Les dérivés du tétrahydrofolate (THF), plus connus sous le nom de folate(s) ou vitamine B9, sont des cofacteurs indispensables au métabolisme cellulaire puisqu'ils sont à la base des réactions de transfert d'unités monocarbonées, regroupées sous le terme de "métabolisme C1". Chez tous les organismes, ces réactions sont impliquées dans des processus cellulaires clés comme la synthèse des nucléotides (purines, thymidylate), la synthèse de certains acides aminés (sérine, glycine, méthionine) et, indirectement, dans la synthèse de S-adénosylméthionine. Cette dernière constitue le donneur universel de groupements méthyles et intervient donc dans l'ensemble des réactions de méthylation. Les plantes, les champignons et certains micro-organismes possèdent la capacité de réaliser la synthèse de novo de THF alors que les animaux en sont incapables et sont contraints de puiser cette vitamine dans leur alimentation.<br /> Lors du développement de la plante, la capacité de synthèse du THF, le pool global et la nature des folates ainsi que la demande en unités C1 varient de façon importante. Pourtant, la littérature reste succincte en ce qui concerne les mécanismes qui permettent de contrôler l'homéostasie en folates en fonction des besoins fluctuants en unités C1 de la plante et sur la manière dont sont distribuées ces unités entre les différentes voies utilisatrices.<br /> Le travail réalisé dans le cadre de cette thèse a permis de mettre en évidence différents niveaux de régulation du métabolisme C1 permettant à la plante de répondre à une diminution du pool de folates. Ainsi, l'étude transcriptomique de la réponse de cellules d'Arabidopsis à un traitement par un antifolate, le méthotrexate, a révélé une absence de processus de compensation de la baisse de la quantité de folates puisque les gènes impliqués dans la synthèse, le transport et la dégradation du THF ne présentent pas de modification de leur expression. La régulation transcriptionnelle mise en place suite à une limitation en folates concerne un nombre restreint de gènes qui vont influencer la composition en dérivés du THF et non l'abondance de ce cofacteur vitaminique. En effet, alors qu'en situation physiologique le flux d'unités C1 alimente majoritairement les réactions de méthylation, il se trouve que le déficit en folates provoque une réorientation de ce flux vers la synthèse des nucléotides.<br /> La diminution des méthylations cellulaires en situation de déficit en folates a été illustrée lors de l'étude d'une méthyltransférase particulière qui intervient dans la synthèse des chlorophylles, la Mg-protoporphyrine IX méthyltransférase. Des feuilles de pois déficientes en folates présentent une forte diminution de l'index de méthylation qui se traduit par une régulation métabolique de l'activité de la Mg-protoporphyrine IX méthyltransférase, conduisant ainsi à une baisse de la synthèse des chlorophylles. Cette étude démontre que le statut en folates influence, via les réactions de méthylations, des processus physiologiques essentiels comme la biogenèse de l'appareil photosynthétique.<br /> Ce travail de thèse a également mis en évidence un mécanisme de régulation post-traductionnelle de la synthèse de méthionine en situation de carence en folates. Ce mécanisme consiste en un clivage protéolytique de l'extrémité N-terminale de la première enzyme dédiée à la synthèse de méthionine, la cystathionine γ-synthase. L'élimination de ce domaine régulateur de l'enzyme permet, par un mécanisme encore inconnu, d'accroître la biosynthèse de méthionine en situation de déficit en folates.

