I april 2011 startade MTG den kommersiella pratradiokanalen Radio 1. I och med lanseringen introducerades ett nytt begrepp i det svenska medielandskapet: kommersiell åsiktsradio. Denna uppsats söker att besvara hur Radio 1:s utbud och innehåll ser ut, vilka som kommer till tals i Radio 1, vilka influenser man kan finna från den amerikanska förlagan samt vilken position Radio 1 har på den svenska radiomarknaden. Kort sagt: vad kommersiell pratradio är och erbjuder i en svensk kontext. Denna uppsats använder sig av såväl kvantitativa som kvalitativa metoder för att tillhandahålla så pass nyanserade och generaliserbara resultat som möjligt inom detta färska forskningsområde. Uppsatsen söker även att besvara de ursprungliga frågeställningarna medelst en konkret jämförelse med dels amerikansk pratradiokultur och dels Sveriges Radios utbud. Resultaten tolkas utifrån Aristoteles retoriska begrepp, ett diskursanalytiskt perspektiv och gestaltningsteorin. Slutsatserna denna uppsats ger är att Radio 1 erbjuder en ny form av radio i Sverige, starkt influerad av amerikanska förlagor. Det finns anledning att tro att MTG:s största konkurrent, SBS, kan motiveras till att lansera ett liknande format vilket i slutändan skulle generera en mer utbredd kommersiell pratradio i Sverige. Radio 1 tenderar att erbjuda åsiktsmaterial som genom sin subjektiva karaktär går emot rådande journalistisk praxis inom Sverige. Vidare kan konstateras att Radio 1 är en kanal som präglas av mansdominans, sett till såväl lyssnare som medverkande.

Genom att analysera kortegenskaperna hos Magic the Gathering-kort harmodeller tagits fram för att bestämma deras inverkan på kortpriset. Tidigarestudier har inte fokuserat på spel-egenskaperna, vilket är vad som särskiljer dettaarbete från tidigare forskning. För att modellera effekten av spel-egenskapernahar dessa kvantifierats och undersökts med hjälp av Minsta-kvadratmetoden ochLasso-regression, med hjälp av programmeringsspråket R. Resultaten indikeraratt faktorer direkt kopplade till samlarbarhet och spelbarhet har den störstainverkan på priset för Magic the Gathering-kort. Dessa resultat har diskuteratsmed utgångspunkt från olika perspektiv, såsom Wizards of the Coast (utgivarenav Magic the Gathering), spelare, samlare och investerare. Genom att fokusera påspel-egenskaperna har denna studie bidragit till området på ett sätt som tidigareforskning inte har gjort, vilket ger en mer helhetsbild av Magic the Gathering-kortsvärde. / By analyzing the card properties of Magic the Gathering cards, models have beendeveloped to determine their impact on card prices. Previous studies have notfocused on gameplay properties, which distinguishes this work from previousresearch. To model the effect of gameplay properties, they have been quantifiedand examined using Least Squares Method and Lasso Regression, with the helpof the programming language R. The results indicate that factor directly relateradto collectability and playability have the greatest impact on the price of Magic theGathering cards. These results have been discussed from various perspectives,such as Wizards of the Coast (the publisher of Magic the Gathering), players,collectors, and investors. By focusing on gameplay properties, this study hascontributed to the field in a way that previous research has not, providing a morecomprehensive understanding of the value of Magic the Gathering cards.

The aim of this work was to evaluate choosen group of 26 clones of apricot variety 'Velkopavlovická' and to select the best clone and subclone for growers in south Moravia. Beside of classical pomological and biological evaluation characteristics the objective was to verify some older as well as newer, less known methods for evaluation of relevant characteristics of clones. Descriptors for choosen biological and pomological characters were used for the evaluation of clones. The clones were analysed with molecular genetic methods to establish the genetic relationship and to search for the possibilities of distinguishing them. The floral morphology and its influence on bearing of the clones was evaluated in this work. Formation of bearing shoots according to their lenght, their morphological conformation, bearing potential and their longevity were evaluated using modern methods. The physiological performance was evaluated using calorimetry. After all, the health of the clones was studied by molecular identification of present patogens and biochemical aspects of plant defense response against patogens related to precocious dieback of apricots. For the data processing ANOVA, X2, Mantel tests were used. For the evaluation of clones, following 11 biological and pomological characteristics were assessed: 1. precocious dieback occurence, 2. stem necrotic injuries, 3. patogen occurence of Gnomonia erythrostoma, 4. flower set, 5. fruit set, 6. bearing, 7. yield efficiency , 8. flowering date, 9. fruit weight, 10. fruit width, 11. relative rate of the stone to whole fruit weight. Evaluation of genetic relationship using molecular genetic methods S-SAP offereds the possibility of parcial distinction of 'Velkopavlovická' clones to 5 groups based on the transposonal polymorphic loci. Molecular genetic methods AFLP, S-SAP and iPBS provided similar profiles of the evaluated clones and genotypes. Differences in floral morphology shows low ranking stability in the number of each floral organs of those clones and their considerably lower occurence in contrast to the current experience. Based on this results, this method seems to be not perspective for clonal selection. The evaluation of morphological structure of bearing shoots, their bearing and longevity gives many informations about the morphological structure of the clones and it seems to be a perspective method for clonal selection. Differences between the clones were found in the high number of generative organs on short shoots, medium shoots and their distribution along the central axis of scaffold branches. The physiological characteristics of adult idividuals of evaluated clones using net asimilation rate seems to be hard to interpret and its use in clonal selection need fruther research. Research of patogen presence using PCR method shows significant presence of ESFY and Cytospora cincta in the tissues of evaluated clones. Those patogens were most likely related to the precocious dieback of apricots. Salycilic acid and the number of transcript copies of the beta-1,3-glucanase and gene expresion of Pru ar1 markers are most likely associated with plant defense of apricots. Based on results of biochemical analysis of the substances assosiated with plant defense the possibility to evaluate plant health of apricots considering precocious dieback with help of used markers in field conditions can be suggested. There use for clonal selection need fruther researche. The best clones LE-108, LE-111, LE-120 and M.72A of variety 'Velkopavlovická' seems to be the most promising from the evaluated group of clones. As the best subclones following individuals were choosen: clone LE-120 - tree 36 (1. row), clon M.72A - trees 26, 37 a 49 (8. row), clon LE-108 trees 28 a 29 (3. row) and clon LE-111 tree 27 (6. row).

This research represents an attempt to define and accurately measure user consumption of content on a modern, advertised VOD service (AVOD), more specifically known in Sweden as a Play service. With a foundation of previous research in the area of VOD and AVOD services, the characteristics and flaws of these types of platforms are discussed to shine light on factors that might concern Play services. Optimizing the vast content inventory offered on these services is crucial for long term profitability, and to achieve this, content providers need to understanding how to measure the consumption properly. A content­centric approach was used to focus on individual formats (e.g. TV shows) and the factors that can describe its consumption. A macro perspective was initially applied to investigate global factors that dictates consumption. Analysis on a micro level was carried out by analyzing tracking data collected for a full year from one of the biggest Play services in Sweden, TV3play.se. Ultimately, the development of a new method to measure consumption called Consumption Volume Score (CVS) is proposed. It is introduced as an alternative to the traditional unit which has been to measure the amount of video starts (VS). The validity was evaluated using comparison of rank difference for individual formats, using both methods and different criterias. The results shows that the method of using CVS to measure consumption yields little to no difference in ranking of highly popular formats, while less consumed formats had a more varied change in rank. Further analysis on some of these formats indicated that they might have a dedicated niche audience, where content editors might see potential gains from handpicking them to optimize the consumption further. The findings gives support to believe that CVS as a unit of measuring consumption can help to further understand how individual formats perform, especially less consumed and potentially niched ones. Future research on CVS is recommended to discern its feasibility in a live context. / Denna forskning ämnar att finna metoder för att definiera samt noggrant kunna mäta konsumtionen av streamad media på en modern, reklamfinansierad VOD­tjänst (AVOD), i Sverige är dessa mer kända som Play­tjänster. Med utgångspunkt från tidigare forskning inom på streaming­tjänster, belyses de egenskaper och brister dessa typer av plattformar kan påverkas av, i synnerhet de faktorer som kan vara relevanta för Play­tjänster. Att kunna organisera och underhålla de stora mängder media som erbjuds på dessa tjänster är avgörande för långsiktig lönsamhet, och för att uppnå detta måste redaktörerna förstå hur man mäter konsumtionen med hög tillförlitlighet i sin uppgift att ta väl grundade beslut. En innehållscentrerat (content­centric) tillvägagångssätt användes för att kunna fokusera på enskilda format (t.ex. TV­program) och de inbördes faktorer som kan beskriva dess konsumtion. Ett makroperspektiv applicerades initialt för att undersöka de globala faktorer som styr konsumtion. Vidare tillämpades en analys på mikronivå genom att undersöka spårningsdata kopplat till det innehåll som finns tillgängligt på plattformen. Underlaget för spårningsdatan bestod av ett helt års konsumtion (2014) från en av de största Play­tjänsterna i Sverige, TV3play.se. Framtagning av en ny metod för att mäta konsumtionen kallad Consumption Volume Score (CVS) föreslås och införs som ett alternativ till den traditionella metod som har varit att mäta den totala mängden av Videostarter (VS). Signifikansen av den nya metoden utvärderades genom jämförelse av rangordning av enskilda format baserat på CVS och VS samt olika kriterier. Resultaten visar att CVS för att mäta konsumtion ger ytterst liten eller ingen skillnad i ranking av mycket populära format, medan mindre konsumerade format hade en mer varierad förändring i rang. Vidare analys av en del av dessa format indikerade att de skulle kunna ha en nischad publik som uppskattar innehållet, trots relativt låg konsumption. För dessa format anser jag att det finns möjlighet för redaktörer att manuellt handplocka dem för att optimera konsumtionen ytterligare. Resultaten ger underlag för godta CVS som en signifikant mätenhet för konsumtion och kan bidra till att förstå hur enskilda format presterar, särskilt mindre konsumerade och potentiellt nischade sådana. Framtida forskning om CVS som metod för att mäta konsumtion rekommenderas, i synnerhet för att avgöra hur väl det lämpas att applicera i en skarp miljö.

