Le récepteur humain de la mélatonine MT1 appartient à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). En raison du rôle majeur qu'il joue dans la régulation du rythme circadien, ce récepteur est impliqué dans les troubles du sommeil et la dépression et présente donc un intérêt thérapeutique important. Afin de progresser vers une meilleure caractérisation structurale et fonctionnelle de ce récepteur, nous avons élaboré une stratégie globale visant à générer les échantillons et méthodes nécessaires pour de telles études. Nous avons ainsi mis au point un ensemble original de conditions de production et de purification permettant d'isoler les récepteurs MT1 sous forme relativement pure, homogène et fonctionnelle. Parallèlement, à partir d'un RCPG de référence, le récepteur de l’adénosine A2A, nous avons mis au point un panel de techniques d’analyses biochimiques et biophysiques qui contribuent à une caractérisation fine des récepteurs purifiés et leur interaction avec des ligands. / The human MT1 melatonin receptor belongs to the family of G protein-coupled receptors (GPCRs). It plays a major role in the regulation of circadian rhythm and is involved in sleep disorders and depression. This receptor is thus of significant therapeutic interest. However, very few in vitro studies have been conducted on this receptor and in particular no structural characterization and interactio studies by biophysical methods. In order to progress on these aspects, we developed conditions of production and purification of MT1 receptors for obtaining samples compatible with this type of study. Furthermore, we initiated stabilization tests of the purified receptors. Meanwhile, we have developed biochemical and biophysical analysis techniques to characterize the purified receptors and study their interactions with ligands, on a reference GPCR, the A2A adenosine receptor.

RESUME GENERAL<p><p>Contexte :une association entre exposition prolongée aux champs magnétiques (CM) d’extrêmement basses fréquences (ELF) et risque sanitaire a été établie pour la leucémie infantile (CM 50/60 Hz de l’électricité, RR = 2,0 pour ≥ 0,4 µT d‘intensité moyennée dans le temps) et est suggérée pour le décès par maladie d’Alzheimer (CM 50/60 Hz, CM 16,7 Hz des voies ferrées pour 21 µT d’intensité moyennée dans le temps) et pour certaines hémopathies chez l’adulte (CM 16,7 Hz). Ces associations restent inexpliquées à ce jour. Sur base d’observations animales (effets des CM ELF sur la sécrétion de mélatonine) d’une part, et de la sensibilité magnétique confirmée des cryptochromes (régulateurs des biorythmes) d’autre part, il a été suggéré que ces associations puissent être dues à une perturbation des biorythmes par les CM ELF. Selon les instances internationales, une intensité > 1 mT est requise pour l’existence d’effets biologiques. <p>Objectifs et méthode :sur base d’une revue exhaustive de la littérature et de modèles théoriques reconnus, le présent travail développe certains mécanismes possibles pour un effet perturbateur des biorythmes par les CM ELF. L’impact en santé publique de cette hypothèse est ensuite évalué. Enfin, des protocoles sont proposés pour sa mise à l’épreuve, tenant compte des mécanismes envisagés. <p>Résultats :la possibilité existe d’une interaction des oscillations ELF de l’intensité et/ou de l’orientation du CM (somme vectorielle du CM ELF et du CM terrestre ou CMT) avec les cryptochromes rétiniens. Chez l’animal magnétosensible (dont le rongeur), une perturbation des biorythmes pourrait être consécutive à un mécanisme non spécifique de perturbation sensorielle. Toute observation animale pourrait donc ne pas être extrapolable à l’Homme. Chez ce dernier, une perturbation des biorythmes pourrait être causée par les oscillations de l’intensité du CM (peut- être dès < 100 µT d’intensité de CM ELF). Une telle perturbation pourrait aussi être causée par les variations spatiales de l’intensité du CMT qui existent dans l’environnement résidentiel (proximité de structures métalliques). Par ailleurs, dans l’éventualité de l’existence, chez l’Homme également, d’une sensibilité directionnelle basée sur les cryptochromes rétiniens, les oscillations de l’orientation du CM pourraient alors aussi interférer avec ces cryptochromes (peut-être dès ≤ 10 µT). Dans l’hypothèse où une telle interférence affecte les biorythmes, seules pourraient alors être concernées les oscillations dont l’amplitude atteint plusieurs degrés d’angle. Un tel mécanisme ne pourrait donc s’appliquer à la