless primary melanoma is diagnosed early and promptly resected the patient prognosis is dismal since this deadly tumour type metastasizes extremely aggressively and is highly refractory to conventional treatment protocols. It is well established that exposure to UV light, and subsequent induction of genotoxic DNA photoproducts, is a primary determinant in the initiation of MM. Furthermore nucleotide excision repair (NER) clearly represents a critical frontline defence against MM because it is the only human pathway designed to remove the aforementioned DNA photoproducts. Despite this, the potential contribution of NER defects to sporadic MM development in the general population has remained unclear. Our laboratory previously developed a novel flow cytometry-based assay to evaluate the efficiency of NER as a function of cell cycle. This method was employed to demonstrate that functional ATR kinase is strictly required for NER during S phase in primary human fibroblasts. Intriguingly we also reported that many model tumour cell lines are deficient in NER uniquely in S phase populations, raising the possibility that such a defect might be characteristic of certain types of cancers. We therefore hypothesized that a significant proportion of human MM cell lines may exhibit reduced NER capacity specifically during S phase, and that this in turn might be attributeable to reduced ATR signaling. To test this hypothesis, three major specific aims were proposed: (i) To measure the efficiency of NER as a function of cell cycle among a panel of human MM cell lines and in primary melanocytes; (ii) To investigate whether any correlation exists between NER status and ATR activity during S phase in human MM cell lines; (iii) To investigate whether frequently mutated genes in melanoma (eg., PTEN, BRAF) might cooperate with ATR to regulate S phase-specific NER in MM cell lines. We were able to demonstrate that, in fact, 13/16 MM cell lines display remarkably diminished capacity to remove UV-induced DNA photoproducts specifically during S phase. Furthermore this defect correlates strongly with reduced activation of ATR kinase and, for a majority of MM, higher Akt phosphorylation levels. RNAi-mediated knockdown of the PTEN tumour suppressor, while stimulating Akt phosphorylation as expected, also engenders reductions in both photoproducts repair and ATR activation in S phase cells. In addition, (i) ectopic expression in PTEN-null strains of wild type PTEN but not of PTEN variants deficient in phosphatase activity, or (ii) pharmacological inhibition of Akt, significantly rescue S phase-specific repair as well as ATR activation. Our data indicate that reduced PTEN/Akt-dependent ATR signaling leading to defective repair of UV DNA photoproducts uniquely during S phase may represent an heretofore unrecognized major determinant in sunlight-induced melanoma development.

La chimie médicinale est l’application des techniques de recherche en chimie pour synthétiser les molécules pharmaceutiques. Au cours des premiers stades de développements de chimie médicinale, les scientistes ont été principalement concernés par l’isolement des agents médicinaux présents dans les plantes, mais aujourd’hui, ils sont également impliqués dans la création et la synthèse de nouveaux composés pharmaceutiques, parfois basées sur des mécanismes récemment découverts. / Medicinal chemistry is the application of chemical research techniques to the synthesis of pharmaceuticals. During this PhD project, we tried to synthesize small molecules based on terminal alkyne and propargyl alcohols. These molecules were prepared by departing from a simple aldehyde and by doing reactions like Bestmann-Ohira in order to prepare terminal alkynes or reaction with ethynylmagnesium bromide to prepare propargyl alcoholsB. These prepared small molecules were then subjected into the 1,3-dipolar Huisgen cycloaddition reaction in the presence of organic azides in order to prepare small triazolic derivatives. Cytotoxicity property of these small triazoles was then tested against B16 melanoma cell lines. Primary results showed some activities for some of our synthesized molecules that need more study like adding functionalities on the structure to improve their activities.In the last part of this dissertation, a methodology study on the synthesis of propargyl ethers from their corresponding propargyl esters under microwave irradiations has been described. To the best of our knowledge preparation of propargyl ethers from propargyl esters or nucleophilic substitution of propargyl esters in order to find propargyl ethers has been reported in the literature only by use of catalysts such as Lewis acids or metal complexes. The advantage of our method was the absence of such catalysts and the time of the reaction which was less than 1h in comparison with the reported synthesis. Synthesis of such molecules can also be interesting in the synthesis of natural products.