Untersuchungen zur Reaktion von Proteinen während einer Hochdruckbehandlung (HD) ermöglichen ein besseres Verständnis der Reaktivität und Struktur auf molekularer Ebene. In der vorliegenden Arbeit wurde die enzymatische Oligomerisierung von Hühnereiweißlysozym (HEWL) mithilfe der druckstabilen mikrobiellen Transglutaminase (mTGase) unter HD untersucht. Die resultierenden Oligomere wurden anschließend hinsichtlich ihrer strukturellen und funktionellen Eigenschaften charakterisiert. Vergleichende Untersuchungen wurden mit dem evolutionsbiologisch verwandten Protein, dem α-Lactalbumin durchgeführt. Abschließend erfolgten orientierende Studien zur nicht-enzymatischen Vernetzung von HEWL und ausgewählten Milchproteinen, bei welchen eine kovalente Verknüpfung über vergleichbare Isopeptide nachgewiesen werden konnte. Kompakte, globuläre Proteine, wie das untersuchte HEWL stellten unter Normaldruck keine Substrate für die mTGase dar. Auch war eine enzymatische Vernetzung nach erfolgter Hochdruckbehandlung aufgrund der Reversibilität der druckinduzierten Auffaltung nicht möglich. So wurde HEWL nur bei simultaner Behandlung mit mTGase und hohem hydrostatischem Druck zu Homooligomeren vernetzt. Neben einem geeigneten Puffersystem wurden der pH-Wert, die Inkubationszeit, die Temperatur, der hydrostatische Druck, die Enzymaktivität der mTGase und die Proteinkonzentration des Lysozyms verändert. Abhängig von den Reaktionsbedingungen wurden Produkte mit stark variierenden Vernetzungsgraden erhalten, wobei eine maximale Oligomerisierung von zirka 75% aus einer 3%igen HEWL-Probe in Tris-HCl-Puffer bei pH 7,5 mit 160 U mTGase/g Protein über 30 min, 600 MPa und 40°C erreicht wurde. Zudem erfolgte eine Kategorisierung aller resultierenden Proben anhand ihres mittels Gelelektrophorese bestimmten Vernetzungsgrades in drei Untergruppen: LMW (niedrig vernetzt, 0 - 30%), MMW (mittel vernetzt, 30 - 60%) und HMW (hoch vernetzt, 60 - 100%). In den so vernetzten Proben wurden das reaktionsspezifisch gebildete Isopeptid N ε (γ L Glutamyl)-L-Lysin (Glu_Lys) nachgewiesen und die beteiligten reaktiven Aminosäuren identifiziert. Die Bestimmung von Glu_Lys, welches für die kovalenten Verknüpfungen verantwortlich ist, erfolgte nach enzymatischer Hydrolyse am Aminosäureanalysator mit Ninhydrin-Nachsäulen-Derivatisierung. Eine erste Abschätzung des Isopeptid¬gehaltes zeigte zudem, dass es bei der Oligomerisierung sowohl zu inter- als auch intra¬molekularer Vernetzung kam. Der minimal notwendige Gehalt an Cross-Link-Aminosäuren, [CLAA]min lag zum Teil um den Faktor zwei unter dem Gehalt des quantifizierten Glu_Lys. Anschließend konnte nach tryptischem Verdau über die RP-HPLC/ESI-TOF-MS für die gering vernetzten Proben (LMW) genau eine definierte kovalente Verknüpfungsstelle ermittelt werden. Für die MMW- und HMW-Proben wurden fünf bzw. sechs Peptidfragmente detektiert. Bei den LMW-Proben wurde Lys1 mit Gln121 vernetzt. Den höher oligomerisierten Proben konnten die Lysinreste Lys1, Lys13, Lys116 und die Glutaminreste Gln41, Gln57, Gln121 zugeordnet werden. Somit gelang eine erste strukturelle Aufklärung der Vernetzungsprodukte. Der Aufbau der Oligomere läuft demnach zuerst gerichtet und linear ab. Insbesondere bei höheren Temperaturen und Enzymaktivitäten werden jedoch ungeordnete Strukturen gebildet. Die einzelnen Vernetzungsprodukte scheinen aufgrund der Lage der reaktiven Aminosäuren im HEWL-Molekül über mehrere intermolekulare Bindungen eine variierende Struktur auszubilden. Eine Quantifizierung der einzelnen Isopeptide erfolgte nicht, orientierende MS-Untersuchungen lassen aber vermuten, dass auch hier bevorzugte Reaktionsorte existieren. Die vernetzten Proben wurden nachfolgend über Ammoniumsulfatfällung konzentriert und mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) fraktioniert. Die Ausbeuten der GPC waren sehr gering. Eine Fraktionierung in einzelne, selektiv verknüpfte Oligomere wurde nicht erreicht. Die enzymatisch oligomerisierten Proben sowie ausgewählte GPC-Fraktionen mit höheren Oligomeren wurden hinsichtlich funktioneller und struktureller Konsequenzen untersucht. Begonnen wurde dabei mit der lytischen Enzymaktivität des HEWL gegen Zellwände des Micrococcus lysodeikticus. Eine abnehmende bzw. verbleibende Lyseaktivität korrelierte mit einer zunehmenden Oberflächen¬hydrophobität der Oligomerengemische. Beide Größen verhielten sich indirekt proportional zueinander. Während der hydrophobe Kern des Moleküls mit steigender Oligomerisierungsrate freigelegt wurde, senkte sich die Lyseaktivität bis auf null ab. Eine räumliche Deformation oder Barriere entstand mutmaßlich im oder in der Nähe des reaktiven Zentrums (Glu35 und Asp52) des Lysozyms, so dass der Enzym-Substrat-Komplex nicht mehr ausgebildet werden konnte. Die Untersuchung der Veränderung sekundärer und tertiärer Strukturbestandteilte erfolgte mithilfe der Zirkular-Dichroismus-Spektroskopie. Gleichwohl für die Tertiärstruktur keine großen Veränderungen aufgezeigt wurden, ist für die Sekundärstruktur mit zunehmendem Vernetzungsgrad eine Abnahme der α-Helices und eine Zunahme von ungeordneten und β Faltblatt-Bereichen detektiert worden. Es konnte daher die unter Hochdruck bekannte Auffaltung des HEWL über die enzymatische Vernetzung derart stabilisiert werden, dass eine vollständige Rückfaltung nicht mehr gegeben war. Das Fibrillierungsverhalten der oligomerisierten Proben im Sauren im Vergleich zum unbehandelten HEWL stellte eine weitere Charakterisierungsmöglichkeit dar. Die Analyse der inkubierten Proben erfolgte mithilfe dreier photometrischer Methoden (Umsetzung mit den Reagenzien 8-Anilino-1-naphtalinsulfonsäure, Kongorot oder Thioflavin T). Die fibrillierten Proben wurden zudem transmissionselektronenmikroskopisch (TEM) untersucht. Mit zunehmender Vernetzung war dabei eine abnehmende Fibrillierungsneigung zu beobachten, welche gut strukturell zu erklären ist, da die zusätzlichen, kovalenten Isopeptidbindungen die Proteinmoleküle gegen eine saure Auffaltung stabilisieren. Eine Auffaltung ist jedoch die Grundvoraussetzung für eine Assoziation und Bildung in-vitro-induzierter, amyloider Strukturen. Ferner wurde das antimikrobielle Verhalten der Präparate gegen grampositive und -negative Mikroorganismen getestet. Unbehandeltes Lysozym zeigt grundsätzlich gegenüber grampositiven Mikroorganismen eine gute antimikrobielle Aktivität. Eingesetzt wurden der Agardiffusions- und der bakterielle Hemmtest (Trübungsassay). Hierbei zeigten alle geprüften Proben keine Wirkung gegenüber gramnegativen Bakterien. Die antimikrobielle Wirkung gegenüber den grampositiven Mikroorganismen variierte stark. Das Phänomen der erhöhten Sensibilität gegenüber ausgewählten Bakterienstämmen im niederkonzentrierten Bereich wurde für Bacillus subtilis (grampositiv) und die mittel- bzw. hochvernetzten Proben im Vergleich zu unbehandelten HEWL (je 0,00625% Probe, w/v) reproduzierbar nachgewiesen. Auf die umfassende Charakterisierung der enzymatisch vernetzten HEWL-Proben