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Efeitos da proteína HMGB1 sobre fatores sensíveis a espécies reativas de oxigênio em macrófagos peritoneais de ratos : investigando um novo papelBonatto, Fernanda January 2006 (has links)
HMGB1é a proteína não-histona mais abundante no núcleo celular e foi inicialmente descrita como reguladora da transcrição gênica por ligar-se ao DNA promovendo alterações conformacionais na fita dupla e assim permitindo a ação de outros fatores nucleares. Em 1999, a HMGB1 foi detectada no soro de pacientes com sepse em estágios tardios, e sua concentração plasmática foi inversamente proporcional à sobrevivência. Desde então a busca para elucidar o papel sinalizador da proteína nuclear HMGB1, tem gerado resultados paradoxais. HMGB1 é secretada por macrófagos, células dendríticas, tumores, células endoteliais e também é liberada com o processo de necrose. Duas classes de receptores já foram descritos estarem relacionados com a sinalização da HMGB1: RAGE e TLRs. As vias de transdução do sinal interno ativado por HMGB1 envolvem quinases da família das MAPK que convergem para a translocação nuclear de NF-κB. Suas primeiras ações caracterizadas relacionam-se ao processo pró-inflamatório, mas recentes pesquisas mostram a participação da HMGB1 na promoção da recuperação celular. Supõe-se que o fator limitante no direcionamento do sinal da proteína nuclear sejam suas concentrações e a especificidade celular. Com o intuito de relacionar a sinalização de HMGB1 e sua possível ação sobre agentes redox-sensíveis, utilizamos culturas de macrófagos peritoneais de ratos submetidas a 2 doses de HMGB1 e analisamos os níveis de nitritos no meio de cultivo celular; dosamos a atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase e catalase; e avaliamos a translocação de fatores de transcrição para o núcleo. As duas concentrações de HMGB1 ativaram NF-κB, mas apenas a menor dose foi capaz de induzir um aumento na atividade enzimática da catalase. Ambas as doses não alteraram a atividade da superóxido dismutase e também não promoveram um acúmulo de nitritos. Nossos resultados comprovam que os efeitos da HMGB1 são dose-dependentes. Mais investigações ajudarão a elucidar se a HMGB1 em leves doses pode agir como um fator pré-condicionador. / HMGB1 is the non-histone protein most abundant in the cell nucleus. This protein was initially described as a DNA-binding agent that promotes transcription regulation by bending the double-helix, thus allowing the action of nuclear factors. In 1999, serum HMGB1 was detected in sepsis patients with time delay. HMGB1 concentrations and survival were inversely proportional. Then, the search for HMGB1 actions has generated inverse results. HMGB1 is secreted by macrophages, dendritic cells, endothelial cells and tumors cells; however, during the process of necrosis, HMGB1 is released to extracellular environment. Two receptor families were described: RAGE and TLRs. The HMGB1 transduction signals involve MAPK kinases that converge to NF-κB translocation. HMGB1 actions were related with pro-inflammatory process, but recent research showed HMGB1 beneficial effects. Protein concentrations could cause different tissue-specific responses. Our purpose was to analyze macrophages responses to low doses of HMGB1. Rat peritoneal macrophage cultures were treated with two HMGB1 concentrations. Supernatant nitrites, superoxide dismutase activity and catalase activity were determined. Plus, transcriptional factor translocation was evaluated. Both HMGB1 concentrations activated NF-κB, but only the low HMGB1 concentration induced an increase in the catalase enzymatic activity. Both HMGB1 concentrations did not alter the superoxide dismutase activity and also they did not change nitrite amount. Our results showed biological HMGB1 effect. More studies will help elucidate the HMGB1 role primed-like agent.