Le mélanome malin est l’un des cancers les plus mortels dont l’incidence continue à augmenter chaque année avec peu de traitement efficace à long terme. Il est causé et initié principalement par l’exposition excessive aux rayons ultraviolets engendrant des photoproduits hautement génotoxiques. Il est bien connu que la cascade de signalisation PI3K/Akt joue un rôle crucial dans la régulation des processus qui sont généralement dérégulés durant le développement tumoral comme la prolifération, le contrôle du cycle cellulaire et l’apoptose. Néanmoins, l’implication de cette voie moléculaire dans la réponse aux dommages à l’ADN est peu caractérisée. Chez les mammifères, trois isoformes de la protéine kinase Akt ont été identifiées: Akt1, Akt2 et Akt3. Bien qu’elles soient très homologues en termes de séquence, plusieurs études ont montré que ces isoformes ont des fonctions biologiques distinctes, et nous suggérons qu’elles puissent contribuer différemment à la régulation de la réponse génotoxique. Les objectifs de ce projet étaient de: (i) évaluer l’activation d’Akt dans les cellules de mélanomes (ii) déterminer l’impact de l’inhibition de cette activité sur la régulation de la réponse cellulaire aux UV (iii) vérifier si la perte d’expression de l’un ou de l’autre des isoformes d’Akt peut réguler la réponse aux UV. Nous avons démontré qu’Akt est transitoirement hyperactivée par phosphorylation suite aux irradiations UV dans les lignées cellulaires de mélanomes. Afin de déterminer l'importance de cette activation dans la réponse cellulaire aux UV, notre approche était de diminuer (i) la phosphorylation d’Akt par l’usage d’inhibiteurs pharmacologiques ou (ii) l’expression de chaque isoforme d’Akt par l’approche des ARN interférents. Nous avons montré que l’inhibition de la phosphorylation d’Akt amène à l’augmentation du taux de l’apoptose induit par les UV d’une manière isoforme spécifique, alors qu’elle n’a aucun effet sur la régulation de la voie de réparation par excision de nucléotides (NER), qui est la seule voie humaine pour éliminer les dommages à l’ADN induits par les UV. En somme, notre étude constitue un nouvel aspect qui permet de mieux comprendre les mécanismes moléculaires du développement de mélanomes malins suites aux irradiations ultraviolettes. / Malignant melanoma is one of the deadliest cancers whose incidence continues to rise each year with a few effective long-term treatments. It is caused and initiated mainly by excessive exposure to ultraviolet radiation generating highly genotoxic DNA photoproducts. It is well known that the PI3K/Akt signaling cascade plays a crucial role in the regulation of processes commonly deregulated in tumor development such as proliferation, cell cycle control and apoptosis. Nevertheless, the nuclear involvement of this molecular pathway in the genotoxic response is poorly characterized. In mammals, three Akt kinase isoforms have been identified: Akt1, Akt2 and Akt3. Although these exhibit a high degree of homology, several studies have shown that they have distinct biological functions; therefore, we suggest that these isoforms may contribute differently to the regulation of genotoxic response. The objectives of this project were to: (i) evaluate Akt activation in UV-irradiated melanoma cells, (ii) determine the effect of the Akt phosphorylation inhibition on the regulation of the cellular response to UV, (iii) evaluate whether the loss of the expression of one or more of Akt isoforms can regulate the cellular response to UV. We demonstrated that Akt undergoes transient hyperactivation after UV treatment in melanoma cell lines. To determine the importance of this activation, our approach was to reduce (i) the phosphorylation of Akt by the use of pharmacological inhibitors or (ii) the expression of each individual Akt isoform using RNA interference. We have shown that inhibition of Akt phosphorylation leads to increased rates of UV-induced apoptosis in an isoform specific manner, while exerting no effect on regulation of nucleotide excision repair (NER), the only human pathway for eliminating UV-induced DNA damage. In summary, our study provides a better understanding of the molecular mechanisms of malignant melanoma development in response to UV.