folgten orientierende Vergleichsstudien mit dem evolutionsbiologisch verwandten α Lactalbumin (α-LA). Die enzymatische Oligomerisierung konnte für das Molkenprotein dabei im Gegensatz zum HEWL bereits unter Atmosphärendruck erzielt werden. Die Vernetzungsraten betrugen, unabhängig von den untersuchten Rahmenparametern aber abhängig vom Calciumgehalt, zirka 35% (mit Ca) bis 72% (ohne Ca). Das α-LA als Calcium-bindendes Protein wurde somit durch die Abwesenheit des Metallions derart destabilisiert, dass es für die mTGase besser umsetzbar wurde. Die im Vergleich zum Lysozym vermehrt enthaltenen potentiell reaktiven Aminosäuren (doppelt so viel Lys und Gln) trugen ebenfalls zu einer stärkeren Oligomerisierung bei. Abschließend erfolgten Studien zu nicht-enzymatischen, vakuuminduzierten Kondensations-reaktionen. Dabei wurde trockenes HEWL im Vakuum thermisch induziert vernetzt. Die Methode ist in der Literatur als Zero-Length-Cross-Linking (ZLCL) beschrieben. Die Untersuchung der Parameter Vakuum, Temperatur, pH-Wert und Zyklenzahl erfolgte an dem globulären Protein. Dieses konnte unter nicht denaturierenden Bedingungen bis zum Di- und Trimer vernetzt werden. Weitere Milchproteinproben (ein Molkenproteinisolat und β-Casein) wurden nur exemplarisch unter Standardbedingungen untersucht. Hierbei wurde das Molkenproteinisolat deutlich besser als HEWL und das β-Casein bei 85°C über je 24 h und Einsatz von Vakuum am stärksten oligomerisiert. Die gute Umsetzung des β-Caseins ist dabei auf die fehlende Tertiär- und Sekundärstruktur zurückzuführen. Zum Teil entstanden auch Casein-Polymere, welche nicht mehr elektrophoresegängig waren. Die beteiligten Isopeptide wurden analog zu den enzymatisch vernetzten Proben über die Aminosäureanalytik nachgewiesen. Es konnte das Isopeptid N-ε-(β-Aspartyl-)Lysin (Asp_Lys) neben Lysinoalanin (LAL), aber kein Glu_Lys in HEWL nachgewiesen werden. Beide Isopeptide (Asp_Lys und Glu_Lys) sowie LAL sind dagegen im β Casein gebildet worden. Der Einfluss struktureller Gegebenheiten auf die Reaktionsfähigkeit der Proteine konnte folglich eindeutig belegt werden.

Im Rahmen dieser Arbeit ist es durch die kombinierte Anwendung von P-31 Flüssigkeits (HR)- NMR-Spektroskopie sowie dynamischer Lichtstreuung (DLS) gelungen, die supramolekulare Struktur von mizellarem Casein aus ultrahocherhitzter (UHT) Milch unter dem Einfluss einer enzymatischen Vernetzung mittels mikrobieller Transglutaminase (mTG) zu charakterisieren. Die P-31 HR NMR-Spektroskopie erweist sich dabei als hervorragende Methode, um sowohl den Einbau von Casein aus dem Milchserum in die mizellaren Aggregate durch die enzymatische Reaktion als auch die bevorzugte mTG Vernetzung des beta-Caseins nachzuweisen. Durch die Kombination von P-31 HR NMR-Spektroskopie und Messungen der dynamischen Lichtstreuung war es weiterhin möglich, das Vorliegen vernetzter Caseinaggregate in Dispersionen mTG-behandelter Caseine zu belegen und besonders den Anteil an nicht vernetztem Casein „sichtbar“ zu machen, der durch EDTA-Zugabe aus den mTG-vernetzten Caseinnetzwerken freigesetzt wird. Es zeigt sich, dass die Caseinnetzwerke nach der EDTA-Behandlung eine geringere Proteindichte als mizellares Casein aufweisen, da sie nur ca. 20 % des Serinphosphats des mizellaren Caseins enthalten. P-31 Festkörper-NMR-spektroskopische Messungen legen außerdem nahe, dass die Beweglichkeit des phosphorylierten Ser149-Restes des kappa-Caseins in der äußeren Schicht der mizellaren Caseinaggregate durch die mTG-Behandlung nicht wesentlich verändert wird. Um die erhaltenen Caseinnetzwerke im Hinblick auf ihr Anwendungspotential zu untersuchen, wurden sie als Proteinkomponente bei der biomimetischen Calciumphosphatfällung sowie als Trägerstrukturen für bioaktives Lysozym verwendet. Durch den Einsatz von Caseinnetzwerken als Fällungsmedium während der Präzipitation von Calciumphosphat (CaP) ist es gelungen, eine hydratisierte, apatitische Phase zu stabilisieren, die sowohl ungeordnete als auch kristalline Bereiche enthält und damit strukturelle Ähnlichkeit zu biologisch und besonders biomimetisch gebildetem Apatit besitzt. Die in den Präzipitaten ebenfalls vorhandenen Phosphoratome in einer relativ ungeordneten OCP (Octacalciumphosphat)-ähnlichen Umgebung stehen höchstwahrscheinlich mit der apatitischen Phase in räumlich engem Kontakt und sind damit entweder Bestandteil dieser Phase oder befinden sich in einer getrennten Phase, die jedoch mit der apatitischen Phase in Form eines Nanokomposits mit sehr kleinen, eng benachbarten Kristalliten vorliegt. Bei der Fällung des Caseinnetzwerk/CaP-Präzipitats wird ebenfalls eine Dicalciumphosphat-Dihydrat (DCPD)-Phase gebildet. Diese ist separiert von den anderen CaP-Phasen und tritt in wesentlich geringerem Maße auf als in einem reinen CaP-Präzipitat, das ohne Proteinkomponente gefällt wurde. Damit konnte gezeigt werden, dass unter Bedingungen, bei denen ohne Proteinkomponente größtenteils DCPD entsteht, die Caseinnetzwerke eine apatitische Phase stabilisieren, die strukturelle Ähnlichkeit zu biologisch und biomimetisch gebildetem Apatit aufweist. Die qualitativ gleichen Ergebnisse konnten für vergleichsweise untersuchtes unvernetztes Casein gefunden werden. Die Caseinnetzwerke zeigen jedoch in Bezug auf die apatitische Phase einen stärkeren Stabilisierungseffekt als unvernetztes Casein. Es ist denkbar, dass dies unter anderem darauf zurückzuführen ist, dass die Phosphatzentren in den Caseinnetzwerken im Gegensatz zu Casein frei von CaP-Brücken sind, da diese durch die EDTA-Behandlung entfernt wurden. Da die Caseinnetzwerke zudem eine geringere Proteindichte und damit eine höhere „Porosität“ als die mizellaren Caseinaggregate aufweisen, kann sich die apatitische Phase möglicherweise auch innerhalb der Netzwerke bilden, während dies für die mizellaren Caseinaggregate wahrscheinlich nur begrenzt möglich ist. In der vorliegenden Arbeit konnte ebenfalls gezeigt werden, dass sich Caseinnetzwerke grundsätzlich als Transportsysteme für Lysozym eignen, da sie eine hohe Stabilität aufweisen und erfolgreich mit Lysozym beladen werden können. Während die Assoziation von Lysozym mit mizellaren Caseinaggregaten, die aus UHT-Milch gewonnenen wurden, zu einem fast vollständigen Verlust der Lysozymaktivität führt, bleibt die Aktivität des Enzyms bei der Bindung an Caseinnetzwerke erhalten. Das Anwendungspotential der Caseinnetzwerk/Lysozym-Assoziate wurde im Rahmen von zahnmedizinischen Versuchen in vitro und in situ untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Caseinnetzwerk/Lysozym-Assoziate in vitro eine dauerhafte Immobilisierung des Lysozyms in der in situ gebildeten Pellikel bewirken. Eine deutliche Anreicherung des Enzyms in situ wird mithilfe der Caseinnetzwerke allerdings nicht beobachtet. Dies könnte darin begründet sein, dass die im Vergleich zu den in vitro vorgefundenen Verhältnissen deutlich komplexeren Bedingungen in situ zu einem selektiveren Anreicherungsprozess von Enzymen in der Pellikel führen.

