Introduction: Nous avons déjà montré que l’insuffisance rénale chronique (IRC) entraîne une régulation négative du cytochrome P450 (CYP450) dans le foie et l’intestin de rat. La présente étude cherche à déterminer l’effet de l’IRC sur l’expression des enzymes du CYP450 dans le cerveau de rat. L’expression génique, protéique ainsi que l’activité des isoenzymes du CYP450 ont été analysées dans différentes régions du cerveau (hippocampe, cervelet, cortex et parenchyme cérébral) afin de déterminer l’effet de l’insuffisance rénale chronique sur le métabolisme cérébral des médicaments par le CYP450. Méthodes: Le cerveau entier de rats atteints d’IRC (induite par une néphrectomie sub-totale 5/6) et de rats témoins (laparotomie blanche) a été disséqué en 4 parties (cortex, cervelet, hippocampe et parenchyme cérébral). L’expression protéique et celle de l’ARNm des isoformes 1A, 2C11, 2D, 3A et 4A du cytochrome P450 a été étudiée respectivement par immunobuvardage de type Western et PCR en Temps Réel. L’activité du CYP3A a été mesurée par le métabolisme du DFB en DFH sur des préparations de microsomes de cerveau. Une technique de culture cellulaire d’astrocytes a été mise au point et a permis d’évaluer l’expression des enzymes dans ces cellules suite à l’incubation des astrocytes avec le sérum de rats atteints d’insuffisance rénale chronique. Résultats: Chez les rats atteints d’IRC, les niveaux géniques de CYP1A, 2C et 3A sont diminués d’au moins 40% (p < 0,05) dans presque toutes les parties étudiées. Les niveaux d’ARNm du CYP2D demeurent inchangés. De plus, une diminution significative d’au moins 45% (p < 0,05) de l’expression protéique des CYP1A, 2C et 3A est observée dans presque toutes les structures étudiées. L’activité enzymatique de CYP3A est diminuée significativement dans le cerveau de rats IRC, ainsi que l’expression des enzymes du CYP2C11 dans les astrocytes en culture lorsqu’incubés avec du sérum de rat urémique. Conclusions: Ces études démontrent que le cerveau est également affecté par l’IRC. Ceci se traduit par une diminution de l’expression protéique, génique, ainsi que de l’activité des enzymes du CYP450. Cette diminution pourrait expliquer une augmentation des effets secondaires dans le système nerveux central en IRC. / Background: It has been shown that chronic renal failure (CRF) is associated with a downregulation of liver and intestinal cytochrome P450 (CYP450) in the rat. The present study aimed to investigate the repercussions of CRF on Brain. CYP450 isoenzymes mRNA and protein expression, as well as activity in different brain regions (cortex, cerebellum, hippocampus, and rest of brain parenchyma), have been studied in order to determine the effects of CRF on cerebral drug metabolism by CYP450. Methods: The entire brain of CRF rats (induced by 5/6th nephrectomy) and control rats (sham laparotomy) was dissected into 4 parts (cortex, cerebellum, hippocampus, and rest of brain parenchyma). Protein and mRNA expression of CYP1A, CYP2C, CYP2D, CYP3A, and CYP4A were assessed by Western Blot assay and Real Time PCR, respectively. CYP3A activity was assessed using DFB metabolism into DFH in brain microsomal preparation. Protein and mRNA expression were also assessed in cultured astrocytes incubated with serum from CRF rats. Results: In CRF rats, mRNA levels of CYP1A, CYP2C, and CYP3A were decreased significantly by at least 40% (p < 0.05) in almost all studied brain regions. Protein expression of these isoforms was decreased by at least 45% (p < 0.05) in almost all structures. A significant decrease in CYP3A activity was observed in the brain. The incubation of astrocytes with CRF sera induced a decrease in the protein and mRNA expression of the CYP2C11. Conclusions: CRF is associated with a decrease in some major drug-metabolizing enzymes, which could explain an increase in bioavailability of drugs in the brain.