Le séquençage à haut débit est une technique très utile pour l’étude des ARN. Pendant mon doctorat, nous l’avons utilisé pour la caractérisation des ARN extracellulaire (ARNex) du plasma humain. Les ARNex du plasma sont retrouvés soit à l’état soluble sous forme de complexes ribonucléoprotéiques (RNP) ou encapsulés au sein de vésicules extracellulaires (VE) de diverses origines (exosomes, microvesicles, …). Dans ce projet, j’ai démontré que le plasma contenait principalement des micro ARN, le fragment hY4 et des ARN ribosomiques dégradés. Par ailleurs, après chromatographie à exclusion de tailles ou par traitement consécutif protéinase K/RNase A, des VE hautement purifiées peuvent être obtenus. Nous ne retrouvons plus en majorité les micro ARN et l’ARN hY4 dans ces échantillons mais plutôt des ARN du microbiote humain, montrant une composition différente entre les ARNex solubles et ceux des vésicules purifiées. Par ailleurs, j’ai également effectué une étude comparative de kits commerciaux qui sont supposés purifier les exosomes par précipitation. La composition en ARN de ces fractions est très similaire au plasma humain total, montrant une forte contamination par les RNP solubles. Ainsi, nous sommes en mesure de proposer un protocole pour l’étude des ARNex dans le cadre de biopsies liquides avec des échantillons cliniques afin de découvrir de potentiels biomarqueurs de diagnostic. Au-delà de la caractérisation d’ARN, le séquençage à haut-débit peut être utilisé pour la détection et quantification des modifications post-transcriptionnelles. Pendant ma thèse, j’ai utilisé le séquençage pour l’analyse des 2’O-méthylation des ARN de transfert chez E. coli par RiboMethSeq. Sous plusieurs conditions de stress (manque de nutriments ou des concentrations non létales d’antibiotiques), certaines 2’O-méthylations montrent une réponse adaptative. Alors que plus de la moitié des 2’O-méthylations en position 18 (Gm18) sont augmentées dans toutes les conditions de stress étudiées, les positions Nm34 montrent un effet opposé avec une diminution dans certains stress (chloramphénicol et streptomycine). Chacun de ces deux comportements peut être relié à un phénomène de régulation cellulaire en réponse au stress : un changement au niveau de la wobble base pourrait être un moyen de réguler la traduction en modifiant l’usage des codons. En ce qui concerne Gm18, son rôle dans l’évasion du système immunitaire inné lors de l’invasion d’un hôte est en cours d’élucidation. / For less than a decade, high-throughput sequencing became a very powerful, sensitive and precise technique for the study of ribonucleic acids. During my PhD thesis, I used this technology for in-depth characterization of the extracellular RNA (exRNA) content of human plasma. exRNA in plasma exists either in a “soluble state” as a component of ribonucleoprotein (RNP) complexes or encapsulated into extracellular vesicles (EV) of diverse origins (exosomes, microvesicles, …). In this project, I demonstrated that whole human plasma contains mostly micro RNA and the fragment of RNA hY4, as well as degraded ribosomal RNA. Moreover, using a rigorous strategy via size exclusion chromatography or consecutive proteinase K/RNase A treatments, highly purified EVs can be obtained. miRNAs and RNA hY4 fragments were not present in majority of samples, demonstrating a huge difference between soluble exRNA and exRNA from purified EVs. The RNA content of these EVs mainly reflects RNA composition of human microbiota. In addition, I also performed a comparative analysis of commercially available “exosome-enrichment” kits which are supposed to purify human exosomes by precipitation. Their RNA composition was found to be almost identical to human plasma, showing strong uncontrolled contamination by soluble RNPs. Based on this study, we were able to propose a protocol for studies in exRNA in the field of liquid biopsies with clinical sample in order to discover new diagnostic biomarkers. Apart from the characterization of RNA, high-throughput sequencing can be used for detection and quantification of RNA post-transcriptional modifications. During my PhD thesis I applied deep sequencing for analysis of transfer RNA (tRNA) 2’-O-methylations in model bacteria (E. coli) using RiboMethSeq. Under several stress conditions, such as starvation and non-lethal antibiotics concentrations, some 2’-O-methylated nucleotides show an adaptive response. While over than half of Gm18 show a global increase under all investigated stress conditions, ribomethylated residues at position 34 show an opposite effect for some antibiotic treatments (chloramphenicol and streptomycin). Each of these dynamic profiles can be linked to cell regulation in response to stress. Change at the tRNA wobble base (position 34) could be a way to regulate translation by modifying the codon usage. Concerning Gm18, its role in the escape from the human innate immune system during host invasion is currently elucidated.