Mycobacterium tuberculosis est la bactérie responsable de la tuberculose (TB), une infection pulmonaire grave. La TB est un problème majeur de santé publique mondial ; un tiers de la population mondiale est porteur de M. tuberculosis et l'émergence de formes de TB résistantes aux antibiotiques confirme la nécessité de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Pour atteindre cet objectif, il est crucial de mieux comprendre les mécanismes infectieux de M. tuberculosis. L'équipe de C. Guilhot s'intéresse aux lipides de l'enveloppe bactérienne impliqués dans la virulence de M. tuberculosis, en particulier lors de l'interaction du bacille avec les macrophages de l'hôte. Un type de lipide en particulier s'est démarqué pour son rôle crucial dans cette interaction : les Dimycocérosates de Phthiocérol (DIM). Malgré leur importance, le mécanisme d'action moléculaire des DIM n'est toujours pas connu. Les objectifs de ma thèse ont été 1) d'étudier le rôle des DIM dans le trafic intracellulaire de M. tuberculosis au sein du macrophage, et 2) de comprendre les mécanismes d'action des DIM dans la virulence. Par une combinaison de méthodes biologiques et biophysiques, nous avons montré que les DIM contribuent à l'induction de la rupture du phagosome et de l'apoptose du macrophage infecté par M. tuberculosis, en collaboration avec un autre facteur majeur de virulence bactérien, ESAT-6. Au niveau moléculaire, nous avons confirmé que les DIM sont transférés dans la membrane du macrophage au contact avec la bactérie, et y induisent une rigidification membranaire locale. Nous avons aussi montré que les DIM dans une membrane sont capables de potentialiser l'activité membranolytique d'ESAT-6 et d'autre(s) facteur(s) encore non identifiés. Les DIM ont un rôle pléiotropique dans l'interaction de M. tuberculosis avec le macrophage. Leur mécanisme d'action impliquerait des modifications des propriétés biophysiques membranaires, modifiant l'activité des effecteurs membranaires bactériens et potentiellement de l'hôte. Ces travaux ouvrent la voie à l'étude du mécanisme d'action d'autres lipides de virulence dont certains pourraient également s'insérer dans la membrane du macrophage. / Mycobacterium tuberculosis is the bacterium responsible for tuberculosis (TB), a severe respiratory disease. TB is a major public health threat; one third of the world's population is latently infected by M. tuberculosis, and the emergence of antibiotic-resistant forms of TB confirms that there is a need to develop new therapeutic approaches to control the spread of TB. However, in order to attain that goal, it is crucial to decipher the infectious mechanisms of M. tuberculosis. Research in the team of C. Guilhot focuses on lipids from the envelope of M. tuberculosis which are involved in virulence, in particular those implicated in the interaction of the bacteria with host macrophages. One of these lipids stands out for its crucial role in this interaction: Phthiocerol Dimycocerosate (DIM). Despite its importance, the molecular mechanism of action of DIM is still unknown. The objectives of my PhD were 1) to study the role of DIM in the intracellular trafficking of M. tuberculosis in macrophages, and 2) to decipher the molecular mechanism of action of DIM. By a combination of biological and biophysical techniques, we showed that DIM contributes to phagosomal rupture and induction of apoptosis in macrophages infected with M. tuberculosis, in collaboration with another major virulence factor: ESAT-6. At the molecular level, we confirmed that DIM is transferred to the membrane of the macrophage on contact with M. tuberculosis and induces a local membrane rigidification around the point of contact with the bacterium. We observed that DIM incorporated in membranes is able to promote the membranolytic activity of ESAT-6, and other yet unidentified bacterial factor(s). DIM has a pleiotropic role in the interaction between M. tuberculosis and macrophages, presumably through alterations of the membrane's biophysical properties that influence the activity of membrane effectors from both the bacteria and the host. Thus, this work paves the way for the study of the mechanisms of action of other virulence lipids, some of which could also be inserted in the macrophage membrane.

