Il est fréquent d’avoir recours à la radiothérapie dans le traitement des mélanomes, en adjuvant ou en métastatique, mais les résultats cliniques sont suboptimaux, car ces tumeurs présentent souvent des mutations de RAF/RAS, activant alors la voie MAPK de façon constitutive. Nous avons donc étudier si le Trametinib, un inhibiteur allostérique puissant et sélectif de MEK1/2, est en mesure d’augmenter l’efficacité de la radiothérapie. Des tests clonogéniques ont été effectués sur des lignées de mélanomes humaines mutées pour BRAF (A375), NRAS (D04,WM1631), KRAS (WM1791c) ainsi que sur une lignée sauvage (PMWK). Les effets du Tramétinib avec ou sans irradiation (IR) sur les protéines effectrices de MEK ont été quantifiés par western-blot. Les effets de l’addition du Trametinib sur le cycle cellulaire, la réparation de l’ADN, la catastrophe mitotique et la senescence ont respectivement été analysés par cytométrie de flux, étude des foyers γH2Ax, et marquage de l’activité de la β-galactosidase. Enfin, des souris immunodéficientes xenogreffées avec des cellules D04 ont été traitées par IR fractionnée après gavage de Trametinib, et la croissance tumorale a été monitorée.Une augmentation de la cytocoxité en présence de l’ajout de Trametinib à l’ IR a été observée pour toutes les lignées, exceptée PMWK. Le taux de radiosensibilisation des cellules étaient respectivement de 1.70, 1.32, 1.22, et 1.70 pour A375, D04, WM1361 et WM1791c. Le Trametinib bloquait de façon efficace la phosphrylation de ERK à des doses de l’ordre du nanomolaire. Ceci corrélait avec un arrêt prolongé des cellules en phase G1, et une réduction de la phase S, connue pour être radiosésistante, ceci jusqu’à 48 heures après IR. Dans les groupes cellulaires prétraités par Trametinib, une population plus importante de cellules étaient positives pour la β-galactosidase, et deux médiateurs majeurs de la sénescence, p53 et pRb se trouvaient être activés. Les souris recevant le traitement combiné (Trametinib 1mg/kg et IR sur 3 jours) avaient un volume tumoral réduit en comparaison du groupe recevant du Trametinib seul (p=0.016), ou une IR seule (p=0.047). Il n’y avait pas de toxicité notable dans le groupe recevant le traitement combiné.Le Trametinib radiosensibilise les lignées cellulaires de mélanomes mutées pour RAF/RAS en induisant un arrêt prolongé en phase G1 du cycle cellulaire, provoquant ainsi une sénescence prématurée. Associer Trametinib et IR semble être parfaitement toléré, mais ne ralentit la croissance tumorale que modestement in vivo. / Radiotherapy is used frequently in patients with melanoma, but results are suboptimal as these tumours frequently exhibit constitutive activation of the MAPK pathway through mutations involving RAS/RAF. Thus, we studied whether Trametinib, a potent and selective allosteric inhibitor of the MEK1/2 enzymes could improve efficacy of radiotherapy.Clonogenic survival assays were carried out in human BRAF (A375), NRAS (D04,WM1631), KRAS (WM1791c) mutant and wild type (PMWK) melanoma. The effects of Trametinib with and without irradiation (IR) on protein levels of MEK effectors were quantitated by immunoblot analyses. Cell cycle effects, DNA damage repair, mitotic catastrophe and senescence were measured using flow cytometry, γH2Ax, nuclear fragmentation and β-galactosidase staining, respectively. Additionally, nude mice with D04 flank tumours were treated with fractionated RT after gavage with Trametinib and monitored for tumours’ growth. All cell lines but PMWK exhibited enhanced cytotoxicity with IR and Trametinib compared to either agent alone. The sensitizer enhancement ratios were 1.70, 1.32, 1.22, and 1.70 for A375, D04, WM1361 and WM1791c, respectively. Trametinib efficiently blocked IR-induced phosphorylation of ERK at doses in the nanomolar range. This increased susceptibility correlated with a prolonged G1 arrest and reduction in the radioresistant S phase up to 48 hours following IR. A larger population of senescence activated β-galactosidase-positive cells was seen in the Trametinib pretreated group, and this correlated with an activation of two of the major mediator of induced senescence, p53 and pRb. Mice receiving the combination treatment (Trametinib 1mg/kg and IR ober 3 days) showed a reduced mean tumour volume compared with mice receiving Trametinib alone (p=0.016), or IR alone (p=0.047). No overt signs of drug toxicity were observed.Trametinib radiosensitized RAF/RAS mutated melanoma cells to radiation by inducing a prolonged G1 arrest and premature senescence. Combining Trametinib and IR is well tolerated but only moderately induces tumour growth inhibition in vivo.

