Les GTPases Ral, RalA et RalB, sont des effecteurs proximaux de l’oncogène Ras.Malgré leur forte homologie, leurs activateurs communs (les RalGEFs) et des effecteurs communs (le complexe exocyste), ils apportent des contributions distinctes et parfois collaborent à diverses fonctions cellulaires.RalA est impliqué en prolifération en absence de substrat et l'exocytose polarisée.RalB est impliqué dans la migration cellulaire, l'autophagie et l'apoptose des cellules cancéreuses. Comment les GTPases Ral régulent ces différents fonctions n’est toujours pas connu.Une partie de ma thèse était consacrée à l'étude de la spécificité des fonctions de RalA et RalB, ainsi que la spécificité des RalGEFs et des éléments de l'interactome deRal, dans trois processus biologiques: la cytocinèse, la migration cellulaire et l'activation de la voie MAPK.Nous avons démontré que RalA et RalB ont des fonctions distinctes pendant la cytocinèse. RalA est nécessaire pour la correcte progression de la cytocinèse alors RalB est nécessaire pour l’abscission du pont intracellulaire. Nous avons montré également que RalA, mais pas RalB, régule l’activation de p38 et de Jnk à travers le complexe exocyste en réponse au stress osmotique. L'implication de RalB, mais pas RalA, dans la migration cellulaire a été établie antérieurement. Dans ces trois fonctions, nous avons montré que les GTPases Ral sont été régulées par des RalGEFs spécifiques.Nous avons effectué un crible par siARN de 91 gènes codant des protéines du réseau d’interactions protéine‐protéine autour de Ral (l'interactome de Ral), nous avons identifié 14 protéines impliquées dans la voie de RalA et 8 protéines impliquées dans la voie de RalB, en cytocinèse. Dans la migration cellulaire, nous avons identifié 22 protéines impliquées dans la voie de RalB. Nous avons identifié cinq protéines communes aux deux fonctions cellulaires.Parmi ces protéines, j'ai étudié la relation fonctionnelle entre RalA et Stk38, une kinase qui appartient à la voie Hippo, qui a un rôle suppresseur de tumeur. J'ai montré que RalA active Stk38 par une voie RalA/exocyste/Map4k4 en réponse au stress osmotique. J’ai démontré que cette voie est impliquée dans l’activation de la voie p38 et Jnk en réponse au stress osmotique. J'ai aussi montré que la régulation deStk38 par RalA est nécessaire pour l'apoptose induite par le TNFα.L'identification de nouveaux composants de la voie RalA ouvre de nouvelles perspectives dans la compréhension de la fonction des GTPases Ral dans les processus normaux et tumoraux. En outre, ce travail est le premier présentant RalA comme une protéine pro‐apoptotique, ce qui suggère que RalA pourrait posséder une fonction suppresseur de tumeurs. / The Ras‐like GTPases RalA and RalB are proximal effectors of oncogenic Ras.Despite their high homology, their common activators (the RalGEFs) and effectors(the exocyst complex), they make distinct and sometimes collaborative contributions to diverse cellular functions. RalA supports anchorage independent growth and regulates polarized exocytosis. RalB regulates cell migration and autophagy and inhibits apoptosis of cancer cells. How Ral GTPases achieve their differing functions is still elusive.One part of my thesis was dedicated to study the specificity of RalA and RalB functions, as well as the specificity of RalGEFs functions and of the components of the Ral interactome, in three biological processes: cytokinesis, cell migration and MAPK activation.We demonstrated that RalA and RalB have distinct functions during cytokinesis.RalA is necessary for correct progression of cytokinesis whereas RalB is necessary for abscission of the intracellular bridge. We showed also that RalA, but not RalB,regulates p38 and Jnk activation upon osmotic stress through the exocyst complex.The importance of RalB, but not RalA, in cell migration was established previously. In these three functions, we showed that the functions of Ral GTPases were triggered by specific RalGEFs.We carried out a siRNA screen of 91 genes encoding proteins participating to a protein‐protein interaction map rooted in Ral (the Ral interactome), we determined14 proteins as components of RalA pathway and 8 proteins as components of RalBpathway, required for cytokinesis completion. In cell migration, we determined 22 proteins as components of RalB pathway. We identified 5 proteins in common involved in both cellular functions.Among these proteins I have been studying the functional relationship betweenRalA and Stk38, a kinase that belongs to the tumour suppressor Hippo pathway. I showed that upon osmotic stress, RalA activates Stk38 by phosphorylation through aRalA/exocyst/Map4k4 pathway. I demonstrate that this pathway has the function to trigger p38 and Jnk activation upon osmotic stress. I showed that the regulation ofStk38 by RalA is required for apoptosis induced by TNFα.The identification of new components of Ral pathway opened new perspectives in understanding the Ral GTPases function in normal and tumour processes. Moreover,this is the first work presenting RalA as a pro‐apoptotic protein, suggesting that RalAmight have tumour‐suppressor like functions.