Le muscle strié squelettique régénère ad integrum après une lésion aigüe stérile grâce aux cellules satellites qui sont les cellules souches du muscle strié squelettique. L'inflammation, et notamment les macrophages, joue un rôle important durant ce processus. En effet, après une lésion, les monocytes sanguins infiltrent le tissu et deviennent des macrophages avec un phénotype pro-inflammatoire associé à la lésion. Ces macrophages phagocytent les débris cellulaires et promeuvent la prolifération des cellules souches musculaires. Ensuite, les macrophages changent leur phénotype vers un phénotype anti-inflammatoire associé à la restauration du tissu. Ils promeuvent la différenciation, puis la fusion des cellules souches musculaires et la croissance des myofibres. Cette séquence de phénotypes inflammatoires est essentielle pour une régénération musculaire efficace. Le laboratoire a montré que ce changement de phénotype est dépendant d'un senseur énergétique majeur de la cellule qui contrôle le métabolisme cellulaire, l'AMP kinase (AMPK)al. Par ailleurs, les glucocorticoïdes sont utilisés depuis des décennies pour leurs effets anti-inflammatoires sur l'inflammation. Leur action est médiée par le Récepteur aux Glucocorticoïdes qui induit ou réprime l'expression de gènes par interaction directe ou indirecte à l'ADN. Comme l'AMPKal et les glucocorticoïdes induisent des effets anti-inflammatoires similaires sur les macrophages, nous avons posé l'hypothèse que ces 2 voies de signalisation pourraient être interconnectées dans les macrophages afin de permettre leur changement de phénotype et la régénération musculaire. Les données issues d'un modèle in vitro de lésion musculaire utilisant des macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris ont montré que : i) les glucocorticoïdes induisaient la phosphorylation de l'AMPKal ; ii) l'AMPKal était requise pour l'acquisition fonctionnelle du statut anti-inflammatoire des macrophages induit par les glucocorticoïdes puisque des macrophages déficients pour l'AMPKal ne modifiaient pas leur phénotype et ne stimulaient pas la myogenèse. Les expériences in vivo utilisant des souris LysMCre/+;AMPKalfl/fl dans lesquelles l'AMPKal est invalidée uniquement dans les cellules myéloïdes ont montré que l'AMPKal dans les macrophages régulait les effets bénéfiques des glucocorticoïdes au cours de la régénération du muscle strié squelettique. En effet, en absence d'AMPKal dans les macrophages, les glucocorticoïdes induisaient un retard de régénération et une modification de la maturation des fibres attestée par une modification de l'expression des isoformes des chaînes lourdes de myosines. En conclusion, ces données montrent que l'AMPKal est requise pour le changement de phénotype des macrophages induit par les glucocorticoïdes et une régénération musculaire efficace / Skeletal muscle regenerates ad integrum after a sterile acute injury thanks to satellite cells (muscle stem cells). Inflammation, and notably macrophages, plays important roles during this process. Just after injury, monocytes infiltrate the tissue from the blood and convert into pro-inflammatory damaged associated macrophages. These macrophages phagocyte muscle debris and promote the proliferation of muscle stem cells. Then, macrophages switch their phenotype toward an anti-inflammatory restorative profile and promote muscle stem differentiation, fusion and myofiber growth. This sequence of macrophage profile is essential for an efficient skeletal muscle regeneration. The lab has shown that this phenotype switch is dependent of AMP kinase (AMPK)a1, a major energetic sensor in the cell controlling cellular metabolism. Besides, glucocorticoids have been used for decades for their anti-inflammatory effects on inflammation. Their actions are mediated by the Glucocorticoid Receptor which induces or represses gene expression by direct or indirect DNA-binding. As AMPKa1 and glucocorticoids induce similar anti-inflammatory effects on macrophages, we hypothesized that these 2 pathways could be interconnected in macrophages to allow the resolution of inflammation and muscle repair. Data from an in vitro model of skeletal muscle injury using bone marrow derived