Im Rahmen dieser Arbeit ist es durch die kombinierte Anwendung von P-31 Flüssigkeits (HR)- NMR-Spektroskopie sowie dynamischer Lichtstreuung (DLS) gelungen, die supramolekulare Struktur von mizellarem Casein aus ultrahocherhitzter (UHT) Milch unter dem Einfluss einer enzymatischen Vernetzung mittels mikrobieller Transglutaminase (mTG) zu charakterisieren. Die P-31 HR NMR-Spektroskopie erweist sich dabei als hervorragende Methode, um sowohl den Einbau von Casein aus dem Milchserum in die mizellaren Aggregate durch die enzymatische Reaktion als auch die bevorzugte mTG Vernetzung des beta-Caseins nachzuweisen. Durch die Kombination von P-31 HR NMR-Spektroskopie und Messungen der dynamischen Lichtstreuung war es weiterhin möglich, das Vorliegen vernetzter Caseinaggregate in Dispersionen mTG-behandelter Caseine zu belegen und besonders den Anteil an nicht vernetztem Casein „sichtbar“ zu machen, der durch EDTA-Zugabe aus den mTG-vernetzten Caseinnetzwerken freigesetzt wird. Es zeigt sich, dass die Caseinnetzwerke nach der EDTA-Behandlung eine geringere Proteindichte als mizellares Casein aufweisen, da sie nur ca. 20 % des Serinphosphats des mizellaren Caseins enthalten. P-31 Festkörper-NMR-spektroskopische Messungen legen außerdem nahe, dass die Beweglichkeit des phosphorylierten Ser149-Restes des kappa-Caseins in der äußeren Schicht der mizellaren Caseinaggregate durch die mTG-Behandlung nicht wesentlich verändert wird. Um die erhaltenen Caseinnetzwerke im Hinblick auf ihr Anwendungspotential zu untersuchen, wurden sie als Proteinkomponente bei der biomimetischen Calciumphosphatfällung sowie als Trägerstrukturen für bioaktives Lysozym verwendet. Durch den Einsatz von Caseinnetzwerken als Fällungsmedium während der Präzipitation von Calciumphosphat (CaP) ist es gelungen, eine hydratisierte, apatitische Phase zu stabilisieren, die sowohl ungeordnete als auch kristalline Bereiche enthält und damit strukturelle Ähnlichkeit zu biologisch und besonders biomimetisch gebildetem Apatit besitzt. Die in den Präzipitaten ebenfalls vorhandenen Phosphoratome in einer relativ ungeordneten OCP (Octacalciumphosphat)-ähnlichen Umgebung stehen höchstwahrscheinlich mit der apatitischen Phase in räumlich engem Kontakt und sind damit entweder Bestandteil dieser Phase oder befinden sich in einer getrennten Phase, die jedoch mit der apatitischen Phase in Form eines Nanokomposits mit sehr kleinen, eng benachbarten Kristalliten vorliegt. Bei der Fällung des Caseinnetzwerk/CaP-Präzipitats wird ebenfalls eine Dicalciumphosphat-Dihydrat (DCPD)-Phase gebildet. Diese ist separiert von den anderen CaP-Phasen und tritt in wesentlich geringerem Maße auf als in einem reinen CaP-Präzipitat, das ohne Proteinkomponente gefällt wurde. Damit konnte gezeigt werden, dass unter Bedingungen, bei denen ohne Proteinkomponente größtenteils DCPD entsteht, die Caseinnetzwerke eine apatitische Phase stabilisieren, die strukturelle Ähnlichkeit zu biologisch und biomimetisch gebildetem Apatit aufweist. Die qualitativ gleichen Ergebnisse konnten für vergleichsweise untersuchtes unvernetztes Casein gefunden werden. Die Caseinnetzwerke zeigen jedoch in Bezug auf die apatitische Phase einen stärkeren Stabilisierungseffekt als unvernetztes Casein. Es ist denkbar, dass dies unter anderem darauf zurückzuführen ist, dass die Phosphatzentren in den Caseinnetzwerken im Gegensatz zu Casein frei von CaP-Brücken sind, da diese durch die EDTA-Behandlung entfernt wurden. Da die Caseinnetzwerke zudem eine geringere Proteindichte und damit eine höhere „Porosität“ als die mizellaren Caseinaggregate aufweisen, kann sich die apatitische Phase möglicherweise auch innerhalb der Netzwerke bilden, während dies für die mizellaren Caseinaggregate wahrscheinlich nur begrenzt möglich ist. In der vorliegenden Arbeit konnte ebenfalls gezeigt werden, dass sich Caseinnetzwerke grundsätzlich als Transportsysteme für Lysozym eignen, da sie eine hohe Stabilität aufweisen und erfolgreich mit Lysozym beladen werden können. Während die Assoziation von Lysozym mit mizellaren Caseinaggregaten, die aus UHT-Milch gewonnenen wurden, zu einem fast vollständigen Verlust der Lysozymaktivität führt, bleibt die Aktivität des Enzyms bei der Bindung an Caseinnetzwerke erhalten. Das Anwendungspotential der Caseinnetzwerk/Lysozym-Assoziate wurde im Rahmen von zahnmedizinischen Versuchen in vitro und in situ untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Caseinnetzwerk/Lysozym-Assoziate in vitro eine dauerhafte Immobilisierung des Lysozyms in der in situ gebildeten Pellikel bewirken. Eine deutliche Anreicherung des Enzyms in situ wird mithilfe der Caseinnetzwerke allerdings nicht beobachtet. Dies könnte darin begründet sein, dass die im Vergleich zu den in vitro vorgefundenen Verhältnissen deutlich komplexeren Bedingungen in situ zu einem selektiveren Anreicherungsprozess von Enzymen in der Pellikel führen.