Etwa 25 % der Nierenzellkarzinome (RCC) weisen bei Diagnosestellung bereits Metastasen auf. Aufgrund der schlechten Prognose des metastasierten RCC besteht ein dringender Bedarf an neuen Therapieformen sowie an prognostischen und diagnostischen Markern. microRNAs (miRNAs) bieten sich dabei als vielversprechende molekulare Biomarker an. Für den klarzelligen RCC-Subtypen (ccRCC) wurde bereits ein umfangreiches miRNA Expressionsprofil erstellt, mit dem ccRCC-relevante, vorwiegend herunterregulierte miRNAs identifiziert werden konnten. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Expression der miR-141 und miR-145 in RCC-Zelllinien durch epigenetische Mechanismen gehemmt ist und die Promotorbereiche dieser miRNAs stark methyliert vorliegen. In RCC-Zellen konnte eine tumorsuppressive Wirkung dieser miRNAs durch Hemmung der Migration (beide) und Invasion (miR-141) nachgewiesen werden. Durch die gleichzeitige Überexpression der beiden miRNAs kam es zu einer kooperativen Wirkung und so zu einer verstärkten Hemmung der Zellmigration. Weitere Untersuchungen konnten eine Reihe neuer onkogener Targets der miR 141 und miR 145 identifizieren. Dabei zeigte sich ein kooperativer Effekt durch Kombination beider miRNAs auf die Expression der Targets HS6ST2 und LOX. Die Targets LOX und MAP4K4 waren in ccRCC Gewebe auf mRNA-Ebene stark überexprimiert im Vergleich zum umliegenden Normalgewebe. Bei der anschließenden Tissue-Mikroarray-Analyse der Expression auf Proteinebene zeigte sich zudem ein prognostisches Potenzial der Targets LOX und MAP4K4 für das Gesamtüberleben von ccRCC Patienten. Diese Daten verdeutlichen den enormen Einfluss von epigenetisch dysregulierten miRNAs und deren spezifischen Targets auf tumorassoziierte Prozesse. Zudem bietet das Netzwerk aus Epigenetik, miRNAs und deren jeweiligen Targets nicht nur eine Reihe von diagnostischen und prognostischen Möglichkeiten, sondern liefert auch viele Ansatzpunkte für die Entwicklung von neuen therapeutischen Strategien. / Approximately 25 % of diagnosed renal cell carcinoma (RCC) have already metastasized. Due to poor prognosis of metastatic RCC, there is an urgent need for new therapies and prognostic and diagnostic markers to identify high-risk patients. Here microRNAs (miRNAs) might be promising new molecular biomarkers. For the clear cell RCC subtype (ccRCC) a comprehensive miRNA expression profile was already established. In this profiling several ccRCC-associated, predominantly down-regulated miRNAs were identified. In the present study, epigenetic mechanisms were identified to play a significant role in the down regulation of miR-141 and miR-145 in RCC cell lines. In addition, a strong methylation of the corresponding promoter regions was detected at molecular level. In RCC cells a tumor suppressive effect of these miRNAs was shown by decreasing migration (both) and invasion (miR-141) and furthermore, co overexpression of both miRNAs resulted in a cooperative effect with increased inhibition of cell migration. Several new oncogenic targets of miR-141 and miR-145 were identified by further investigations. Here the two miRNAs again showed a cooperative effect, as demonstrated by a significantly increased inhibition of HS6ST2 and LOX expression. In ccRCC tissue the expression of LOX and MAP4K4 was strongly enhanced on mRNA level compared to normal tissue. In the subsequent tissue microarray analysis of protein expression, LOX and MAP4K4 showed a prognostic impact for the overall survival of patients with ccRCC. These results illustrate a huge impact of epigenetically dysregulated miRNAs and of their specific targets on tumor-associated processes. Furthermore, the network of epigenetics, miRNAs and their respective targets will offer a number of diagnostic and prognostic capabilities, but will also provide many opportunities for the development of new therapeutic strategies.