macrophages showed that: i) glucocorticoids induce AMPK phosphorylation; ii) AMPKa1 is required for the functional acquisition of the anti-inflammatory phenotype induced by glucocorticoids. Indeed, AMPKa1-deficient macrophages did not switch their phenotype and did not sustain myogenesis. In vivo experiments using LysMCre/+;AMPKa1fl/fl mice in which AMPKa1 is depleted only in myeloid cells, showed that macrophagic AMPK drove the beneficial effects of glucocorticoids during skeletal muscle regeneration. Inversely, in absence of AMPK in macrophages, glucocorticoids induced a delayed muscle regeneration and a modification in myofiber maturation, assessed by the alteration of myosin heavy chain expression. Altogether, these data show that glucocorticoids need AMPKa1 in macrophages for the resolution of inflammation and an efficient skeletal muscle regeneration

La septicémie et les troubles associés demeurent une cause majeure de mortalité dans les unités de soins intensifs. Des récents travaux ont mis en lumière un lien inattendu entre les mitochondries et les fonctions des cellules immunitaires. Des modifications des fonctions mitochondriales ont pu être observées dans les cellules sanguines périphériques lors de septicémies. Dans le cadre de ce travail de thèse, nous avons cherché à évaluer si la mitophagie pouvait avoir un impact sur les fonctions des phagocytes dans le contexte d’une infection bactérienne. La mitophagie est une autophagie dédiée aux mitochondries qui régit l'élimination des mitochondries dysfonctionnelles. Nous avons démontré ici in vivo et in vitro que les macrophages exposés aux bactéries à Gram négatif ou à leurs composants de la paroi cellulaire (Lipopolysaccharides, LPS) présentent une inhibition marquée de la mitophagie qui constitue un mécanisme de protection contre la septicémie. L'activation des macrophages avec une combinaison LPS/IFNγ entraîne une inhibition précoce de la mitophagie dépendante de PINK1 selon une voie dépendante de STAT1-Caspase 11. Cette inhibition de la mitophagie contribue à expliquer la reprogrammation métabolique observée dans les macrophages classiquement activés (macrophages M1) et conduit à une augmentation de la production de ROS mitochondriaux (mROS). En tant que molécules de signalisation, les mROS conduisent à l'activation des macrophages de manière dépendante de HIF-1α et NF-κB. En outre, ces molécules contribuent à la clairance bactérienne dans les phagocytes activés. Il est intéressant de noter que nous avons démontré in vitro et in vivo que la modulation pharmacologique de la mitophagie permet d'imiter ou de réprimer les effets du LPS sur la polarisation des macrophages, la libération des cytokines et l'activité bactéricide. Pour conclure, ce travail démontre que l'inhibition de la mitophagie est une caractéristique de l'activation LPS-dépendante des macrophages et un mécanisme de protection contre les bactéries à Gram négatif. Cette étude souligne également une relation inconnue entre la signalisation IFNγ, les caspases inflammatoires et la mitophagie. Enfin, nos travaux mettent en lumière l'impact des modulateurs pharmacologiques de la mitophagie sur la fonction des macrophages et ouvrent de nouvelles opportunités pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour stimuler la défense de l'hôte. / Sepsis and related organ dysfunctions remain a leading cause of mortality in intensive care units. Increasing evidences have shed light on an unexpected link between mitochondria and immune cell functions. Alterations in mitochondrial functions have been reported in peripheral blood cells in sepsis. We hypothesize here that mitophagy might impact on phagocyte functions in the context of bacterial infection. Mitophagy is a mitochondria-dedicated autophagy that governs the elimination of dysfunctional mitochondria. We demonstrated here in vivo and in vitro that macrophages exposed to Gram-negative bacteria or their cell wall component LPS display a marked inhibition of mitophagy that constitutes a protective mechanism against sepsis. LPS/IFNγ-driven macrophage activation results in early inhibition of PINK1-dependent mitophagy through a STAT1-Caspase 4/11 pathway. This inhibition of