Untersuchungen zur Reaktion von Proteinen während einer Hochdruckbehandlung (HD) ermöglichen ein besseres Verständnis der Reaktivität und Struktur auf molekularer Ebene. In der vorliegenden Arbeit wurde die enzymatische Oligomerisierung von Hühnereiweißlysozym (HEWL) mithilfe der druckstabilen mikrobiellen Transglutaminase (mTGase) unter HD untersucht. Die resultierenden Oligomere wurden anschließend hinsichtlich ihrer strukturellen und funktionellen Eigenschaften charakterisiert. Vergleichende Untersuchungen wurden mit dem evolutionsbiologisch verwandten Protein, dem α-Lactalbumin durchgeführt. Abschließend erfolgten orientierende Studien zur nicht-enzymatischen Vernetzung von HEWL und ausgewählten Milchproteinen, bei welchen eine kovalente Verknüpfung über vergleichbare Isopeptide nachgewiesen werden konnte. Kompakte, globuläre Proteine, wie das untersuchte HEWL stellten unter Normaldruck keine Substrate für die mTGase dar. Auch war eine enzymatische Vernetzung nach erfolgter Hochdruckbehandlung aufgrund der Reversibilität der druckinduzierten Auffaltung nicht möglich. So wurde HEWL nur bei simultaner Behandlung mit mTGase und hohem hydrostatischem Druck zu Homooligomeren vernetzt. Neben einem geeigneten Puffersystem wurden der pH-Wert, die Inkubationszeit, die Temperatur, der hydrostatische Druck, die Enzymaktivität der mTGase und die Proteinkonzentration des Lysozyms verändert. Abhängig von den Reaktionsbedingungen wurden Produkte mit stark variierenden Vernetzungsgraden erhalten, wobei eine maximale Oligomerisierung von zirka 75% aus einer 3%igen HEWL-Probe in Tris-HCl-Puffer bei pH 7,5 mit 160 U mTGase/g Protein über 30 min, 600 MPa und 40°C erreicht wurde. Zudem erfolgte eine Kategorisierung aller resultierenden Proben anhand ihres mittels Gelelektrophorese bestimmten Vernetzungsgrades in drei Untergruppen: LMW (niedrig vernetzt, 0 - 30%), MMW (mittel vernetzt, 30 - 60%) und HMW (hoch vernetzt, 60 - 100%). In den so vernetzten Proben wurden das reaktionsspezifisch gebildete Isopeptid N ε (γ L Glutamyl)-L-Lysin (Glu_Lys) nachgewiesen und die beteiligten reaktiven Aminosäuren identifiziert. Die Bestimmung von Glu_Lys, welches für die kovalenten Verknüpfungen verantwortlich ist, erfolgte nach enzymatischer Hydrolyse am Aminosäureanalysator mit Ninhydrin-Nachsäulen-Derivatisierung. Eine erste Abschätzung des Isopeptid¬gehaltes zeigte zudem, dass es bei der Oligomerisierung sowohl zu inter- als auch intra¬molekularer Vernetzung kam. Der minimal notwendige Gehalt an Cross-Link-Aminosäuren, [CLAA]min lag zum Teil um den Faktor zwei unter dem Gehalt des quantifizierten Glu_Lys. Anschließend konnte nach tryptischem Verdau über die RP-HPLC/ESI-TOF-MS für die gering vernetzten Proben (LMW) genau eine definierte kovalente Verknüpfungsstelle ermittelt werden. Für die MMW- und HMW-Proben wurden fünf bzw. sechs Peptidfragmente detektiert. Bei den LMW-Proben wurde Lys1 mit Gln121 vernetzt. Den höher oligomerisierten Proben konnten die Lysinreste Lys1, Lys13, Lys116 und die Glutaminreste Gln41, Gln57, Gln121 zugeordnet werden. Somit gelang eine erste strukturelle Aufklärung der Vernetzungsprodukte. Der Aufbau der Oligomere läuft demnach zuerst gerichtet und linear ab. Insbesondere bei höheren Temperaturen und Enzymaktivitäten werden jedoch ungeordnete Strukturen gebildet. Die einzelnen Vernetzungsprodukte scheinen aufgrund der Lage der reaktiven Aminosäuren im HEWL-Molekül über mehrere intermolekulare Bindungen eine variierende Struktur auszubilden. Eine Quantifizierung der einzelnen Isopeptide erfolgte nicht, orientierende MS-Untersuchungen lassen aber vermuten, dass auch hier bevorzugte Reaktionsorte existieren. Die vernetzten Proben wurden nachfolgend über Ammoniumsulfatfällung konzentriert und mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) fraktioniert. Die Ausbeuten der GPC waren sehr gering. Eine Fraktionierung in einzelne, selektiv verknüpfte Oligomere wurde nicht erreicht. Die enzymatisch oligomerisierten Proben sowie ausgewählte GPC-Fraktionen mit höheren Oligomeren wurden hinsichtlich funktioneller und struktureller Konsequenzen untersucht. Begonnen wurde dabei mit der lytischen Enzymaktivität des HEWL gegen Zellwände des Micrococcus lysodeikticus. Eine abnehmende bzw. verbleibende Lyseaktivität korrelierte mit einer zunehmenden Oberflächen¬hydrophobität der Oligomerengemische. Beide Größen verhielten sich indirekt proportional zueinander. Während der hydrophobe Kern des Moleküls mit steigender Oligomerisierungsrate freigelegt wurde, senkte sich die Lyseaktivität bis auf null ab. Eine räumliche Deformation oder Barriere entstand mutmaßlich im oder in der Nähe des reaktiven Zentrums (Glu35 und Asp52) des Lysozyms, so dass der Enzym-Substrat-Komplex nicht mehr ausgebildet werden konnte. Die Untersuchung der Veränderung sekundärer und tertiärer Strukturbestandteilte erfolgte mithilfe der Zirkular-Dichroismus-Spektroskopie. Gleichwohl für die Tertiärstruktur keine großen Veränderungen aufgezeigt wurden, ist für die Sekundärstruktur mit zunehmendem Vernetzungsgrad eine Abnahme der α-Helices und eine Zunahme von ungeordneten und β Faltblatt-Bereichen detektiert worden. Es konnte daher die unter Hochdruck bekannte Auffaltung des HEWL über die enzymatische Vernetzung derart stabilisiert werden, dass eine vollständige Rückfaltung nicht mehr gegeben war. Das Fibrillierungsverhalten der oligomerisierten Proben im Sauren im Vergleich zum unbehandelten HEWL stellte eine weitere Charakterisierungsmöglichkeit dar. Die Analyse der inkubierten Proben erfolgte mithilfe dreier photometrischer Methoden (Umsetzung mit den Reagenzien 8-Anilino-1-naphtalinsulfonsäure, Kongorot oder Thioflavin T). Die fibrillierten Proben wurden zudem transmissionselektronenmikroskopisch (TEM) untersucht. Mit zunehmender Vernetzung war dabei eine abnehmende Fibrillierungsneigung zu beobachten, welche gut strukturell zu erklären ist, da die zusätzlichen, kovalenten Isopeptidbindungen die Proteinmoleküle gegen eine saure Auffaltung stabilisieren. Eine Auffaltung ist jedoch die Grundvoraussetzung für eine Assoziation und Bildung in-vitro-induzierter, amyloider Strukturen. Ferner wurde das antimikrobielle Verhalten der Präparate gegen grampositive und -negative Mikroorganismen getestet. Unbehandeltes Lysozym zeigt grundsätzlich gegenüber grampositiven Mikroorganismen eine gute antimikrobielle Aktivität. Eingesetzt wurden der Agardiffusions- und der bakterielle Hemmtest (Trübungsassay). Hierbei zeigten alle geprüften Proben keine Wirkung gegenüber gramnegativen Bakterien. Die antimikrobielle Wirkung gegenüber den grampositiven Mikroorganismen variierte stark. Das Phänomen der erhöhten Sensibilität gegenüber ausgewählten Bakterienstämmen im niederkonzentrierten Bereich wurde für Bacillus subtilis (grampositiv) und die mittel- bzw. hochvernetzten Proben im Vergleich zu unbehandelten HEWL (je 0,00625% Probe, w/v) reproduzierbar nachgewiesen. Auf die umfassende Charakterisierung der enzymatisch vernetzten HEWL-Proben folgten orientierende Vergleichsstudien mit dem evolutionsbiologisch verwandten α Lactalbumin (α-LA). Die enzymatische Oligomerisierung konnte für das Molkenprotein dabei im Gegensatz zum HEWL bereits unter Atmosphärendruck erzielt werden. Die Vernetzungsraten betrugen, unabhängig von den untersuchten Rahmenparametern aber abhängig vom Calciumgehalt, zirka 35% (mit Ca) bis 72% (ohne Ca). Das α-LA als Calcium-bindendes Protein wurde somit durch die Abwesenheit des Metallions derart destabilisiert, dass es für die mTGase besser umsetzbar wurde. Die im Vergleich zum Lysozym vermehrt enthaltenen potentiell reaktiven Aminosäuren (doppelt so viel Lys und Gln) trugen ebenfalls zu einer stärkeren Oligomerisierung bei. Abschließend erfolgten Studien zu nicht-enzymatischen, vakuuminduzierten