Les organismes vivants, qu'ils soient simples ou complexes, ont acquis des stratégies pour s'adapter aux changements environnementaux. Ces changements correspondent à un large éventail de signaux chimiques, physiques ou mécaniques qui doivent être transmis en messages intracellulaires. Dans la cellule, des réseaux de signalisation sont modulés avec une grande précision pour transmettre ces messages et générer une réponse cellulaire appropriée. Les protéines d'échafaudage jouent un rôle crucial dans la sélectivité et la modulation spatio-temporelle de la transduction du signal. Par divers mécanismes moléculaires, elles médient l’organisation de complexes multimoléculaires impliqués dans plusieurs processus biologiques. CNK est une protéine d'échafaudage découverte par le biais d’études génétiques chez la drosophile où elle agit comme modulateur positif de la signalisation RAS/MAPK. Cependant, les fonctions physiologiques des homologues de CNK de mammifères (CNK1, CNK2 et CNK3) et leurs contributions aux pathologies humaines sont mal caractérisées. De plus, il existe peu d’évidences rapportant leur implication dans la signalisation RAS/MAPK. Elles ont plutôt été associées à des voies de signalisation contrôlées par les guanosine triphosphatases (GTPases) des familles ARF et RHO. Dans un premier manuscrit, nous avons montré que CNK2 est requise pour la migration et l'invasion des cellules cancéreuses en couplant le récepteur tyrosine kinase (RTK) prométastatique AXL à l'activation de la GTPase ARF6. D'un point de vue mécanistique, la signalisation induite par AXL favorise le recrutement de CNK2 à la membrane plasmique de manière dépendante de PI3K. Ensuite, CNK2 promeut l’activation d’ARF6 via son interaction aux ARF Guanosine exchange factors (GEFs) cytohésines et à la protéine adaptatrice SAMD12. Nous démontrons également qu’ARF6 coordonne l'activité des GTPases RAC1 et RHOA. Enfin, l'ablation génétique de CNK2 ou SAMD12 réduit considérablement les lésions métastatiques hépatiques et pulmonaires dans un modèle de xénogreffe de souris. Dans une série d’expériences de BioID supplémentaires utilisant le mutant gain-de-fonction ARF6 Q67L, nous avons identifié PLD1 et ITGB1 comme candidats potentiels pouvant médier la signalisation RAC1 et RHOA en aval d’ARF6. Dans une autre série d’expériences, nous avons caractérisé l'interaction entre les CNKs et la sous-famille des kinases Misshapen (MSN). Les trois membres de cette sous-famille, MAP4K4, TNIK et MINK1, ont été identifiés comme principaux interacteurs proximaux de CNK2A et CNK3 dans les expériences de BioID. Toutefois, leur interaction ne semble pas être impliquée dans la fonction promigratoire de CNK2A. Par des expériences de cartographie, nous démontrons que les domaines CRIC et DUF1170 de CNK2/3 et la région coiled-coil de MAP4K4 sont importants pour leur interaction. Nos travaux suggèrent également que SAMD10 compétitionne avec MAP4K4 pour se lier à CNK2 et que SAMD10/12 modulent la stabilité de CNK2. Enfin, nos résultats préliminaires suggèrent que MAP4K4 induit la phosphorylation de CNK2/3. Cependant, la pertinence biologique de ces évènements reste à déterminer. Dans l'ensemble, nos travaux révèlent une fonction inattendue de CNK2 dans la régulation de la motilité des cellules cancéreuses et identifient une nouvelle voie de signalisation qui pourrait être ciblée pour limiter les métastases. En outre, nos travaux identifient plusieurs pistes pour approfondir le rôle de CNK dans les cellules de mammifères. / All living organisms, whether simple or complex, have acquired sophisticated strategies to adapt to their changing environment. These environmental changes correspond to a breadth of chemical and mechanical signals that need to be transmitted into intracellular information. In cells, dense signalling networks are put into place and modulated with great precision to transmit messages and generate appropriate cellular responses. Scaffolding proteins play a crucial role in the selectivity and spatiotemporal modulation of signal transduction. Through various molecular mechanisms, they mediate the organization of multimolecular complexes implicated in various biological processes. CNK is a scaffolding protein discovered through genetic studies in drosophila where it acts as an important positive regulator of the highly oncogenic RAS/MAPK pathway. In contrast, the physiological functions of human CNKs and their roles in human diseases are poorly characterized. Moreover, evidence supporting their requirement for RAS/MAPK signalling remains sparse. Rather, they have been linked to signalling pathways controlled by the ARF and RAS homologous (RHO) subfamilies of GTPases. In a first manuscript, we found that mammalian CNK2 promotes cancer cell migration and invasion by coupling the pro-metastatic RTK AXL to downstream activation of ARF6 GTPase. Mechanistically, we showed that AXL signalling induces PI3K-dependent recruitment of CNK2 to the plasma membrane where it stimulates ARF6 via its interaction with the cytohesin ARF GEFs and the adaptor protein SAMD12. We also showed that ARF6 coordinates RAC1 and RHOA GTPase activity. Finally, the genetic ablation of CNK2 or SAMD12 potently reduces liver and lung metastatic lesions in a mouse xenograft model. In a series of supplemental BioID experiments using the gain-of-function ARF6 Q67L mutant, we identified PLD1 and ITGB1 as potential candidates that could mediate RAC1 and RHOA signalling downstream of ARF6. In another study, we characterized the interaction between CNKs and the MSN subfamily of kinases. The three members of this subfamily, namely MAP4K4, TNIK and MINK1, were identified as top proximal interactors of CNK2A and CNK3 in the BioID experiments. However, their interaction does not appear to be involved in the pro-migratory function of CNK2A. Through mapping experiments, we found that the CRIC and DUF1170 domains of CNK2 and CNK3 and the coiled-coil region of MAPK4K4 are important for their interaction. In addition, we found that SAMD10 competes with MAP4K4 for binding to CNK2 and that SAMD10/12 proteins also modulate CNK2 stability. Finally, our preliminary results suggest that MAP4K4 induces CNK2/3 phosphorylation. However, the biological relevance of these interactions and phosphorylation events remains to be addressed. Overall, our work uncovers an unanticipated function of CNK2 in regulating cancer cell motility and identifies a novel signalling pathway that could be targeted to restrain metastasis. Moreover, it identifies several avenues for further study into CNK function in mammalian cells.