mitophagy contributes to explain the metabolic reprogramming observed in classically activated macrophages and leads to a rise in mitochondrial ROS (mROS) production. As signaling molecules, mROS lead to macrophages activation in a HIF-1α- and NF-κB-dependent manner. Furthermore, these molecules contribute to bacterial clearance in activated phagocytes. Interestingly, we demonstrated in vitro and in vivo that pharmacological modulation of mitophagy allows either mimicking or repressing the effects of LPS on macrophages polarization, cytokine release and bactericidal activity. To conclude, this work demonstrates that inhibition of mitophagy is a feature of LPS-dependent macrophage activation and a protective mechanism against Gram-negative bacteria. This study also highlights an unknown relationship between IFNγ-signaling, inflammatory caspases and mitophagy. Finally, our work point out the impact of pharmacological modulators of mitophagy on macrophage function and open new opportunities for the development of novel strategies to boost host defense

Le rejet aigu humoral (RAH) est une complication post-transplantation qui peut conduire à la dysfonction puis la perte du greffon. Le RAH est caractérisé, au niveau histologique, par la présence de lésions endothéliales et d’un infiltrat de macrophages intravasculaires. Cette étude avait pour objectif d’identifier les mécanismes et voies de signalisation impliqués dans l’altération des cellules endothéliales (CE) au cours du RAH et de nouvelles molécules régulatrices. Nous montrons que l’induction du ligand de la voie Notch Dll4 dans les CE et les macrophages est caractéristique du RAH dans les greffons cardiaques. L’expression endothéliale de Dll4et la sécrétion de l’IL-6 par les CE induit la polarisation des macrophages vers un profil pro-inflammatoire de type M1. Nous identifions aussi Dll4 comme un régulateur négatif et pro-apoptotique de la différentiation vers un phénotype suppressif de typeM2. Nous montrons que les cellules microvasculaires sont les cibles cellulaires privilégiées des anticorps non HLA préformés associés à certains RAH en transplantation rénale. Enfin, nous avons mis en évidence l’activité d’une famille de coumarines issues de végétaux sur l’expression endothéliale de molécules de l’inflammation et de l’immunité. Pour conclure,notre étude montre l’importance de la voie Notch dansl’inflammation liée au RAH et identifie DLL4 et IL-6comme de nouveaux médiateurs de l’inflammation et d’une interaction spatiale et fonctionnelle des CE et des macrophages. Ces travaux proposent donc DLL4 etl’IL-6 comme des cibles moléculaires et les coumarines comme nouvelles molécules bioactives pour le contrôle de l’inflammation et du RAH en transplantation. / Acute humoral rejection (RAH) is a post-transplantcomplication that can lead to dysfunction and graftloss. RAH is characterized histologically by thepresence of endothelial lesions and of an infiltrate ofintravascular macrophages. This study aimed toidentify the mechanisms, the signaling pathwaysinvolved in the alteration of endothelial cells (EC) upon RAH as well as new regulatory molecules fortherapeutic approaches. Here, we show that theinduction of the Notch ligand DLL4 in both the EC andmacrophages is a feature of RAH in cardiac allografts.The expression of Dll4 and secretion of IL-6 inducedpolarization of macrophages into proinflammatory M1-type. We further identify Dll4 as a negative and pro-apoptoticregulator of macrophage differentiation towards a suppressive phenotype M2-type. We foundthat glomerular microvascular cells are the cell targetsof preformed non HLA antibodies causing RAH inkidney transplantation. Finally, we have demonstratedthe inhibitory activity of a series of coumarins issued from plants on the endothelial expression of a panel of inflammation and immunity molecules. In conclusion,our study shows the importance of the Notch pathwayin inflammation-related RAH and identifies DLL4 and IL-6 as new mediators of inflammation and spatial andfunctional interaction of the EC and macrophages. Thiswork therefore propose DLL4 and IL-6 as moleculartargets and coumarins as new bioactive molecules forthe control of inflammation and RAH.