Introduction: Nous avons déjà montré que l’insuffisance rénale chronique (IRC) entraîne une régulation négative du cytochrome P450 (CYP450) dans le foie et l’intestin de rat. La présente étude cherche à déterminer l’effet de l’IRC sur l’expression des enzymes du CYP450 dans le cerveau de rat. L’expression génique, protéique ainsi que l’activité des isoenzymes du CYP450 ont été analysées dans différentes régions du cerveau (hippocampe, cervelet, cortex et parenchyme cérébral) afin de déterminer l’effet de l’insuffisance rénale chronique sur le métabolisme cérébral des médicaments par le CYP450. Méthodes: Le cerveau entier de rats atteints d’IRC (induite par une néphrectomie sub-totale 5/6) et de rats témoins (laparotomie blanche) a été disséqué en 4 parties (cortex, cervelet, hippocampe et parenchyme cérébral). L’expression protéique et celle de l’ARNm des isoformes 1A, 2C11, 2D, 3A et 4A du cytochrome P450 a été étudiée respectivement par immunobuvardage de type Western et PCR en Temps Réel. L’activité du CYP3A a été mesurée par le métabolisme du DFB en DFH sur des préparations de microsomes de cerveau. Une technique de culture cellulaire d’astrocytes a été mise au point et a permis d’évaluer l’expression des enzymes dans ces cellules suite à l’incubation des astrocytes avec le sérum de rats atteints d’insuffisance rénale chronique. Résultats: Chez les rats atteints d’IRC, les niveaux géniques de CYP1A, 2C et 3A sont diminués d’au moins 40% (p < 0,05) dans presque toutes les parties étudiées. Les niveaux d’ARNm du CYP2D demeurent inchangés. De plus, une diminution significative d’au moins 45% (p < 0,05) de l’expression protéique des CYP1A, 2C et 3A est observée dans presque toutes les structures étudiées. L’activité enzymatique de CYP3A est diminuée significativement dans le cerveau de rats IRC, ainsi que l’expression des enzymes du CYP2C11 dans les astrocytes en culture lorsqu’incubés avec du sérum de rat urémique. Conclusions: Ces études démontrent que le cerveau est également affecté par l’IRC. Ceci se traduit par une diminution de l’expression protéique, génique, ainsi que de l’activité des enzymes du CYP450. Cette diminution pourrait expliquer une augmentation des effets secondaires dans le système nerveux central en IRC. / Background: It has been shown that chronic renal failure (CRF) is associated with a downregulation of liver and intestinal cytochrome P450 (CYP450) in the rat. The present study aimed to investigate the repercussions of CRF on Brain. CYP450 isoenzymes mRNA and protein expression, as well as activity in different brain regions (cortex, cerebellum, hippocampus, and rest of brain parenchyma), have been studied in order to determine the effects of CRF on cerebral drug metabolism by CYP450. Methods: The entire brain of CRF rats (induced by 5/6th nephrectomy) and control rats (sham laparotomy) was dissected into 4 parts (cortex, cerebellum, hippocampus, and rest of brain parenchyma). Protein and mRNA expression of CYP1A, CYP2C, CYP2D, CYP3A, and CYP4A were assessed by Western Blot assay and Real Time PCR, respectively. CYP3A activity was assessed using DFB metabolism into DFH in brain microsomal preparation. Protein and mRNA expression were also assessed in cultured astrocytes incubated with serum from CRF rats. Results: In CRF rats, mRNA levels of CYP1A, CYP2C, and CYP3A were decreased significantly by at least 40% (p < 0.05) in almost all studied brain regions. Protein expression of these isoforms was decreased by at least 45% (p < 0.05) in almost all structures. A significant decrease in CYP3A activity was observed in the brain. The incubation of astrocytes with CRF sera induced a decrease in the protein and mRNA expression of the CYP2C11. Conclusions: CRF is associated with a decrease in some major drug-metabolizing enzymes, which could explain an increase in bioavailability of drugs in the brain.