Kondensations-reaktionen. Dabei wurde trockenes HEWL im Vakuum thermisch induziert vernetzt. Die Methode ist in der Literatur als Zero-Length-Cross-Linking (ZLCL) beschrieben. Die Untersuchung der Parameter Vakuum, Temperatur, pH-Wert und Zyklenzahl erfolgte an dem globulären Protein. Dieses konnte unter nicht denaturierenden Bedingungen bis zum Di- und Trimer vernetzt werden. Weitere Milchproteinproben (ein Molkenproteinisolat und β-Casein) wurden nur exemplarisch unter Standardbedingungen untersucht. Hierbei wurde das Molkenproteinisolat deutlich besser als HEWL und das β-Casein bei 85°C über je 24 h und Einsatz von Vakuum am stärksten oligomerisiert. Die gute Umsetzung des β-Caseins ist dabei auf die fehlende Tertiär- und Sekundärstruktur zurückzuführen. Zum Teil entstanden auch Casein-Polymere, welche nicht mehr elektrophoresegängig waren. Die beteiligten Isopeptide wurden analog zu den enzymatisch vernetzten Proben über die Aminosäureanalytik nachgewiesen. Es konnte das Isopeptid N-ε-(β-Aspartyl-)Lysin (Asp_Lys) neben Lysinoalanin (LAL), aber kein Glu_Lys in HEWL nachgewiesen werden. Beide Isopeptide (Asp_Lys und Glu_Lys) sowie LAL sind dagegen im β Casein gebildet worden. Der Einfluss struktureller Gegebenheiten auf die Reaktionsfähigkeit der Proteine konnte folglich eindeutig belegt werden.:Abbildungsverzeichnis V Tabellenverzeichnis VIII Abkürzungsverzeichnis XI 1 Einleitung und Zielstellung 1 2 Theoretische Grundlagen 3 2.1 Lysozym 3 2.1.1 Wirkmechanismen des Lysozyms 4 2.1.2 Anwendungsmöglichkeiten von Lysozym 7 2.1.3 Modifizierung des Lysozyms 8 2.1.3.1 Fibrillen und amyloide Strukturen von HEWL 9 2.1.3.2 Neue biologische Funktionen durch Konformationsänderung 13 2.1.4 Evolutionäre Entwicklung und Verwandtschaft zu α-Lactalbumin 14 2.2 Die enzymatische Vernetzung 15 2.2.1 Mikrobielle Transglutaminase 15 2.2.1.1 TGase katalysierte Reaktionen und Reaktionsmechanismus 17 2.2.1.2 Analytische Aspekte 19 2.2.1.3 Einsatz in der Lebensmittelindustrie 19 2.3 Nicht-enzymatische Vernetzung 21 2.3.1 Thermisch induzierte Vernetzung 21 2.3.2 In-Vacuo Zero-Length Cross-Linking 23 2.3.3 Anwendungsmöglichkeiten nicht-enzymatisch vernetzter Proteine 23 2.4 Wirkung hoher hydrostatischer Drücke auf Proteine 24 2.4.1 Wirkung von Hochdruck auf Hühnereiweiß-Lysozym 26 2.4.2 Wirkung von Hochdruck auf die mikrobielle Transglutaminase 27 3 Experimenteller Teil 29 3.1 Chemikalien, Materialien, Geräte und Software 29 3.1.1 Chemikalien 29 3.1.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien 31 3.1.3 Untersuchungsmaterialien 33 3.1.4 Software 33 3.2 Erzeugung modifizierter Proteine 34 3.2.1 Enzymatische Vernetzung von Proteinen 34 3.2.1.1 Erzeugung von Protein-Oligomeren unter Hochdruck 34 3.2.1.2 Reinigung mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) 35 3.2.1.3 Konzentrierung durch Ammoniumsulfatfällung 35 3.2.2 Thermisches und Vakuum-induziertes Zero-length Cross-linking 36 3.3 Erzeugung von HEWL-Fibrillen 38 3.4 Isolierung von α-Lactalbumin 38 3.5 Dialyse der Proteinlösungen 39 3.6 Aktivität der Transglutaminase 39 3.7 Analytische Verfahren zur Strukturuntersuchung und Charakterisierung der Proteinproben 41 3.7.1 Restwasserbestimmung mittels Karl-Fischer-Titration 41 3.7.2 Proteinbestimmung mittels Lowry 42 3.7.3 Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 44 3.7.4 Aminosäureanalytik (ASA) 47 3.7.4.1 Saure Hydrolyse 49 3.7.4.2 Enzymatische Hydrolyse 49 3.7.5 Hochdruckflüssigchromatographie mit anschließender Massenspektroskopie (RP-HPLC/ESI-TOF-MS) 51 3.7.5.1 Probenvorbereitung - Tryptischer Verdau 51 3.7.5.2 RP-HPLC/ESI-TOF-MS-Messung 51 3.7.6 Aktivitätsbestimmung für HEWL und HEWL-haltige Proben 52 3.7.6.1 Klassische Methode - Trübungsassay 52 3.7.6.2 Modifizierte Methode der Aktivitätsermittlung mit Blue-ML 53 3.7.7 Methode zur Oberflächenhydrophobitätsermittlung 54 3.7.8 Bestimmung der Sekundär- und Tertiärstruktur mittels Zirkulardichroismus Spektroskopie (CD-Spektroskopie) 56 3.7.9 Charakterisierung der HEWL-Fibrillen 57 3.7.9.1 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure-Assay (ANS-Assay) 57 3.7.9.2 Kongorot-Assay 58 3.7.9.3 Thioflavin-T-Assay 59 3.7.9.4 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 61 3.7.10 Bestimmung der antimikrobiellen Wirksamkeit 62 3.7.10.1 Agardiffusionstest 62 3.7.10.2 Bakterieller Hemmtest 63 4 Ergebnisse und Diskussion 64 4.1 Enzymatische Vernetzung von HEWL mittels mTGase und Einfluss verschiedener Reaktionsparameter 64 4.1.1 Geeignete Puffersysteme und pH-Werte 67 4.1.2 Einfluss variierender Inkubationsdauer und unterschiedlicher Drücke 68 4.1.3 Einfluss der Lysozymkonzentration 70 4.1.4 Einfluss der mTGase-Aktivität 71 4.1.5 Temperatur 73 4.1.6 Optimierte Parameter für den höchstmöglichen Vernetzungsgrad 74 4.2 Analytik der Isopeptide 76 4.2.1 Identifizierung des N-ε-(γ-L-Glutamyl)-L-Lysin-Isopeptids (Glu_Lys) 76 4.2.2 Beurteilung einer intra- und intermolekularen Vernetzung 79 4.2.3 Lokalisierung der reaktiven Lysin- und Glutaminreste mittels HPLC/MS 80 4.2.4 Strukturvorschlag 88 4.3 Isolierung und Konzentrierung enzymatisch vernetzter Lysozym-Oligomere 89 4.3.1 Ammoniumsulfatfällung 89 4.3.2 Ergebnisse der Gelpermeationschromatographie 91 4.4 Funktionelle Charakterisierung der LMW-, MMW- und HMW-Proben des HEWL 96 4.4.1 Vergleichende Untersuchungen der verbleibenden Enzymaktivität 97 4.4.2 Beurteilung der Oberflächenhydrophobität 100 4.4.3 Veränderung der Sekundär- und Tertiärstruktur 104 4.4.4 Fibrillbildung und -eigenschaften von HEWL 109 4.4.4.1 Etablierung der Charakterisierungmethoden für HEWL-Fibrillen 110 4.4.4.2 Fibrillinduktion an HEWL-Präparaten ausgewählter Vernetzungsgrade 118 4.4.5 Antimikrobielle Wirksamkeit gegenüber grampositiven und gramnegativen Mikroorganismen 126 4.5 Vergleichende Untersuchungen an dem strukturanalogen Protein α-Lactalbumin 137 4.6 Orientierende Untersuchungen zur nicht-enzymatischen In-Vakuo-Thermo-Vernetzung von HEWL und ausgesuchten Proteinen 142 4.6.1 Einfluss verschiedener Reaktionsparameter auf die Vernetzung von HEWL 143 4.6.2 Identifizierung der gebildeten Isopeptide 145 4.6.3 Vergleich der nicht-enzymatischen und enzymatischen Vernetzung von HEWL 146 4.6.4 Vergleich der In-Vakuo-Thermo-Vernetzung an HEWL mit β-Casein und erste Untersuchungen an einem Molkenproteinisolat 149 4.7 Fazit der Untersuchungen zur enzymatischen und der nicht-enzymatischen Vernetzung verschiedener Proteine 152 5 Zusammenfassung 154 6 Literaturverzeichnis 157 Veröffentlichungen 172 Danksagung 173 Versicherung 174

Kinetic inactivation of factor XIIIa and MTG were performed in a pressure range from 0.1 to 400 MPa at 40°C within a time from 0 to 60 min in a TRIS-acetate buffer at pH 6.0. The inactivation of both enzymes at these conditions followed a first order reaction model. The high inactivation rate constant of 26.6 x10-3/min-1 for factor XIIIa at low pressure (50 MP) indicated that this enzyme is much easier to inactivate than MTG, which achieved an inactivation rate constant value of 9.7 x10-3/min at higher pressure (200 MPa). An inactivation volume of –10.17±0.5 cm3/mol confirmed that MTG is very stable under high pressure. The stability of MTG under high pressure and thermal treatment was related to its conformational changes. Enzyme inactivation was accompanied by secondary and tertiary structure changes until an irreversible protein precipitation is achieved. The tertiary structure, represented by circular dichroism spectra in the aromatic region showed differences among native and MTG samples treated under high pressure, as well as at elevated temperature. Tyrosine bands, indicating protein unfolding, increased proportionally with increasing pressure treatment above 400 MPa. Nevertheless, compared to pressure, a maximal enhancement could be observed after thermal