relation entre CM ELF et leucémie infantile que dans l’éventualité où les intensités les plus élevées (+ 1 à 2 SD) de CM ELF y jouent un rôle. Au cas où l’hypothèse de la perturbation des biorythmes par les CM ELF se voyait confirmée, d’autres troubles de santé seraient alors concernés et d’autres sources de CM seraient en cause, tels les CM statiques d’intensité variable émis par les lignes de transport électrifié. Les paramètres d’exposition considérés devraient inclure l’orientation relative CM ELF/CMT, mais aussi l’intensité locale du CMT (facteur à la fois déterminant et confondant dans la présente hypothèse). L’expérimentation animale devrait investiguer l’expression des clock genes. L’expérimentation humaine devrait investiguer les biorythmes chez l’enfant. Et l’épidémiologie devrait investiguer l’incidence de troubles liés à une perturbation des biorythmes en relation avec l’exposition aux CM ELF ainsi qu’aux variations locales de l’intensité du CMT. <p>Conclusions :malgré les incertitudes persistantes quant aux fonctions précises des cryptochromes de la rétine humaine et quant à l’exactitude des modèles théoriques qui décrivent les interactions entre CM et cryptochromes, certains mécanismes paraissent possibles pour une interaction entre CM ELF et biorythmes. En l’absence persistante d’alternative valide pour l’explication de l’association entre CM ELF et leucémie infantile, l’hypothèse de la perturbation des biorythmes par ces CM paraît devoir être investiguée plus avant, mais en tenant compte des variations locales d’intensité du CMT. <p>Background: An association between prolonged exposure to extremely low frequency (ELF) magnetic fields (MF) and health risk has been established for childhood leukemia (50/60 Hz MF of electricity, RR = 2.0 for ≥ 0.4 µT of time-averaged intensity) and is suggested for death by Alzheimer's disease (50/60 Hz MF, 16.7 Hz MF of railways at 21 µT of time-averaged intensity) and for some hematologic malignancies in adults (16.7 Hz MF). These associations remain unexplained so far. Based on animal studies (effects of ELF MF on melatonin secretion) on the one hand, and on the confirmed magnetic sensitivity of cryptochromes (regulators of biorhythms) on the other hand, it has been suggested that these associations may be due to a disruption of biorhythms by ELF MF. From current data, however, biological effects seem only possible at > 1 mT of intensity.<p>Objectives and methods: on the basis of an exhaustive literature review and with use of recognized theoretical models, this paper develops some possible mechanisms for disruption of biorhythms by ELF MF. The public health impact of this hypothesis is then evaluated. Finally, protocols are proposed for the testing of it, with taking into account the proposed mechanisms.<p>Results: an interaction seems possible between ELF oscillations of the intensity and/or the orientation of the ambient MF (the vector sum of both the ELF MF and the geomagnetic field or GMF) with retinal cryptochromes. In magnetosensitive animals (including rodents), disruption of biorhythms may then be secondary to a non-specific mechanism of sensory disturbance. All animal observation could therefore not be extrapolated to humans. In the latter, on his turn, a disruption of biorhythms may be caused by the oscillations of the MF intensity (perhaps from <100 µT of ELF MF intensity). Such disruption could also be caused by spatial variations of the intensity of the GMF that exist in residential environment (near steel structures). Moreover, in case of the existence in humans (like in animals) of a directional sensitivity based on retinal cryptochromes, then the oscillations of the MF orientation also could interfere with these cryptochromes (perhaps from ≤ 10 µT). In the event that such interference affects biorhythms, only oscillations of several degrees of amplitude would then be concerned. As a consequence, such a mechanism could apply to the relation between ELF MF and childhood leukemia only in the event that the highest MF intensities (Mean + 1-2 SD) also play a role in that relation. In the event the hypothesis of disruption of biorhythms by ELF MF is confirmed, other health problems would be concerned and other kind of MF would be involved, such as the static MF of variable intensity that are emitted by the lines of electrified transport. The considered exposure parameters should include the relative orientation of ELF MF and GMF, but also the local intensity of GMF (both determining factor and confounder in this case). Animal experiments should investigate the expression of clock genes. Human experimentation should investigate biorhythms in children. And epidemiology should investigate the incidence of disorders related to disruption of biorhythms in relation to exposure to ELF MF as well as to local variations in the intensity of the GMF.