La LMMC est une hémopathie est caractérisée par une monocytose persistante (>1.10^9/L) ainsi que par la présence anormale de granulocytes immatures dans le sang des patients. Actuellement, il n’existe aucun traitement ciblé, il est donc essentiel de mieux caractériser et de comprendre les mécanismes qui causent cette monocytose afin d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques et de proposer des traitements ciblés. A partir de monocytes primaires humain stimulés par du CSF-1, nous avons observé que l’autophagie, est induite et qu’elle est dépendante des protéines Beclin1, ATG5, ATG7 et ULK1. Cette autophagie est également nécessaire à la différenciation macrophagique. Nous avons déterminé que l’AMP kinase (AMPK), est nécessaire à l’induction de l’autophagie et par conséquent à la différenciation macrophagique. Nous avons également découvert que le récepteur purinergique P2RY6 via la stimulation du CSF-1R active l’axe PLCβ3-CaMKKβ-AMPK-ULK1 conduisant à l’induction de l’autophagie nécessaire à la différenciation macrophagique. Enfin, dans le cadre de la LMMC, où la différenciation macrophagique est altérée, nous avons confirmé que la présence de granulocytes immatures est responsable de l’inhibition de l’axe P2RY6-AMPK. Dans ce contexte, nous avons observé que l’ajout d’agonistes du P2RY6 est capable d’une part de réinduire l’expression de l’AMPK et d’autre part de restaurer la différenciation macrophagique. L’ensemble de ces résultats souligne l’importance de l’induction du processus autophagique au cours de la différenciation macrophagique des monocytes mais également désigne l’axe P2RY6-AMPK comme cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la LMMC. / CMML is a hematologic malignancy characterized by a persistent monocytosis (> 1.10^9/ L) and an abnormal presence of immature granulocytes in the blood of patients. Currently, there is no targeted therapy for this disease, so there is a real need to better understand the mechanisms leading to monocytosis in order to establish new therapeutic strategies and propose targeted treatments for CMML patients. From primary human monocytes, stimulated by CSF-1 to induce their differentiation into macrophages, we found that autophagy is induced during this process and is required for proper macrophagic differentiation. Then we were able to show that AMPK kinase (AMPK) is required for the induction of autophagy and therefore macrophage differentiation. We also found that the P2RY6 purinergic receptor via the CSF-1R stimulation, activate the PLCβ3-CaMKKβ-AMPK-ULK1 axis leading to the induction of autophagy, which is necessary for the macrophagic differentiation. Finally, in CMML context, where the macrophagic differentiation is impaired, we confirmed that the presence of immature granulocytes is responsible for the inhibition of AMPK P2RY6-axis. In this context, we observed that the addition of agonists P2RY6 is first capable of re-inducing the expression of AMPK and then restoring the macrophagic differentiation. All of these results emphasize the importance of autophagy induction during macrophage differentiation of monocytes and highlight the P2RY6 AMPK-axis as a potential therapeutic target in the treatment of CMML.

Thesis (Ph. D.)--West Virginia University, 2002. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains x, 98 p. : ill. (some col.). Vita. Includes abstract. Includes bibliographical references (p. 76-88).

Thesis (Ph. D.)--West Virginia University, 2004. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains x, 130 p. : ill. (some col.). Includes abstract. Includes bibliographical references (p. 120-130).

Thesis (Ph. D.)--West Virginia University, 2001. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains xii, 73 p. : ill. (some col.). Vita. Includes abstract. Includes bibliographical references (p. 64-70).

Diss. (sammanfattning) Linköping : Univ., 2003. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2006. / Härtill 4 uppsatser.