treatment at 0.1 MPa at 80°C. That demonstrated the exposure of hydrophobic groups to the protein surface with a concomitant protein unfolding. The spectra in the far ultraviolet region showed that increasing high pressure and high temperature lead to alterations in the secondary structure. The mathematical algorithms CONTIN used to calculate secondary structures stated that the 24.5% of alpha-helix of native MTG decreased to 17.2% after a treatment at 400 MPa at 40°C for 60 min and to 6.5% after a treatment at 0.1 MPa at 80°C for 2 min. However, beta-strand structures remained relatively stable after these several treatments. MTG is arranged in a way that the active site is located between beta-strand domains that are surrounded by alpha-helices, the results of this investigation suggested that MTG activity is related with the relative stability of alpha-helix and the outstanding stability of the central beta-strand structure. The irreversible precipitated protein observed at 600 MPa at 40°C for 60 min and 0.1 MPa at 80°C for 2 min was caused principally by the formation of disulfides bonds, because high pressure and high thermal treatment lead to the exposition of the Cys64 residue towards the solvent with the subsequent ability to react with neighbouring cysteine residues. Furthermore, the reaction between protein and reducing sugars resulted in the formation of Maillard products. Furosine, as an indicator of the early stages of Maillard reaction was measured. Concentration values of 261.0 mg/g protein from samples treated at 600 MPa and 40°C and 238.5 mg/g protein from samples treated at and 0.1 MPa and 80°C for 2 min were obtained. Pentosidine a subsequent product observed in the advanced Maillard reaction was also present. Concentrations of 13.7 and 6.7 mg/g protein were obtained in the samples treated at 600 MPa and 40°C for 60 min and 0.1 MPa and 80°C for 2 min, respectively. Kinetic inactivation studies of MTG in a pressure range from 0.1 to 600 MPa at 10, 30, 40, and 50°C within a long time range from 0 to 140 h were performed in order to study MTG stability under the simultaneous effect of pressure and temperature. The inactivation kinetic showed a first and very fast step and a second very slow step suggesting irreversible inactivation behaviour. Activation energy and entropy difference decreased with increasing pressure. Thereby, the inactivation rate constants of enzyme were less temperature dependent at high pressure. The effect of pressure and temperature on MTG inactivation had a synergistic behaviour. At temperatures of 10, 30, and 40°C, increasing pressure leads to increasing inactivation rate constants. However at 50°C a tendency change occurred. Negative activation volumes of –16.2±0.5, -13.6±0.1, -11.2±0.3 cm3/mol were obtained for 10, 30 and 40°C respectively and for treatment at 50°C a positive value of about +3.0±2.0 cm3/mol in a pressure range from 0.1 to 300 and a negative volume of –11.0±0.4 cm3/mol MPa from 300 to 600 MPa were calculated. A pressure/temperature diagram from inactivation rate constants was performed to represent MTG stability. The diagram shows that in a pressure and temperature range from 0.1 to 550 MPa and 10 to 40°C, pressure induces MTG stabilization against heat denaturation. At 50°C in range from 0.1 to 300 MPa, pressure induces also enzyme stabilization again heat denaturation, but at the same temperature and above 300 MPa the enzyme was inactivated. After MTG stability analysis, reaction kinetics from MTG with individual caseins in a TRIS-acetate buffer pH 6.0 were performed under atmospheric pressure (0.1 MPa) and high pressure (400 MPa) at 40°C. The reaction was monitored by gel permeation chromatography under in three assumptions: 1) The initial velocity kinetics was obtained from a non-progressive enzymatic reactions with the products. 2) The substrate concentration exceeded enzyme concentration. 3) The sum of the individual catalytic constants of the reactive glutamine residues inside caseins are represented by a single MTG-monomeric casein complex. Enzyme reaction kinetics of MTG with the individual caseins carried out at 0.1 MPa at 40°C showed Michaelis-Menten-Henri behaviour with maximal velocities of 2.7 x 10-3, 0.8 x 10-3, and 1.3 x 10-3 mmol/L∙min and Km values of 59 x 10-3, 64 x 10-3 and 50 x 10-3 mmol/L of beta-, alpha-s1-, and whole-casein, respectively. This suggested that MTG achieved a maximal velocity with ß-casein, but had the best affinity with acid casein followed by beta- casein and finally alpha-s1-casein. Enzyme reaction kinetics of beta-casein carried out at 400 MPa and 40°C also showed a Michaelis-Menten-Henri behaviour with a similar maximal velocity of 2.6 x 10-3 mmol/L×min, but the Km value of 144 x 10-3 mmol/L showing kinetical similarity to a non-competitive inhibition. The reaction of MTG with alpha-s1-casein under high pressure did not fit in to Henri-Michaelis-Menten kinetics. Kinetic parameters showed that the affinity of MTG to beta- and alpha-s1-casein under atmospheric pressure is higher than the affinity of MTG to these caseins under high pressure. This loss of affinity can be explained by a constant number of reactive glutamine residues of casein, although the protein is unfolding at high pressure, a decrease of enzyme activity of MTG to 74% after treatment at 400 MPa at 40°C for 15 min and self association of casein under thermal and high pressure treatment. Fur technological application, the formation of acid milk gels was studied under the influence of MTG within its range of pH stability. Simultaneous addition of MTG and different concentrations of glucono-delta-lactone (Gdl) to casein solutions (5% w/v) at 40°C was analysed. Gels firmness was accessed by oscillation rheometry and gel permeation chromatography. Oscillation rheometry data showed that the time of gelation decreased with an increasing Gdl concentration added to the system, however higher concentrations of Gdl caused the formation of weaker gels. Addition of 1 g Gdl/g protein without MTG caused gelation within 5 min and a storage module value G´ of 48.9 Pa. With the simultaneous addition of 1 g Gdl/g protein and 6 U MTG/ g protein the gelation time was 4 min and the reached storage modulus was 63.7 Pa. However, the addition of 0.21 g Gdl/g protein and 6 U/g protein MTG increase the gelation time to about 69 min, but, a higher module value G´ of 111.0 Pa was achieved. Addition of high Gdl concentration caused a rapid drop of pH below 5 leading to a fast enzyme inactivation. However addition of very low Gdl concentrations was also not optimal. The simultaneous influence of MTG and Gdl concentration on the gelation time and elastic properties was evaluated by a central composite rotatable design (CCRD). The resulting quadratic storage modulus model showed that, MTG concentration had a significant influence on storage modulus G´ and, that the firmness of the gels increase in direct proportion with MTG activity with the existence of a optimum Gdl concentration, whereas the resulting linear model of the gelation time stated that Gdl concentration has a significant influence on the gelation time, while it is independent of the MTG activity. A maximal firmness of 136 ± 2 Pa was reached between a range of 0.24 - 0.27 g Gdl/g protein and 5.8 U MTG/g within a time from 49 to 59 min. Gel permeation chromatography analysis demonstrated that acid gels induced by Gdl were formed by reversible cross-linking like electrostatic interactions and hydrogen bonds as well as disulfide bonds caused by temperature treatment. Whereas, the addition of MTG proved the formation of non-reversible cross-linking like oligomers based on Ne-(g-glutamyl)- lysine, which gave more firmness and stabilization on the casein gel network.