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Efeitos da proteína HMGB1 sobre fatores sensíveis a espécies reativas de oxigênio em macrófagos peritoneais de ratos : investigando um novo papelBonatto, Fernanda January 2006 (has links)
HMGB1é a proteína não-histona mais abundante no núcleo celular e foi inicialmente descrita como reguladora da transcrição gênica por ligar-se ao DNA promovendo alterações conformacionais na fita dupla e assim permitindo a ação de outros fatores nucleares. Em 1999, a HMGB1 foi detectada no soro de pacientes com sepse em estágios tardios, e sua concentração plasmática foi inversamente proporcional à sobrevivência. Desde então a busca para elucidar o papel sinalizador da proteína nuclear HMGB1, tem gerado resultados paradoxais. HMGB1 é secretada por macrófagos, células dendríticas, tumores, células endoteliais e também é liberada com o processo de necrose. Duas classes de receptores já foram descritos estarem relacionados com a sinalização da HMGB1: RAGE e TLRs. As vias de transdução do sinal interno ativado por HMGB1 envolvem quinases da família das MAPK que convergem para a translocação nuclear de NF-κB. Suas primeiras ações caracterizadas relacionam-se ao processo pró-inflamatório, mas recentes pesquisas mostram a participação da HMGB1 na promoção da recuperação celular. Supõe-se que o fator limitante no direcionamento do sinal da proteína nuclear sejam suas concentrações e a especificidade celular. Com o intuito de relacionar a sinalização de HMGB1 e sua possível ação sobre agentes redox-sensíveis, utilizamos culturas de macrófagos peritoneais de ratos submetidas a 2 doses de HMGB1 e analisamos os níveis de nitritos no meio de cultivo celular; dosamos a atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase e catalase; e avaliamos a translocação de fatores de transcrição para o núcleo. As duas concentrações de HMGB1 ativaram NF-κB, mas apenas a menor dose foi capaz de induzir um aumento na atividade enzimática da catalase. Ambas as doses não alteraram a atividade da superóxido dismutase e também não promoveram um acúmulo de nitritos. Nossos resultados comprovam que os efeitos da HMGB1 são dose-dependentes. Mais investigações ajudarão a elucidar se a HMGB1 em leves doses pode agir como um fator pré-condicionador. / HMGB1 is the non-histone protein most abundant in the cell nucleus. This protein was initially described as a DNA-binding agent that promotes transcription regulation by bending the double-helix, thus allowing the action of nuclear factors. In 1999, serum HMGB1 was detected in sepsis patients with time delay. HMGB1 concentrations and survival were inversely proportional. Then, the search for HMGB1 actions has generated inverse results. HMGB1 is secreted by macrophages, dendritic cells, endothelial cells and tumors cells; however, during the process of necrosis, HMGB1 is released to extracellular environment. Two receptor families were described: RAGE and TLRs. The HMGB1 transduction signals involve MAPK kinases that converge to NF-κB translocation. HMGB1 actions were related with pro-inflammatory process, but recent research showed HMGB1 beneficial effects. Protein concentrations could cause different tissue-specific responses. Our purpose was to analyze macrophages responses to low doses of HMGB1. Rat peritoneal macrophage cultures were treated with two HMGB1 concentrations. Supernatant nitrites, superoxide dismutase activity and catalase activity were determined. Plus, transcriptional factor translocation was evaluated. Both HMGB1 concentrations activated NF-κB, but only the low HMGB1 concentration induced an increase in the catalase enzymatic activity. Both HMGB1 concentrations did not alter the superoxide dismutase activity and also they did not change nitrite amount. Our results showed biological HMGB1 effect. More studies will help elucidate the HMGB1 role primed-like agent.
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Efeitos da proteína HMGB1 sobre fatores sensíveis a espécies reativas de oxigênio em macrófagos peritoneais de ratos : investigando um novo papelBonatto, Fernanda January 2006 (has links)
HMGB1é a proteína não-histona mais abundante no núcleo celular e foi inicialmente descrita como reguladora da transcrição gênica por ligar-se ao DNA promovendo alterações conformacionais na fita dupla e assim permitindo a ação de outros fatores nucleares. Em 1999, a HMGB1 foi detectada no soro de pacientes com sepse em estágios tardios, e sua concentração plasmática foi inversamente proporcional à sobrevivência. Desde então a busca para elucidar o papel sinalizador da proteína nuclear HMGB1, tem gerado resultados paradoxais. HMGB1 é secretada por macrófagos, células dendríticas, tumores, células endoteliais e também é liberada com o processo de necrose. Duas classes de receptores já foram descritos estarem relacionados com a sinalização da HMGB1: RAGE e TLRs. As vias de transdução do sinal interno ativado por HMGB1 envolvem quinases da família das MAPK que convergem para a translocação nuclear de NF-κB. Suas primeiras ações caracterizadas relacionam-se ao processo pró-inflamatório, mas recentes pesquisas mostram a participação da HMGB1 na promoção da recuperação celular. Supõe-se que o fator limitante no direcionamento do sinal da proteína nuclear sejam suas concentrações e a especificidade celular. Com o intuito de relacionar a sinalização de HMGB1 e sua possível ação sobre agentes redox-sensíveis, utilizamos culturas de macrófagos peritoneais de ratos submetidas a 2 doses de HMGB1 e analisamos os níveis de nitritos no meio de cultivo celular; dosamos a atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase e catalase; e avaliamos a translocação de fatores de transcrição para o núcleo. As duas concentrações de HMGB1 ativaram NF-κB, mas apenas a menor dose foi capaz de induzir um aumento na atividade enzimática da catalase. Ambas as doses não alteraram a atividade da superóxido dismutase e também não promoveram um acúmulo de nitritos. Nossos resultados comprovam que os efeitos da HMGB1 são dose-dependentes. Mais investigações ajudarão a elucidar se a HMGB1 em leves doses pode agir como um fator pré-condicionador. / HMGB1 is the non-histone protein most abundant in the cell nucleus. This protein was initially described as a DNA-binding agent that promotes transcription regulation by bending the double-helix, thus allowing the action of nuclear factors. In 1999, serum HMGB1 was detected in sepsis patients with time delay. HMGB1 concentrations and survival were inversely proportional. Then, the search for HMGB1 actions has generated inverse results. HMGB1 is secreted by macrophages, dendritic cells, endothelial cells and tumors cells; however, during the process of necrosis, HMGB1 is released to extracellular environment. Two receptor families were described: RAGE and TLRs. The HMGB1 transduction signals involve MAPK kinases that converge to NF-κB translocation. HMGB1 actions were related with pro-inflammatory process, but recent research showed HMGB1 beneficial effects. Protein concentrations could cause different tissue-specific responses. Our purpose was to analyze macrophages responses to low doses of HMGB1. Rat peritoneal macrophage cultures were treated with two HMGB1 concentrations. Supernatant nitrites, superoxide dismutase activity and catalase activity were determined. Plus, transcriptional factor translocation was evaluated. Both HMGB1 concentrations activated NF-κB, but only the low HMGB1 concentration induced an increase in the catalase enzymatic activity. Both HMGB1 concentrations did not alter the superoxide dismutase activity and also they did not change nitrite amount. Our results showed biological HMGB1 effect. More studies will help elucidate the HMGB1 role primed-like agent.