<p>Conclusions: Despite the persisting uncertainties about the precise functions of retinal cryptochrome as well as about the accuracy of the theoretical models that describe the interactions between MF and cryptochromes, some mechanisms seem possible for an interaction between ELF MF and biorhythms. In the persisting absence of valid alternative explanation for the association between childhood leukemia and ELF MF, the hypothesis of biorhythm disturbance by ELF MF deserves further investigation, however with taking into account local intensity variations of the GMF.<p> / Doctorat en Sciences de la santé publique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Problématique : Certaines personnes souffrent d'avoir un horaire de sommeil trop tardif qu'elles n'arrivent pas à modifier pour satisfaire les exigences liées à leur emploi ou à leurs études. Ces individus souffrent de privation de sommeil et de somnolence lorsqu'ils doivent se conformer à un horaire socialement acceptable. Malgré sa prévalence importante, l’étiologie d’un horaire trop tardif reste méconnue. Objectif: Évaluer des facteurs pouvant contribuer au maintien d’un horaire de sommeil tardif chez des jeunes adultes. Méthodes : Quatorze jeunes adultes se plaignant d’un horaire de sommeil trop tardif ont été comparés à des sujets appariés qui avaient un horaire de sommeil adapté. L’heure de coucher (HC) était après minuit pour les sujets tardifs et avant minuit pour les sujets adaptés. Les sujets étaient admis au laboratoire 5h avant l’HC et garder en obscurité pour 6h. Ils étaient ensuite exposés à 1,5h de lumière bleue. La mélatonine salivaire et la vigilance subjective étaient mesurées aux 30 minutes. La suppression de mélatonine a été utilisée pour déterminer la sensibilité circadienne à la lumière. Le dim light melatonin onset (DLMO) a été utilisé pour déterminer la phase circadienne. Résultats : Le DLMO survenait plus tard dans le groupe tardif que dans le groupe adapté. Il n’y avait pas de différence de suppression de mélatonine après 1,5h d’exposition à la lumière. Néanmoins, une corrélation entre la sensibilité à la lumière et la phase circadienne a été trouvée dans le groupe tardif. Les sujets tardifs présentaient aussi une augmentation plus lente de la somnolence subjective en soirée. Conclusion : Nos résultats suggèrent qu’une phase circadienne en délai, une augmentation plus lente du besoin de dormir et une sensibilité circadienne à la lumière accrue contribuent à la plainte d’un horaire de sommeil trop tardif. / Problem: Some people suffer from having a delayed sleep schedule that they can’t modify to satisfy school/work requirements. These individuals suffer from sleep deprivation and sleepiness when they have to comply with a socially acceptable schedule. Despite its high prevalence, the etiology of a delayed schedule remains unknown. Objective: This study aims to elucidate factors that might contribute to the maintenance of a delayed sleep schedule in young adults. Methods: Fourteen young adults (8 women) complaining of delayed sleep schedule were compared to matched subjects with an adapted sleep schedule. Habitual bedtime (HB) was after midnight in all delayed subjects and before midnight in all adapted subjects. Subjects were admitted 5h before HB and kept in dim light for 6h. They were then exposed for 1.5h to blue light. Salivary melatonin and subjective sleepiness were assessed every 30 min. Melatonin suppression was used to measure circadian sensitivity to light. Dim light melatonin onset (DLMO) was used to estimate circadian phase. Results: DLMO was later in the delayed than in the adapted group. There was no difference for melatonin suppression over the 1.5h of light exposure. However, in the delayed group, there was a significant correlation between DLMO and melatonin suppression. There was a smaller increase of subjective sleepiness in the delayed subjects than in the adapted subjects before HB. Conclusions: Our results suggest that a delayed circadian phase, a slower build-up of sleep propensity and an enhanced circadian sensitivity to evening light contribute to the complaint of a delayed sleep schedule.