Le virus de la fièvre catarrhale ovine (Bluetongue virus, BTV) est l’agent étiologique de la maladie du même nom, une arbovirose non contagieuse transmise aux ruminants domestiques et sauvages par l’intermédiaire de morsures de moucherons hématophages du genre Culicoides. Il existe actuellement 27 sérotypes décrits de BTV à travers le monde qui se distinguent par les pathologies qu’ils induisent et leur capacité à infecter et se propager chez leur(s) hôte(s) mammifère(s). Le premier objectif de mon projet de thèse visait à identifier les interactions cellulaires spécifiques des sérotypes 8 et 27 pour identifier des facteurs de pathogénicité/virulence et/ou de franchissement de barrière d’espèces. Pour atteindre cet objectif, l’ensemble des protéines virales du BTV a été criblé par la méthode du double-hybride en levure contre deux banques d’ADN complémentaires, l’une d’origine bovine et l’autre d’origine culicoïde. A l’issue de 70 cribles, une centaine de nouvelles interactions virus-hôtes a été mise en évidence et révèle un enrichissement pour quatre processus cellulaires : l’épissage des ARNm, les ribosomes, la SUMOylation et l’apoptose. Cette étude nous a ainsi permis de réaliser le premier interactome pour le BTV qui se poursuit au travers de multiples validations biochimiques et fonctionnelles des interactions identifiées. En parallèle de ce travail de protéomique, le second objectif de mon projet de thèse a été de déterminer l’impact du BTV sur la voie MAPK/ERK, une voie cellulaire essentielle à la prolifération et différenciation cellulaire et classiquement modulée lors d’infections virales. En plus de son rôle antagoniste sur la voie des interférons de type I, nous avons démontré la capacité de la protéine NS3 de BTV à activer la voie MAPK/ERK. En effet, nous avons démontré que NS3 a la capacité d’augmenter le niveau de phosphorylation des protéines kinases ERK1/2 mais également du facteur de traduction eIF4E. Cette fonction, qui semble être spécifique au BTV par rapport aux autres orbivirus, implique l’interaction de NS3 avec la protéine cellulaire BRAF, une protéine MAP3 kinase jouant un rôle majeur dans l’activation de la voie MAPK/ERK. L’activation cette voie par NS3 pourrait être un mécanisme de détournement de la traduction cellulaire au profit de celle du virus mais aussi constituer un élément de réponse pour expliquer l’hyper-inflammation observée dans le cas d’une infection par ce virus / Bluetongue virus (BTV) is the etiological agent of the bluetongue (BT) disease, a non-contagious arbovirus that affects a wide range of wild and domestic ruminants. It is transmitted by blood-feeding midges of the genus Culicoides. There are currently 27 serotypes described of BTV in the world that are distinguished by their differences in term of pathology/virulence and their capacity to infect and disseminate in their mammalian host(s). The first objective of my thesis project was to identify specific cellular interactions of serotype 8 and 27 to reveal new factors of pathogenicity/virulence and/or cross species barrier. To reach this goal, all the proteins encoded by BTV were used as baits to screen, by a high-throughput yeast two-hybrid (Y2H) approach, two complementary DNA libraries originating from hosts naturally infected by BTV : Culicoides and cattle. Therefore, 70 screens were performed to identify a hundred of new virus-host interactions and reveal an enrichment for four cellular processes : mRNA splicing, ribosomes, SUMOylation and apoptosis. This study allowed us to build the first interactome of BTV which continues through multiple biochemical and functional validations of the identified interactions. In parallel to this proteomics work, my second objective was to determine the impact of BTV on the MAPK/ERK pathway, a cellular pathway essential for cell proliferation and