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Ação anti-inflamatória da insulina = efeitos agudos sobre a via IKK/I'capa'B/NF-'capa'B / Anti-inflammatory effect of insulin on the IKK/I'capa'B/NF-'capa'B pathwayMittestainer, Francine Cappa, 1986- 19 August 2018 (has links)
Orientador: Mário José Abdalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T22:12:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2011 / Resumo: A infusão da insulina durante a inflamação aguda melhora os resultados clínicos, mas o exato mecanismo desse efeito benéfico da insulina ainda não foi bem compreendido. Estudos recentes mostraram que a insulina tem um efeito antiinflamatório de modo que o hormônio também exibe um efeito inibidor sobre a mediação da transcrição de NF-kB em células mononucleares. Assim, o objetivo do presente estudo foi investigar os efeitos agudos da administração de insulina regular sobre a modulação de proteínas da via IKK/IkB/NF-kB e das proteínas chave da via de sinalização da insulina em tecido hepático, muscular e adiposo, a expressão de NF-kB nesses tecidos através de ELISA, o efeito do tratamento com insulina em macrófagos extraídos do peritônio de ratos e a influência dos inibidores da PI3K e MAPK na via inflamatória. Ademais, fizemos um ensaio da proteína fosfatase PP2A usando a imunoprecipitação com anticorpos anti-IKKbeta. Para o experimento, ratos machos adultos Wistar compuseram aleatoriamente 4 grupos diferentes. Três deles foram submetidos à infusão de insulina na veia porta e, então foram estimulados em 1, 3 e 5 minutos, enquanto o outro grupo (0) não foi estimulado com insulina. Em nossos resultados, observamos um aumento da fosforilação de IR, IRS1 e Akt induzida pela insulina nos três tecidos estudados. Em paralelo, houve uma redução na fosforilação de IKK e IkB após o estimulo da insulina. A ativação de NF-kB p65 no núcleo das células mostrou a redução na fosforilação do IKK e IkB no fígado, músculo e tecido adiposo. Na cultura de macrófagos tratada com insulina, após a adição dos inibidores específicos para PI3K e MAPK, observamos um aumento na fosforilação de IKK e IkB. Nossos resultados também mostraram que após estímulo da insulina houve um aumento na atividade da proteina fosfatase PP2A associada ao IKK nos três tecidos estudados. Desta forma, podemos sugerir que insulina pode induzir uma interação entre PP2A e IKK, o que resultará em mais desfosforilação de IKK e, assim, uma inibição da atividade da proteína quinase, revelando um potencial mecanismo de ação efeito anti-inflamatório da insulina / Abstract: Insulin infusion during acute inflammation improves clinical the outcomes but the exact mechanism of this beneficial effect is unclear. Recent studies have suggested that insulin has an anti-inflammatory effect in such a way that this hormone exhibits an inhibitory effect on the mediation of transcription of NF- kB in mononuclear cells. Thus, the aim of this study was to investigate the acute effects of regular insulin administration in modulation of IKK/IkB/NF-kB pathway and insulin signaling pathway (IR, IRS1 and Akt) and the DNA binding of NF-kB p65 in liver, muscle and adipose tissue of rats and also analyze the effect of treatment with insulin on macrophages of rats and the influence of PI3K and MAPK inhibitors on pathway. And finally, we analyze a phosphatase assay by using an immunoprecipitation with anti-IKKbeta antibody and PP2A phosphatase assay. For the experiment, male adult Wistar rats were divided in 4 groups. Three of them were submitted to insulin injection in the portal vein and were stimulated for 1, 3 and 5 minutes and the other group (0) was not stimulated (saline). In our results, we observed an increase in insulin-induced phosphorylation of IR, IRS1 and Akt during insulin injection in the three tissues studied. In parallel, there was a reduction in the phosphorylation of IKK and IkB after insulin stimulation. The DNA binding of NF-kB p65 in the cell nucleus showed a reduction of the IKK and IkB phosphorylation after insulin injection in liver, muscle and adipose tissue. In macrophages culture of treated with insulin and when added the specific inhibitor for PI3K and MAPK we observed an increased on phosphorylation of IKK and IkB. Our results also showed that after insulin stimulus there was an increase in PP2A phosphatase activity associated with IKK in the three tissues studied. Thus, we can suggest that insulin might induce an interaction between PP2A and IKK, which will result in more IKK dephosphorylation and thus an inhibition of this protein kinase activity, showed a possible anti-inflammatory effect of insulin / Mestrado / Mestre em Ciências