La mélatonine est une neurohormone produite principalement par la glande pinéale de manière circadienne et agissant par l’activation de deux récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) appelés MT1 et MT2. La mélatonine régule de nombreuses fonctions physiologiques importantes. La régulation des niveaux de dopamine (DA) et de glucose en font partie mais nous ne savons pas clairement comment la mélatonine les régule.Les niveaux de DA extracellulaire sont principalement régulés par son transporteur (DAT) responsable de sa recapture dans les neurones présynaptiques afin de prévenir d’une hyperactivation des récepteurs dopaminergiques. Par conséquent, nous avons vérifié le rôle de DAT dans la régulation du système dopaminergique par le système mélatoninergique. Nous avons montré qu’en interagissant avec la forme immature non-glycosylée de DAT, MT1 et MT2 le retiennent dans le réticulum endoplasmique régulant ainsi son expression à la surface cellulaire et donc la recapture de la DA. De la même manière, les souris déficientes en MT1 ou MT2 ont montré une augmentation de la recapture de la DA dans les synaptosomes de striatum et une baisse de l’hypermotilité induite par l’amphétamine. Dans ce projet nous avons ainsi révélé un nouveau lien entre les systèmes mélatoninergiques et dopaminergiques basé sur la formation de complexes moléculaires entre les récepteurs de la mélatonine et DAT.Afin de mieux comprendre le rôle de la mélatonine dans la régulation des niveaux de glucose, nous avons ensuite étudié l’implication de variants génétiques de MT2 dans le développement du diabète de type 2 (DT2). Des études antérieures avaient montré que des variants naturels défectueux fonctionnellement étaient associés à un risque de développer le DT2. Afin de déterminer plus précisément les propriétés défectueuses en lien avec le DT2, nous avons mesuré l’activation spontanée et celle induite par la mélatonine de 40 variants MT2. Nous avons ainsi montré que des défauts d’activation des protéines Gαi et Gαz induite par la mélatonine et de recrutement spontané de la βarrestine-2 sont significativement reliés à un risque de développer le DT2. Les résultats expérimentaux corrélaient avec les prédictions de l’analyse sur le score d’évolution. Ce travail permettra de nouvelles avancées dans la recherche de traitements personnalisés pour les personnes portants les mutations sur MT2 afin qu’il retrouve une réponse non défectueuse.Le séquençage de 9393 personnes a permis l’identification de 32 variants naturels MT1. Le récepteur MT1 sauvage et les variants ont ainsi été caractérisés grâce aux techniques de transfert d’énergie par résonnance de bioluminescence (BRET). Nous avons montré que MT1 active les protéines Gαi/o, Gα12 et Gα15 et recrute la βarrestine-2. L’analyse des résultats par factorisation matricielle non linéaire a révélé l’existence de 5 clusters caractérisés par différents profils de signalisation. La modélisation 3D par homologie de MT1 a permis de déterminer l’impact de chaque variant sur l’activation du récepteur et ses interactions avec les protéines G et la βarrestine-2. Ce projet a ainsi permis de démontrer que des variants naturels sont très intéressant afin de comprendre les mécanismes d’action des RCPGs. En résumé, ce travail contribue à la compréhension des fonctions des récepteurs à la mélatonine et souligne leur importance dans la régulation du système dopaminergique et de l’homéostasie glucidique. Nos résultats offrent de nouvelles perspectives dans la recherche de nouveaux traitements personnalisés pour les patients souffrant d’un dérèglement du système dopaminergique ou de DT2. / Melatonin is a neurohormone mainly released from the pineal gland in a circadian manner acting through two G protein-coupled receptors (GPCRs) called MT1 and MT2. Melatonin regulates many important physiological functions. Regulation of dopamine (DA) and glucose levels are two of them but how they do this is not clear.Extracellular DA levels are mainly regulated by its transporter (DAT) which mediates DA re-uptake into presynaptic nerve termini to prevent DA receptor hyperactivation in the presynaptic cleft. Consequently, we verified the role of DAT in the regulation of the DA system by melatonin. We showed that MT1 and MT2, by interacting with the immature non-glycosylated form of DAT retain DAT in the endoplasmic reticulum thus regulating DAT cell surface expression and DA reuptake. Consistently, mice with targeted deletion of MT1 and MT2 show markedly enhanced DA uptake in striatal synaptosomes and decreased amphetamine-induced locomotor activity. Collectively, we revealed here a molecular link between the melatonin and DA systems, which is based on the formation of a molecular complex between melatonin receptors and DAT.To better understand the role of melatonin on the regulation of glucose levels, we studied the involvement of genetic variants of MT2 in the development of type 2 diabetes (T2D). Previous studies showed that natural loss-of-function variants of MT2 associate with T2D risk. To determine more precisely the defective properties linked to T2D risk we monitored spontaneous and melatonin-induced activation of different signaling pathways by 40 MT2 variants. We show that defects in melatonin-induced Gαi and Gαz activation and spontaneous βarrestin-2 recruitment are most significantly associated to T2D risk. Experimental results correlated well with those predicted by evolutionary lineage analysis. This work will help to propose personalized treatments for MT2 variant carriers to recover their defective responses.Sequencing of 9393 individuals resulted in the identification of 32 natural MT1 variants. MT1 wild-type and variants were functionally characterized in bioluminescence resonance energy transfer (BRET) assays. We showed that MT1 activates Gαi/o, Gα12 and Gα15 proteins and recruits βarrestin-2. Analyzes of results by non-linear matrix factorization revealed the existence of 5 clusters characterized by different signaling profiles. Computational homology modeling of the 3D model of MT1 helped to determine the impact of each variant on receptor activation and interaction with G proteins and βarrestin-2. Collectively, our data illustrate that natural variants are powerful tools to understand the molecular basis of GPCR function. Overall, this work contributes to our understanding of the function of melatonin receptors and highlights their importance in the regulation of the DA system and glucose homeostasis. Our results will open new, personalized therapeutic options for patient suffering from a defective DA system or T2D.