Introduction : Les modèles murins sont grandement utilisés dans l’étude des maladies rénales et des pathologies associées. La concentration de la créatinine sérique est un bon indicateur de la filtration glomérulaire et en présence d’insuffisance rénale chronique (IRC), les concentrations de créatinine sérique (et la clairance) reflètent la sévérité de l’IRC. De plus, il a été démontré que l’IRC modifie le métabolisme des médicaments en diminuant l’activité et l’expression des enzymes hépatiques du cytochrome P450 (CYP450). Afin d’étudier la modulation du P450 par l’IRC avec un modèle murin et de confirmer nos résultats chez le rat, nous devons 1) développer un modèle d’IRC chez la souris, 2) mettre au point une technique de dosage des marqueurs de l’IRC et, 3) évaluer l’expression protéique du CYP450 en présence IRC. Matériel et Méthode : Trois modèles chirurgicaux d’IRC chez la souris ont été développés. Une méthode du dosage de la créatinine par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) a été mise au point chez la souris et l’expression protéique du P450 a été mesurée par immunobuvardage de type Western. Résultats : Plusieurs paramètres de CLHP comme le pH, la concentration et le débit de la phase mobile modifient le pic d’élution et le temps de rétention de la créatinine. Concernant le modèle expérimental, on observe une perte de poids et une augmentation de la concentration plasmatique de la créatinine chez les souris avec une IRC. De plus, l’expression protéique de plusieurs isoformes du cytochrome P450 est modulée par l’IRC. Nous observons une diminution du CYP 2D de 42% (p < 0,01), du CYP 3A11 de 60% et du CYP 1A de 37% (p <0,01) par rapport aux souris témoins. On ne dénote aucun changement significatif au niveau de l’isoforme 2E1. Conclusion : Il est possible d’induire une insuffisance rénale chronique chez la souris suite à une néphrectomie. La technique de dosage de la créatinine par CLHP est précise et exacte et permet de caractériser la sévérité de l’IRC chez la souris. L’expression protéique du CYP450 est régulée à la baisse dans le foie des souris atteintes d’IRC. / Background: Mice models are widely used in renal studies. Seric creatinine concentration is used to evaluate glomerular filtration rate and is a good marker of chronic renal failure (CRF). It has been shown that CRF diminishes drug metabolism in the rat because of a downregulation of hepatic cytochrome P450 (CYP450) isoforms. To study CYP450 regulation in the mouse model, we needed to 1) develop a model of CRF in the mouse, 2) define a method of dosage of CRF markers, and 3) evaluate CYP450 protein expression in the liver of mice with CRF. Methods: Models of CRF were tested and sub-total nephrectomy was selected because of the efficacy and reproducibility to induce CRF. A high pressure liquid chromatography (HPLC) method for the dosage of creatinine in mice sera was developed. Liver protein expression of CYP1A1, CYP3A11, CYP2D and CYP2E1 was assessed by Western Blot analysis. Results: HPLC parameters such as pH, mobile phase concentration and flow rate modified the elution profile. Weight loss and high seric creatinine concentrations are seen in mice with CRF. Furthermore, protein expression of CYP1A, CYP3A11 and CYP2D was decreased in liver microsomes of mice with CRF by 37%, 60% and 42%, respectively (p<0.01) compared to sham-operated mice. We found no significant difference in the expression of CYP2E1. Conclusions: CRF models are reproducible in the mouse. The HPLC method for creatinine determination is precise and accurate, and can assess the severity of CRF. Hepatic protein expression of CYP450 is modulated in presence of CRF as in the rat.

Mon projet de doctorat a pour objet l'étude des facteurs pouvant influencer le métabolisme des médicaments et la variabilité interindividuelle dans la réponse aux médicaments. Mon projet cible plus précisément les Cytochromes P450 (CYP450), le système enzymatique majeur impliqué dans la biotransformation des médicaments. Mes travaux de recherche évaluent l'impact d’une condition pathologique, le diabète de type 2 (DT2), sur l'activité métabolique des CYP450s. Mes études comprennent un volet de métabolisme systémique chez le patient et un volet de métabolisme in vitro. Dans cette thèse, les résultats de mes recherches sont rapportés sous forme de présentation par articles. Le volet in vivo consistait en une étude de pharmacocinétique qui visait à évaluer l’impact du diabète sur l’activité métabolique de différentes isoformes des CYP450s en utilisant un cocktail de substrats-marqueurs. Des patients avec le DT2 et des sujets non diabétiques ont reçu une dose orale de notre cocktail VM/JT de substrats-marqueurs composé de caféine (CYP1A2), bupropion (CYP2B6), tolbutamide (CYP2C9), oméprazole (CYP2C19), dextrométhorphane (CYP2D6) et midazolam (CYP3A4/5) suivi d'une administration de chlorzoxazone (CYP2E1). Le protocole pour cette étude est détaillé dans l’article disponible à la section 2.1; manuscrit 1. Les concentrations plasmatiques et urinaires des médicaments