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Modulação imunológica in vitro de células de Langerhans e macrófagos por drogas utilizadas no manejo de reações hansênicasCAMPELO, Simone Rodrigues 03 April 2008 (has links)
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Previous issue date: 2008 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As células de Langerhans (CLs) estão localizadas na epiderme e desempenham um
papel chave na indução da resposta imune e da tolerância imunológica. Os macrófagos são células fagocíticas que atuam como primeira linha de defesa do organismo, e que estão envolvidos na formação de granulomas em pacientes com hanseníase. A imunopatogenia da resposta celular nos estados reacionais ainda é pouco estudada, porém, diversas evidências sugerem que as drogas prednisona, talidomida, ciclosporina e amitriptilina, utilizadas no controle das reações hansênicas, exercem seus efeitos pela modulação das funções de diferentes células imunocompetentes. O objetivo do presente estudo foi analisar a ação in vitro das drogas prednisona, talidomida, ciclosporina e amitriptilina sobre a produção de citocinas por CLs e macrófagos de camundongos BALB/c. As CLs foram isoladas, purificadas e cultivadas a partir da epiderme pela técnica de “panning” e os macrófagos foram isolados da cavidade peritoneal de camundongos BALB/c. Após 36 h de tratamento com as drogas, os níveis de TNF-, IL-12 e IL-10 foram medidos por ELISA. Prednisona, talidomida, ciclosporina e amitriptilina inibiram os níveis de TNF- produzidos pelas CLs, em ambas as concentrações, no entanto, não foi
detectada alteração significativa na produção de IL-12. A produção de TNF- e de IL-12 por macrófagos peritoneais também foi diminuída após o tratamento, porém os níveis de IL-10 não foram modificados por nenhuma das drogas testadas. Nossos resultados mostram que estas drogas podem modular a resposta imune através da regulação das citocinas pró-inflamatórias TNF- e IL-12 por CLs purificadas da epiderme e por macrófagos peritoneais, indicando que as citocinas constituem importante alvo de drogas usadas no tratamento dos estados reacionais. / Langerhans cells (LCs) are localized in the epidermis and performs a key role in the induction of immune response and immunologic tolerance. Macrophages are phagocytic cells that act as first line of defense of the organism, and they are involved in the granuloma formation in patients with leprosy. The immunopathogeny of the cellular response in the reactional states is yet little studied, however, several evidences suggest that the drugs prednisone, thalidomide, cyclosporine and amitriptyline, used in the control of leprosy reactions, perform their effects by the modulation of different immunocompetent cells functions. The objective of the present study was to analyze in vitro action of prednisone, thalidomide, cyclosporine and amitriptyline on the cytokine production by LCs and macrophages of BALB/c mice. LCs were isolated, purified and cultivated from the epidermis by the panning technique and macrophages were isolated by the peritoneal cavity of BALB/c mice.
After 36 h of treatment with the drugs, the levels of TNF-, IL-12 and IL-10 were
measured by ELISA. Prednisone, thalidomide, cyclosporine and amitriptyline
inhibited TNF- produced by LCs, in both concentrations, however no important
alterations in IL-12 production were detected. TNF- and IL-12 production by
macrophages was also decreased after treatment, but IL-10 levels were not modified
for none of the drugs tested. Our results show that these drugs can modulate the
immune response by the regulation of pro-inflammatory cytokines TNF- and IL-12
by purified epidermal LCs and peritoneal macrophages, indicating that they constitute
an important target for the drugs used in treatment of leprosy reactional states.