differentiation usually modulated during viral infections. In addition to its antagonist role on the type I interferon pathway, we have demonstrated the ability of BTV-NS3 to activate the MAPK/ERK pathway. Indeed, we have demonstrated that NS3 has the ability to increase the level of phosphorylation of ERK1/2 protein and the eIF4E translation factor. This function, which seems to be specific to BTV compared to other orbiviruses, involves the interaction of NS3 with BRAF cellular protein, a MAP3 kinase protein that plays a major role in the regulation of the MAPK/ERK pathway. These results could provide a better understanding of the molecular basis underlying the hijacking of the translation machinery to support virus replication but also constitute a hypothesis to explain the hyperinflammation observed in the BTV infection context

La résistance à l’hormonothérapie est un challenge majeur en clinique dans le choix du traitement chez les patientes atteintes de cancer du sein RE+ et l’activation des voies de signalisation PI3K/Akt/mTOR ou MAPK semble être impliquée dans la résistance à l’hormonothérapie. L’objectif de ce travail a été dédié à l’exploration de stratégies de réversion de la résistance à l’hormonothérapie et à l’identification de nouveaux biomarqueurs associés à cette résistance. Nous avons identifié dans des lignées résistantes à l’hormonothérapie ayant acquis l’activation endogène des voies PI3K/Akt/mTOR et MAPK, l’activation aberrante du système ErbB, pouvant être à la base de l’activation de ces deux voies de signalisation. L’inhibition d’au moins une des deux voies (par un inhibiteur de mTOR, un inhibiteur de PI3K et/ou un inhibiteur de MEK) a conduit dans la lignée sensible à une augmentation de la sensibilité au tamoxifène et au fulvestrant et dans les lignées résistantes à une restauration de la sensibilité à l’hormonothérapie. La réversion de la résistance au fulvestrant par la rapamycine a été démontrée non seulement au niveau de la prolifération cellulaire mais aussi au niveau de l’expression des gènes, explorés par une approche génomique. Par ailleurs, par une approche gènes candidats, nous avons identifié une signature de trois gènes (TACC1, NOV et PTTG1) présentant une valeur pronostique et associée à la résistance à l’hormonothérapie pouvant représenter un nouvel outil de diagnostic des patientes atteintes de cancer du sein hormono-dépendant. / Endocrine therapy resistance is one of the main challenges in the treatment of estrogen receptor positive breast cancer patients and the activation of PI3K/Akt/mTOR or MAPK signaling pathways seems to be implicated in the acquisition of the resistance. The objective of this work has been dedicated to the exploration of strategies to reverse the resistance to endocrine therapy and the identification of new biomarkers associated with this resistance. We have identified in cellular models resistant to hormone therapy, which have acquired the endogenous activation of PI3K/Akt/mTOR and MAPK pathways, the aberrant activation of the ErbB system which may be the cause of the activation of these pathways. The inhibition of at least one of these two pathways (by an mTOR inhibitor), a PI3K inhibitor) and/or a MEK inhibitor) was shown to increase sensitivity to tamoxifen and fulvestrant in the sensitive cells and to restore sensitivity to endocrine therapy in the resistant cells. The reversion of resistance to fulvestrant by rapamycin has been demonstrated not only at the cell proliferation level but also at the gene expression level explored by a genomic approach. In addition, using a candidate gene approach, we identified a signature of three genes (TACC1, NOV and PTTG1) with prognostic value and associated with resistance to endocrine therapy. These genes may represent a new diagnostic tool for patients treated with endocrine therapy.