marqueurs et de leurs métabolites spécifiques ont été quantifiées par LC-MS/MS suivant la méthode publiée dont l’article est disponible à l’annexe 1. Cette étude m’a permis de montrer que les patients avec le DT2 présenteraient une clairance systémique réduite via les isoformes CYP2B6, CYP2C19 et CYP3A. L’article présentant ces résultats se trouve à la section 2.1; manuscrit 2. Au cours de cette étude clinique, nous avons aussi évalué l’utilisation du 4-hydroxycholestérol comme biomarqueur endogène de l’activité du CYP3A dans une population avec le DT2 (objectif secondaire). Les conclusions démontrant la validité de ce biomarqueur sont disponibles dans l’article qui se trouve à la section 2.2; manuscrit 3. Le volet in vitro de mes travaux a permis d’évaluer au niveau du duodénum l’influence du DT2 sur l’expression de plusieurs CYP450s et transporteurs, ainsi que sur l’activité des CYP2B6, CYP2C9, CYP2J2 et CYP3A. Aucun impact significatif du DT2 n’a été mesuré sur l’expression d’ARNm des CYP450s et transporteurs testés exprimés dans des biopsies duodénales. Les niveaux d’activité mesurés à l’aide d’incubations avec des substrats-marqueurs des CYP450s dans des fractions S9 de biopsies duodénales étaient semblables chez des sujets avec le DT2 et des non diabétiques. L’article sur les résultats de ce volet in vitro est disponible à la section 2.3; manuscrit 4. Ces résultats suggèrent que les effets du diabète sur le métabolisme des substrat-marqueurs observés dans l’étude clinique peuvent s’expliquer par une modulation au niveau hépatique ou dans différentes sections de l’intestin. En accord avec ces résultats chez l’humain, notre groupe avait déjà rapporté que l’effet du diabète sur les CYP450s était isoforme et tissu spécifique chez la souris (annexe 2). L'objectif de ma thèse était de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la variabilité dans la réponse aux médicaments observés chez les patients diabétiques, lesquels nécessitent fréquemment une polypharmacie. Les résultats de ces travaux permettront éventuellement d’optimiser la pharmacothérapie chez ces patients. / My PhD project evaluates factors that can influence drug metabolism and interindividual variability in drug response. More precisely, my thesis focuses on the major drug metabolizing enzymes, the cytochromes P450 (CYP450). My researches evaluated the impact of a pathological condition, namely type 2 diabetes (T2D), on CYP450 metabolic activities in two parts. First, the effect of diabetes on systemic metabolism was evaluated in patients. Then, in vitro experiments enabled us to measure the impact of T2D on organ-specific or metabolism. In this thesis, my research results are presented in 4 scientific papers. The in vivo part of my PhD research consisted of a pharmacokinetic study assessing metabolic activity of different isoforms of the CYP450s using a cocktail of probe drugs in T2D patients and non-diabetic subjects. All participants of both study groups received a dose of our oral VM/JT probe drugs cocktail consisting of caffeine (CYP1A2), bupropion (CYP2B6), tolbutamide (CYP2C9), omeprazole (CYP2C19), dextromethorphan (CYP2D6) and midazolam (CYP3A4/5) followed by a dose of chlorzoxazone (CYP2E1), alone. Study procedures are detailed in the protocol article (manuscrit 1) presented in section 2.1. Plasma and urine concentrations for all probe drugs and specific metabolites were quantified using a published LC-MS/MS method that is available in annexe 1. This study showed that patients with T2D exhibited reduced systemic clearances for the isoforms CYP2B6, CYP2C19 and CYP3A. Results of this pharmacokinetic research are presented in manuscrit 2 of section 2.1. As a secondary objective, this in vivo part of my PhD project enabled us to verify the validity of 4-hydroxycholesterol as an endogenous biomarker of CYP3A activity in a population with T2D. Conclusions showing its validity as an endogenous biomarker in such population are presented in section 2.2 (manuscrit 3). The in vitro part of my doctoral project evaluated in the intestines the influence of T2D on the mRNA expression of numerous CYP450 isozymes and drug transporters, as well as on metabolic activity of CYP2B6, CYP2C9, CYP2J2 and CYP3A. Using duodenal biopsies, no significant impact of T2D was detected on the mRNA expression levels of all tested CYP450s and transporters. Activity levels measured following incubations of probe-substrates in S9 fractions of duodenal biopsies obtained from patients with T2D and non-diabetic patients were similar. Results from this in vitro study are reported in section 2.3 (manuscrit 4) of this thesis. These results obtained in human subjects are in agreement with our previously published results showing isoform- and tissue-specific effects of T2D on CYP450s in mice (annexe 2). Overall, the central theme of this thesis is to better understand the underlying mechanisms of drug response variability observed in diabetic patients, whom often require polypharmacy, in order to eventually optimize drug therapy in those patients.