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Análise de diferentes cepas de Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) braziliensis quanto a infectividade/virulência e perfil de citocinas e quimiocinas produzidas por macrófagos murinos infectadosMachado, Michelle Menezes January 2014 (has links)
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Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As leishmanioses são um grupo de doenças causadas por diversas espécies de protozoários do gênero Leishmania, clinicamente classificadas como leishmaniose tegumentar e leishmaniose visceral. As leishmanioses representam um grave problema de saúde pública no Brasil, onde já foram registradas em todos os estados. Considerando que os mecanismos pelos quais as diferentes espécies de Leishmania causam diferentes patologias ainda são amplamente desconhecidos, pretendeu-se caracterizar diferenças no perfil de citocinas e quimiocinas produzido por macrófagos murinos infectados com L. (Leishmania) amazonensis e L. (Viannia) braziliensis, espécies causadoras de leishmaniose tegumentar americana no Brasil e investigar uma possível relação entre os resultados deste trabalho e as características imunopatológicas das infecções com as espécies em estudo. Macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c foram infectados com diferentes cepas de L. (L.) amazonensis e de L. (V.) braziliensis. A carga parasitária e a taxa de infecção de macrófagos foram determinadas através de microscopia ótica. As cepas de L. (L.) amazonensis apresentaram uma maior variabilidade intraespecífica do que as de L. (V.) braziliensis, porém sem diferença estatisticamente significante
A produção de NO foi avaliada por meio da reação de Griess. Todas as cepas de L. (L.) amazonensis induziram a produção de NO, enquanto que apenas na infecção por uma cepa de L. (V.) braziliensis observaram-se níveis detectáveis de NO. Entretanto, esta aparente diferença também não foi estatisticamente significante. A produção de ureia foi determinada através da ocorrência da reação de hidrólise de L-arginina pela enzima arginase. Observou-se que a produção de ureia nas culturas infectadas por L. (V.) braziliensis foi mais heterogênea do que nas infectadas por L. (L.) amazonensis. Observou-se também uma correlação inversa forte e significativa (Spearman r = -0,8051; p = 0,0218) entre os níveis de nitrito e de uréia caracterizando as duas vias de ativação macrofágica: clássica e alternativa, respectivamente. Citocinas e quimiocinas foram dosados nos sobrenadantes dos macrófagos infectados através da técnica de Luminex e a avaliação da expressão gênica destas citocinas e quimiocinas foi realizada por meio do PCR Multiplex em tempo real. Observaram-se importantes diferenças entre o perfil de citocinas e quimiocinas caracterizados através de Luminex e de PCR Multiplex em tempo real
Apesar disso, ambos os métodos mostraram níveis mais altos de citocinas e quimiocinas nas culturas infectadas com L. (V.) braziliensis em comparação às infectadas com L. (L.) amazonensis. Os resultados do Multiplex mostraram ausência de diferença estatística entre os macrófagos infectados por L. (L.) amazonensis e o controle de macrófagos não infectados. Por outro lado, nas culturas infectadas por L. (V.) braziliensis houve um aumento significativo (p < 0,05) da expressão gênica das citocinas IL-1\03B1, IL-6, G-CSF e da enzima NOS, além do aumento sugestivo (p<0,1) da expressão da citocina IL-10, da quimiocina CCL3 e dos receptores de quimiocinas CCR2 e CCR5. Concluiu-se, portanto, que a infecção por L. (V.) braziliensis modulou uma resposta predominantemente pró-inflamatória nos macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c, enquanto que não foi observada alteração na expressão de qualquer dos genes alvos do estudo na infecção com a espécie L. (L.) amazonensis em relação às culturas controle não infectadas / Leishmaniasis is a group of diseases caused by vari