Kinetic inactivation of factor XIIIa and MTG were performed in a pressure range from 0.1 to 400 MPa at 40°C within a time from 0 to 60 min in a TRIS-acetate buffer at pH 6.0. The inactivation of both enzymes at these conditions followed a first order reaction model. The high inactivation rate constant of 26.6 x10-3/min-1 for factor XIIIa at low pressure (50 MP) indicated that this enzyme is much easier to inactivate than MTG, which achieved an inactivation rate constant value of 9.7 x10-3/min at higher pressure (200 MPa). An inactivation volume of –10.17±0.5 cm3/mol confirmed that MTG is very stable under high pressure. The stability of MTG under high pressure and thermal treatment was related to its conformational changes. Enzyme inactivation was accompanied by secondary and tertiary structure changes until an irreversible protein precipitation is achieved. The tertiary structure, represented by circular dichroism spectra in the aromatic region showed differences among native and MTG samples treated under high pressure, as well as at elevated temperature. Tyrosine bands, indicating protein unfolding, increased proportionally with increasing pressure treatment above 400 MPa. Nevertheless, compared to pressure, a maximal enhancement could be observed after thermal treatment at 0.1 MPa at 80°C. That demonstrated the exposure of hydrophobic groups to the protein surface with a concomitant protein unfolding. The spectra in the far ultraviolet region showed that increasing high pressure and high temperature lead to alterations in the secondary structure. The mathematical algorithms CONTIN used to calculate secondary structures stated that the 24.5% of alpha-helix of native MTG decreased to 17.2% after a treatment at 400 MPa at 40°C for 60 min and to 6.5% after a treatment at 0.1 MPa at 80°C for 2 min. However, beta-strand structures remained relatively stable after these several treatments. MTG is arranged in a way that the active site is located between beta-strand domains that are surrounded by alpha-helices, the results of this investigation suggested that MTG activity is related with the relative stability of alpha-helix and the outstanding stability of the central beta-strand structure. The irreversible precipitated protein observed at 600 MPa at 40°C for 60 min and 0.1 MPa at 80°C for 2 min was caused principally by the formation of disulfides bonds, because high pressure and high thermal treatment lead to the exposition of the Cys64 residue towards the solvent with the subsequent ability to react with neighbouring cysteine residues. Furthermore, the reaction between protein and reducing sugars resulted in the formation of Maillard products. Furosine, as an indicator of the early stages of Maillard reaction was measured. Concentration values of 261.0 mg/g protein from samples treated at 600 MPa and 40°C and 238.5 mg/g protein from samples treated at and 0.1 MPa and 80°C for 2 min were obtained. Pentosidine a subsequent product observed in the advanced Maillard reaction was also present. Concentrations of 13.7 and 6.7 mg/g protein were obtained in the samples treated at 600 MPa and 40°C for 60 min and 0.1 MPa and 80°C for 2 min, respectively. Kinetic inactivation studies of MTG in a pressure range from 0.1 to 600 MPa at 10, 30, 40, and 50°C within a long time range from 0 to 140 h were performed in order to study MTG stability under the simultaneous effect of pressure and temperature. The inactivation kinetic showed a first and very fast step and a second very slow step suggesting irreversible inactivation behaviour. Activation energy and entropy difference decreased with increasing pressure. Thereby, the inactivation rate constants of enzyme were less temperature dependent at high pressure. The effect of pressure and temperature on MTG inactivation had a synergistic behaviour. At temperatures of 10, 30, and 40°C, increasing pressure leads to increasing inactivation rate constants. However at 50°C a tendency change occurred. Negative activation volumes of –16.2±0.5, -13.6±0.1, -11.2±0.3 cm3/mol were obtained for 10, 30 and 40°C respectively and for treatment at 50°C a positive value of about +3.0±2.0 cm3/mol in a pressure range from 0.1 to 300 and a negative volume of –11.0±0.4 cm3/mol MPa from 300 to 600 MPa were calculated. A pressure/temperature diagram from inactivation rate constants was performed to represent MTG stability. The diagram shows that in a pressure and temperature range from 0.1 to 550 MPa and 10 to 40°C, pressure induces MTG stabilization against heat denaturation. At 50°C in range from 0.1 to 300 MPa, pressure induces also enzyme stabilization again heat denaturation, but at the same temperature and above 300 MPa the enzyme was inactivated. After MTG stability analysis, reaction kinetics from MTG with individual caseins in a TRIS-acetate buffer pH 6.0 were performed under atmospheric pressure (0.1 MPa) and high pressure (400 MPa) at 40°C. The reaction was monitored by gel permeation chromatography under in three assumptions: 1) The initial velocity kinetics was obtained from a non-progressive enzymatic reactions with the products. 2) The substrate concentration exceeded enzyme concentration. 3) The sum of the individual catalytic constants of the reactive glutamine residues inside caseins are represented by a single MTG-monomeric casein complex. Enzyme reaction kinetics of MTG with the individual caseins carried out at 0.1 MPa at 40°C showed Michaelis-Menten-Henri behaviour with maximal velocities of 2.7 x 10-3, 0.8 x 10-3, and 1.3 x 10-3 mmol/L∙min and Km values of 59 x 10-3, 64 x 10-3 and 50 x 10-3 mmol/L of beta-, alpha-s1-, and whole-casein, respectively. This suggested that MTG achieved a maximal velocity with ß-casein, but had the best affinity with acid casein followed by beta- casein and finally alpha-s1-casein. Enzyme reaction kinetics of beta-casein carried out at 400 MPa and 40°C also showed a Michaelis-Menten-Henri behaviour with a similar maximal velocity of 2.6 x 10-3 mmol/L×min, but the Km value of 144 x 10-3 mmol/L showing kinetical similarity to a non-competitive inhibition. The reaction of MTG with alpha-s1-casein under high pressure did not fit in to Henri-Michaelis-Menten kinetics. Kinetic parameters showed that the affinity of MTG to beta- and alpha-s1-casein under atmospheric pressure is higher than the affinity of MTG to these caseins under high pressure. This loss of affinity can be explained by a constant number of reactive glutamine residues of casein, although the protein is unfolding at high pressure, a decrease of enzyme activity of MTG to 74% after treatment at 400 MPa at 40°C for 15 min and self association of casein under thermal and high pressure treatment. Fur technological application, the formation of acid milk gels was studied under the influence of MTG within its range of pH stability. Simultaneous addition of MTG and different concentrations of glucono-delta-lactone (Gdl) to casein solutions (5% w/v) at 40°C was analysed. Gels firmness was accessed by oscillation rheometry and gel permeation chromatography. Oscillation rheometry data showed that the time of gelation decreased with an increasing Gdl concentration added to the system, however higher concentrations of Gdl caused the formation of weaker gels. Addition of 1 g Gdl/g protein without MTG caused gelation within 5 min and a storage module value G´ of 48.9 Pa. With the simultaneous addition of 1 g Gdl/g protein and 6 U MTG/ g protein the gelation time was 4 min and the reached storage modulus was 63.7 Pa. However, the addition of 0.21 g Gdl/g protein and 6 U/g protein MTG increase the gelation time to about 69 min, but, a higher module value G´ of 111.0 Pa was achieved. Addition of high Gdl concentration caused a rapid drop of pH below 5 leading to a fast enzyme inactivation. However addition of very low Gdl concentrations was also not optimal. The simultaneous influence of MTG and Gdl concentration on the gelation time and elastic properties was evaluated by a central composite rotatable design (CCRD). The resulting quadratic storage modulus model showed that, MTG concentration had a significant influence on storage modulus G´ and, that the firmness of the gels increase in direct proportion with MTG activity with the existence of a optimum Gdl concentration, whereas the resulting linear model of the gelation time stated that Gdl concentration has a significant influence on the gelation time, while it is independent of the MTG activity. A maximal firmness of 136 ± 2 Pa was reached between a range of 0.24 - 0.27 g Gdl/g protein and 5.8 U MTG/g within a time from 49 to 59 min. Gel permeation chromatography analysis demonstrated that acid gels induced by Gdl were formed by reversible cross-linking like electrostatic interactions and hydrogen bonds as well as disulfide bonds caused by temperature treatment. Whereas, the addition of MTG proved the formation of non-reversible cross-linking like oligomers based on Ne-(g-glutamyl)- lysine, which gave more firmness and stabilization on the casein gel network.