Bcl-xL et Mcl-1 sont deux protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 dont dépendent les cancers de l’ovaire pour leur survie, leur inhibition semble donc être une stratégie pertinente. La molécule BH3-mimétique ABT 737 (ou son analogue oral, l’ABT-263), est un puissant inhibiteur de Bcl-xL mais l’inhibition de Mcl-1 reste problématique. Les voies de signalisation PI3K/Akt/mTOR et MAPK/ERK régulent l’expression et l’activité de cette dernière protéine et de ses partenaires BH3-only (Bim, Puma, Noxa). Nous nous sommes donc intéressés à l’intérêt de leur inhibition pour sensibiliser les cellules cancéreuses ovariennes à l’ABT-737. La première étude menée avec le BEZ235, double inhibiteur PI3K/mTOR développé par le laboratoire Novartis, montre qu’il inhibe l’expression de Mcl-1 et induit celle de Puma, et qu’il sensibilise les cellules cancéreuses ovariennes à l’ABT-737 à condition que l’expression de Bim soit également induite. La deuxième étude a évalué les effets de l’AZD8055, inhibiteur du site actif de mTOR développé par le laboratoire AstraZeneca, et du trametinib, inhibiteur allostérique de MEK développé par le laboratoire GlaxoSmithKline et actuellement en clinique, sur trois lignées cancéreuses ovariennes. L’inhibition de l’expression de Mcl-1 et l’induction de celle de Puma par l’AZD8055 ne permettent pas de diminuer suffisamment le ratio [Mcl-1/protéines BH3-only] pour sensibiliser les cellules à l’ABT-737. En revanche, la forte induction de Bim sous forme active déphosphorylée par le trametinib permet de diminuer suffisamment ce ratio pour sensibiliser deux des trois lignées testées à l’ABT-737. C’est cependant la triple combinaison AZD8055/trametinib/ABT-737 qui est la plus efficace pour induire une apoptose massive dans les trois lignées. Par ailleurs, de façon intéressante, l’association de l’AZD8055 et du trametinib est cytotoxique sans ABT 737 dans une des lignées testées. Ces résultats mettent en évidence l’efficacité de différentes stratégies thérapeutiques multi-cibles et la nécessité de définir des marqueurs prédictifs de la réponse afin d’évoluer vers un traitement personnalisé pour améliorer la prise en charge des cancers de l’ovaire. / Ovarian cancers depend on Bcl-xL and Mcl-1, two anti-apoptotic protein of the Bcl-2 family, for their survival and their inhibition seems to by a relevant strategy. The BH3-mimetic molecule ABT-737 (or its oral form, ABT-263), is a strong Bcl-xL inhibitor, but Mcl-1 inhibition remains problematic. Signaling pathways PI3K/Akt/mTOR and MAPK/ERK regulate expression and activity of Mcl-1 and its BH3-only partners (Bim, Puma, Noxa). We focused on the interest of their inhibition to sensitize ovarian cancer cells to ABT-737. The first study with BEZ235, a PI3K/mTOR dual inhibitor developed by Novartis, inhibits Mcl-1 expression and induces the one of Puma, and sensitizes ovarian cancer cells to ABT-737 provided that Bim expression is induced. The second study evaluated the effects of AZD8055, mTOR active site inhibitor developed by AstraZeneca, and of trametinib, MEK allosteric inhibitor developed by GlaxoSmithKline and currently in clinic, on three ovarian cancer cell lines. Mcl-1 expression inhibition and Puma expression induction by AZD8055 does not sufficiently reduce [Mcl-1/BH3-only proteins] ratio to sensitize cells to ABT-737. On the other hand, strong Bim induction in its active dephosphorylated form by trametinib sufficiently reduce this ratio to sensitize two of the three cell lines tested to ABT-737. Nevertheless, the triple combination AZD8055/trametinib/ABT-737 is the most efficient to induce massive apoptosis in the three cell lines. Besides, interestingly, AZD8055 and trametinib association is cytotoxic without ABT-737 in one of the tested cell lines. These results highlight the efficacy of different multi-targets therapeutic strategies and the need of predictive marker definition of the response to develop personalized treatment and to improve ovarian cancer management.