ous species of protozoa of the
genus
Leishmania
, clinically classified as cutaneous leishmaniasis
and visceral
leishmaniasis. Leishmaniasis represents a serious p
ublic health problem in Brazil,
where the desease has been registered in all states
. Whereas the mechanisms by
which the different species of
Leishmania
cause different diseases are still largely
unknown, we sought to characterize differences in t
he profile of cytokines and
chemokines produced by murine macrophages infected
with
L. (Leishmania)
amazonensis
and
L. (Viannia) braziliensis
species, both of them causing American
cutaneous leishmaniasis in Brazil, and to investiga
te a possible relationship between
the results of this work and the immunopathological
characteristics of the infections
with these species. Peritoneal macrophages from BAL
B/c mice were infected with
different
L. (L.) amazonensis
and
L. (V.) braziliensis
strains. The parasite load and
the infection rate of macrophages were determined b
y optical microscopy. The
L. (L.)
amazonensis
strains apparently showed greater intraspecific va
riability than those of
L. (V.) braziliensis
, although no statistically significant difference
was found. NO
production was assessed by the Griess reaction. All
strains of
L. (L.) amazonensis
induced NO production while detectable NO levels we
re observed only in the
infection by one strain of
L. (V.) braziliensis
. However, this apparent difference was
not statistically significant. The urea production
was determined by the occurrence of
the hydrolysis reaction of L-arginine by the enzyme
arginase. It was observed that
urea production in cultures infected by
L. (V.) braziliensis
was more heterogeneous
than in those infected by
L. (L.) amazonensis
. We also observed a strong and
significant inverse correlation (Spearman r = -0.80
51, p = 0.0218) between the levels
of nitrite and urea featuring the two routes of mac
rophage activation: classical and
alternative, respectively. Cytokines and chemokines
were measured in the
supernatants of infected macrophages through the Lu
minex technique and the
assessment of gene expression of these cytokines an
d chemokines was performed
using real-time PCR Multiplex. Important difference
s were observed between the
profile of cytokines and chemokines revealed by Lum
inex and real-time PCR
Multiplex. Nevertheless, both methods showed higher
levels of cytokines and
chemokines in cultures infected with
L. (V.) braziliensis
as compared to those
infected with
L. (L.) amazonensis
. The Multiplex results showed no statistical
difference between macrophages infected with
L. (L.) amazonensis
and uninfected
macrophages control. On the other hand, in cultures
infected with
L. (V.) braziliensis xii
there was a significant increase (p<0.05) of gene e
xpression of IL-1
α
, IL-6, G-CSF
cytokines and NOS enzyme, and also a suggestive inc
rease (p < 0.1) of the
expression of the cytokine IL-10, the chemokine CCL
3 and CCR2 and the chemokine
receptors CCR5. Therefore, it was concluded that in
fection with
L. (V.) braziliensis
modulated a response predominantly proinflammatory
in peritoneal macrophages
from BALB/c mice, whereas no change was observed in
the expression of any target
gene in infections with
L. (L.) amazonensis
when compared to uninfected control
cultures
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Citotoxicidade, endocitose e processamento celular de nanopartículas biossintéticas de prata em macrófagos peritoneais / Cytotoxicity, endocytosis and cell processing of biogenic silver nanoparticles in peritoneal macrophagesFerreira, Luiz Alberto Bandeira, 1984- 27 August 2018 (has links)
Orientador: Marcelo Bispo De Jesus / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T02:58:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2015 / Resumo: A nanomedicina se tornou uma promessa de profundos impactos para a saúde humana através da utilização de nanopartículas, nanorobôs e outros nanomateriais para prevenir, diagnosticar ou curar doenças. Um dos exemplos de nanomateriais empregados na medicina são as nanopartículas de prata, que podem ser adquiridas por métodos químicos ou biossintéticos. As nanopartículas de prata apresentam alta atividade antimicrobiana, propriedade essa de grande interesse científico-industrial. Em vista disso, cresce também a preocupação em relação ao uso, manipulação e eliminação desse nanomaterial, visando uma aplicação mais segura. Diante dessas informações, o presente trabalho teve como objetivo investigar mecanismos moleculares envolvidos na citotoxicidade e processamento das nanopartículas biossintéticas de prata em macrófagos peritoneais obtidos de camundongos C57BL/6. Inicialmemte, demonstrando que as nanopartículas atingiram o IC50 de 25 µM em 6h de tratamento por redução do MTT. A análise de microscopia de fluorescência revelou alterações na integridade de membrana a partir de 3 h, que foram agravadas após 6 h de tratamento. Esse mesmo perfil foi observado por microscopia eletrônica de varredura, no qual revelou que após 3 h de tratamento as células já apresentavam perda de projeções celulares, e após 6 h início de fragmentação celular. Além disso, as nanopartículas causaram aumento dos níveis de espécies reativas de oxigênio e demonstramos que este é um fator determinante para os efeitos citotóxicos. Com a inibição da fagocitose e endocitose mediada por caveolina evidenciamos a reversão parcial da citotoxicidade das nanopartículas. Por outro lado, o aumento do efeito citotóxico das nanopartículas também foi observado com a inibição da autofagia, o que sugere que esses processos estejam envolvidos no processamento das nanopartículas. Por fim, concluímos que as nanopartículas biossintéticas de prata apresentaram um efeito citotóxico semelhante aqueles descritos em literatura pelas nanopartículas de síntese química / Abstract: Nanomedicine became a promise of profound impacts on human health through the use of nanoparticles, nanorobots and other nanomaterials to prevent, diagnose or cure diseases. One example of nanomaterials used in medicine is silver nanoparticles, which can be produced by chemical or biosynthetic methods. Silver nanoparticles have high antimicrobial activity; this property is of great scientific and industrial interest. Consequently, there is growing concern about the use, handling and disposal of nanomaterials, aiming more secure application. Hence, the present study aimed to investigate the molecular mechanisms involved