L’intégrité fonctionnelle des organismes vivants, Homme y compris dépend des rythmes biologiques. La perturbation de ces rythmes due aux conditions de vie du monde moderne (travail posté, jet-lag,…) ou des circonstances naturelles (vieillissement), favorise l’installation de pathologies spécifiques (troubles du sommeil, l’obésité, le diabète,…). Afin de retarder l’apparition de ces troubles, la conception des projets expérimentaux sur des modèles d’animaux diurnes et des modèles d’animaux vivants dans des biotopes particuliers où l’Homme est présent (zone désertique) est nécessaire. Le but de ma thèse est d’essayer de comprendre les mécanismes neurophysiologiques d’adaptation aux conditions environnementales extrêmes chez le dromadaire (adapté à la chaleur) et le hamster d’Europe (adapté au froid). Une première partie révèle qu’en plus de la photopériode, la température ambiante est un véritable synchroniseur de l’horloge biologique du moins en absence du cycle lumière-obscurité. Dans une seconde partie, notre objectif était de vérifier si les variations saisonniers de la température ambiante sont capables comme les changements photopériodiques d’induire des modifications saisonnières sur le rythme de mélatonine et/ou de la température corporelle. Nous avons commencé par la vérification de l’existence de l’hétérothermie adaptative chez le dromadaire surtout que ce phénomène a été contesté récemment. Nos résultats démontrent que le dromadaire privé d’eau de boisson et placé sous des températures ambiantes élevées, adopte une régulation complexe de thermorégulation caractérisée par une alternance quotidienne de phase de poïkilothermie et d’homéothermie. Cet état d’hétérothermie a également été observé chez des dromadaires parfaitement hydratés, sujet d’une restriction alimentaire. Nos résultats concluent donc que l’hétérothermie adaptative chez le dromadaire est une combinaison de plusieurs facteurs qui interagissent le long du cycle lumière-obscurité, à savoir la température ambiante, la privation hydrique et la prise alimentaire. Finalement, nous avons démontré chez le hamster d’Europe que les neurones des noyaux arqués sont capables d’intégrer le signal photopériodique et cela indépendamment de la présence de la mélatonine. L’existence de ce mécanisme particulier d’intégration de la photopériode chez d’autres mammifères y compris l’Homme doit maintenant être recherchée. Nos résultats ouvrent la voie à la mise en évidence de son intérêt pratique dans le contrôle des rythmes biologiques en particulier dans celui des rythmes circannuels. / The functional integrity of living organisms, including human, depends on the biological rhythms. Disruption of these rhythms due to the living conditions of the modern world (shift work, jet lag ...) or natural circumstances (aging), leads various abnormalities (sleep disorders, obesity, diabetes ...). In order to understand pathophysiology of these abnormalities and adaptation in extreme environment, we need to design experiments on diurnal animals that cohabitate with human in specific biotopes. The aim of my thesis is to understand the neurophysiological mechanisms of adaptation to extreme environmental conditions in the camel (adapted to heat) and the European hamster (adapted to cold). Earlier we found that in addition to photoperiod, ambient temperature is a real synchronizer of the biological clock, at least in the absence of light-dark cycle. In the second part of my project, we investigated if seasonal variations of ambient temperature are capable to changes the rhythm of melatonin secretion and/or body temperature like photoperiod. Since heterothermy in camel challenged recently, we started our study by confirming the existence of adaptive heterothermy in camels. Our results demonstrate that dehydrated camels during exposure to daily heat show adaptive heterothermy. This mechanism is more complex because it is characterized by a daily alternation of two periods of poikilothermy and homeothermy. This adaptive heterothermy was also observed when camels are hydrated and food deprived. Based on our results, we can conclude that adaptive heterothermy in the Arabian camel is a combination of three factors interacting throughout the light-dark cycle: heat stress, water restriction, and level of food intake. Finally, we have demonstrated in European hamster that neurons of the arcuate nucleus are able to integrate photoperiodic signal, independent of melatonin. The existence of this particular mechanism of integration of photoperiod in other mammals including humans must be investigated. Our results promote to study the role of this new mechanism of integration of photoperiod in the control of biological rhythms in particular the circannual rhythms