in cytotoxicity and intracellular processing of biogenic silver nanoparticles in peritoneal macrophages from C57BL/6 mice. We began showing that the nanoparticles have reached the IC50 of 25 µM after 6 hours of treatment determined by MTT reduction. Fluorescence microscopy analysis showed changes in membrane integrity after 3 h, which has been intensified after 6 h of treatment. A similar profile was observed by scanning electron microscopy, which showed loss of cellular projections after 3 h of treatment and after 6 h was observed cellular fragmentation. In addition, the nanoparticles treatment increased levels of reactive oxygen species and this response seems to be determining for the cytotoxic effects. The inhibition of phagocytosis and caveolin-mediated endocytosis led to a reduction in cytotoxicity of nanoparticles. On the other hand, an increase in the cytotoxic effect was observed upon inhibition of autophagy, suggesting that this response is part of the intracellular processing of the nanoparticles in peritoneal macrophage. Finally, we concluded that the biogenic of silver nanoparticles exhibited cytotoxic effects similar to that described for silver nanoparticles chemically synthesized / Mestrado / Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde / Mestre em Ciências
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Estudo in vitro da infectividade de espécies de Leishmania do subgênero Viannia em macrófagos peritoneais de camundongo BALB/cCAMPOS, Marliane Batista January 2003 (has links)
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Previous issue date: 2003 / Os parasitos do gênero Leishmania apresentam variações de infectividade intra e inter específicas. Entretanto, são escassas as informações a respeito da infectividade das espécies de Leishmania do Novo Mundo, principalmente, daquelas encontradas na região Amazônica brasileira, onde, até o presente momento são conhecidas seis espécies pertencentes ao subgênero Viannia causadoras de LTA. Diante disso, o objetivo do presente trabalho foi investigar, in vitro, o comportamento da infectividade de 5 espécies de Leishmania do subgênero Viannia em macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c e sua correlação com a produção de óxido nítrico pelos macrófagos infectados. Trinta cepas de Leishmania foram distribuídas em seis grupos iguais, de acordo com as espécies seguintes: I- L. (V) braziliensis/LCL, II- L. (V) braziliensis/LCM, III- L. (V) guyanensis, IV- L. (V) shawi, V -L. (V) naiffi e VI- L. (V) lainsoni. As cepas foram cultivadas em meio RPMI suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de penicilina-gentamicina, até atingir a fase estacionária de cultivo, quando foram usadas para infectar macrófagos na proporção de 4 parasitos/macrófago. As culturas foram incubadas a 35°C e 5% de CO2 e após 24h, as lamínulas foram coradas com Giemsa para contagem do número de parasitos e determinação do índice de infecção, enquanto a concentração de NO (nitrito) foi calculada pelo método de Griess. Observou-se que as cepas de L. (V) braziliensis/LCM apresentaram o maior índice de infecção (385), sendo este significativamente maior (P<0,005) que as cepas de L. (V) braziliensis/LCL (264), L. (V) naiffi (215) e L. (V) lainsoni (272), porém, não significativamente maior que os índices das espécies L. (V) shawi (292) e L. (V) guyanensis (300). Quanto aos níveis de NO (nitrito), detectou-se maior concentração para a espécie L. (V) naiffi (4,1µM e menor concentração para as cepas de L. (V) braziliensis/LCM (2,15µM). As demais espécies tiveram concentrações de: L. (v:) lainsom (3,14µM), L. (V) shawi (2,96µM), L. (V) guyanensis (2,76µM) e cepas de L. (V) braziliensis/LCL (3,1µM). Diante do exposto, concluímos que cepas de L. (V) braziliensis/LCM são mais infectivas do que as demais espécies estudadas e, também, mais infectivas que cepas homólogas isoladas de casos clínicos de LCL. Além disso, observou-se menor infectividade da espécie L. (V) naiffi. Desse modo, notou-se que os níveis de NO produzidos pelos macrófagos infectados foram inversamente proporcionais ao grau do parasitismo. / Parasites ofthe genus Leishmania show both intra- and inter-specific variations of infectivity. There is little available information, however, regarding the infective behavior of New World species particularly those of the Amazon Region of Brazil, where there occur at six species of the subgenus Viannia causing human cutaneous leishmaniasis (ACL). The aim of the present study was to investigate the infectivity of 5 of these species for the peritoneal macrophages of BALB/c mice, and their role in the host-cell's production of nitric oxide (NO). Thirty strains of Leishmania were divided into 6 groups of the fol1owing species: I-L. (V.) braziliensis (from cases of localized skin lesions-LCL); II- L. (V.) braziliensis (from cases of mucocutaneous lesions- LeM); III- L. (V.) guyanensis; IV- L. (V.) shawi; V- L. (V.) naiffi and VI- L. (V.) lainsoni. They were cultivated in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/gentamicin, until reaching the stationary phase of development. These promastigotes were used to infect the macrophage cell cultures, in the proportion of 4 flagellates/macrophage. The cultures were then incubated at 35°C with 5% CO2 and, after 24 hours following inoculation, the corvelips were stained by Giemsa's method to determine the infection index. The nitric oxide (nitrite) concentration was measured in the culture supernatant by Griess' s method to determine the infection index. The nitric oxide (nitrite) concentration was measured in the culture supernatant by Griess' s method. It was found that LCM strains of L. (V.) braziliensis showed the highest infection index (385), significance p<0.05,compared with L. (V.) braziliensis LCL strains (264). L. (V). naiffi and L. (V.) lansoni had the lowest infection indices of (215) and (272), respectively, but, were not significally different from index of L. (V.) guyanensis (300). Rrgarding the NO levels, the highest was that for L. (V.) naiffi (4,1µM), and the lowest for L. (V.) braziliensis-LCM strains (2, 15µM). The other readings were (3,14µM) for L. (V.) lainsoni, 2,96µM for L. (V.) shawi, 2,76µM for L. (V.) guyanensis and 3,1µM for L. (V.) braziliensis-LCL strains. It is conc1uded that L. (V.) natffi. In this way it may be noted the NO levels for infected macrophage were inversely proportional to the degree of infectivity of the species studied.
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Estudo das interações da miltefosina com membranas de L. (Leishmania) amazonensis e macrófagos peritoneais / Study of interactions of Miltefosine with membranes of L. (Leishmania) amazonensis and peritoneal macrophagesFernandes, Kelly de Souza 15 February 2016 (has links)
Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-06-09T21:26:35Z
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Previous issue date: 2016-02-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Miltefosine (MT) is a alkylphospholipid originally developed for treatment
of breast cancer and other solid tumors. It is currently used in the treatment of
leishmaniasis, an infectious parasitic disease caused by protozoa of the genus
Leishmania, being the first oral drug adopted for this purpose. However, its
mechanism of action remains unclear. Electron paramagnetic resonance (EPR)
spectroscopy of a spin-labeled lipid (5-DOXIL stearate) and a thiol-specific spin
label (4-maleimido-TEMPO) in the membrane of axenic amastigotes of
L.(Leishmania) amazonensis and peritoneal macrophages from Balb/c mice
showed that MT causes significant increase in membrane dynamics at similar
concentrations that inhibit parasite growth or are cytotoxic to macrophage.
Although these alterations can be detected using a spin-labeled lipid, our
experimental results indicated that MT interacts predominantly with the protein
component of the membrane. Using a method for the rapid incorporation of MT
into the membrane, these effects were measured immediately after treatment.
Cytotoxicity, estimated via microscopic counting of living and dead cells,
indicated ~80% parasites and macrophages death at the concentration of MT at
which EPR spectroscopy detected a significant change in membrane dynamics.
Cell viability, analyzed using the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium bromide tetrazolium) reduction assay, showed that 50%
inhibitory concentration (IC50) of MT depends on the cell concentration used in
the assay. This dependence was analyzed using a theoretical equation
involving biophysical parameters such as the partition coefficient of watermembrane
and MT concentrations on the membrane and in the aqueous
medium. The data showed that cells more sensitive to MT are respectively:
erythrocytes, Leishmania promastigotes and Leishmania amastigotes and
macrophage. The IC50 value of MT for 4 x 107 parasites/mL was 24,35 M. For
the same cell concentration, a significant alteration was detected in the
membrane lipid fluidity of parasites to 15 M of MT. The EPR spectra of spinlabeled
membrane-bound proteins were consistent with more expanded and
solvent exposed protein conformations, suggesting a detergent-like action, with
a possible formation of micelle-like structures around polypeptide chains. / A Miltefosina (MT) é um alquilfosfolipídio originalmente desenvolvido
para o tratamento de câncer de mama e outros tumores sólidos. Atualmente é
utilizada no tratamento da leishmaniose, uma doença infecto-parasitária
causada pelo protozoário do gênero Leishmania, sendo o primeiro fármaco de
uso oral aprovado para tal fim. No entanto, seu mecanismo de ação ainda é
pouco conhecido. A espectroscopia de Ressonância Paramagnética Eletrônica
(RPE) de um marcador de spin lipídico (5-DOXIL estearato) e outro específico
de grupo tiol (4-maleimido-TEMPO) na membrana de amastigotas axênicas de
L. (Leishmania) amazonensis e de macrófagos extraídos de peritônio de
camundongos BALB/c, mostrou que a MT causa um aumento significativo na
dinâmica destas membranas para concentrações similares àquelas que inibem
o crescimento do parasito ou que são citotóxicas ao macrófago. Embora essas
alterações possam ser detectadas usando um marcador de spin lipídico,
nossos resultados experimentais indicaram que a MT interage
predominantemente com a componente proteica da membrana. Utilizando um
método para incorporação rápida da MT na membrana, esses efeitos foram
medidos imediatamente após o tratamento. Ensaios de citotoxicidade, estimada
via contagem microscópica de células vivas e mortas, indicaram que ~80% dos
parasitos e dos macrófagos estão mortos na concentração de MT no qual a
espectroscopia de RPE detectou uma mudança significativa na dinâmica da
membrana. A viabilidade celular, quantificada pela redução do sal MTT ((3-4,5-
Dimetiltiazol-2yl)-2,5 difenil brometo de tetrazolina), mostrou que a
concentração de MT que inibe 50% da proliferação celular (IC50) depende da
concentração celular usada no ensaio. Esta dependência foi analisada
utilizando uma equação teórica envolvendo parâmetros biofísicos tais como o
coeficiente de partição membrana-água e concentrações de MT na membrana
e no meio aquoso. Os dados mostraram que as células mais sensíveis à MT
são respectivamente: eritrócitos, formas promastigotas e amastigotas da
Leishmania e macrófagos. O valor do IC50 da MT para 4 x 107 parasitos/mL foi
de 24,35 M. Para esta mesma concentração de células, foi detectada uma
alteração significativa na fluidez lipídica da membrana dos parasitos com 15 M de MT. Os espectros de RPE do marcador de spin ligados a proteínas da
membrana foram consistentes com as conformações mais expandidas e
dinâmicas das proteínas expostas no solvente, sugerindo uma ação
semelhante à de detergente, com uma possível formação de estruturas tipo
micelas em volta das cadeias polipeptídicas.
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