La migration cellulaire collective est essentielle aux processus physiologiques, tels que le dé-veloppement et la réparation des tissus, et aux conditions pathogènes, telles que les métas-tases cancéreuses. Les lésions métastatiques sont à l'origine de la majorité de la mortalité liée au cancer, ce qui incite à comprendre les mécanismes moléculaires régissant la migration collective du cancer et à explorer leur potentiel thérapeutique. Dans ce contexte, la kinase MAP4K4 est apparue comme une kinase pro-métastatique, associée à un mauvais pronostic pour les patients et reconnue pour réguler la migration des cellules cancéreuses. Cependant, son rôle dans la migration collective reste flou. Au cours des dernières années, le groupe de recherche du Dr Emery a dévoilé que Misshapen, l'orthologue drosophile de MAP4K4, est un régulateur central de la migration collective des cellules de bordure, soulevant la question de savoir si MAP4K4 coordonnerait la migration collective des cellules cancéreuses. Le but de cette thèse était d’évaluer la fonction de MAP4K4 dans la migration collective des cellules cancéreuses, incluant deux modes de migration différents : en grappe et en feuillets. En utilisant la lignée cellulaire A431, nous démontrons le rôle de MAP4K4 dans la régulation de la dynamique de protrusion, de rétraction et d’adhésion focale, favorisant la migration des grappes grâce à la régulation des forces de traction cellule-substrat. De plus, nous dévoi-lons un nouveau rôle de MAP4K4 dans l’adhésion cellule-cellule, en contrôlant la charge de tension et la stabilité, et en ajustant les contraintes intercellulaires. Notamment, lors de la migration des feuillets, les cellules A431 forment des structures en forme de doigts, avec une hiérarchie leader-suiveur. En caractérisant ces structures migratrices, nous avons identifié des structures d'actomyosine supracellulaires, ouvrant ainsi de nouvelles questions et voies d'investigation pour explorer les mécanismes de communication cellule-cellule. De plus, nous avons montré que MAP4K4 régule la formation des doigts et la densité des câbles supracellu-laires, nuisant à l'émergence de cellules leader et coordonnant la communication cellule-cellule. Dans l’ensemble, ces travaux soulignent le rôle central de MAP4K4 dans la régulation de la migration collective des cellules cancéreuses par l’adhésion focale et la modulation de la jonction cellule-cellule, ayant finalement un impact sur la génération et la transmission de la force cellulaire, coordonnant ainsi le mouvement collectif. En outre, nous discutons du po-tentiel de l’inhibition de MAP4K4 en tant que stratégie de traitement des métastases. / Collective cell migration is essential for both physiological processes, such as development and tissue repair, and pathogenic conditions, such as cancer metastasis. Metastatic lesions drive the majority of cancer-related mortality, urging the understanding of molecular me-chanisms governing collective cancer migration, and exploring their therapeutic potential. In this context, the kinase MAP4K4 has emerged as a pro-metastatic kinase, associated with poor patient prognosis and recognized for regulating cancer cell migration. However, its role in collective migration remains unclear. In the past years, Dr. Emery's research group unveiled that Misshapen, the MAP4K4 Drosophila orthologue, is a central regulator of border cell col-lective migration, raising the question whether MAP4K4 would coordinate the collective mi-gration of cancer cells. The purpose of this thesis was to assess the function of MAP4K4 in carcinoma cell’s collective migration, including two different migration modes : clusters and sheets. Using A431 cell line, we demonstrate MAP4K4’s role in regulating protrusion, retraction and focal adhesion dy-namics, promoting cluster migration through regulating cell-substrate traction forces. Furthermore, we unveil a new role of MAP4K4 at cell-cell adhesions, controlling tension loa-ding and stability, and tunning the intercellular stresses. Notably, during sheet migration, A431 cells form finger-like structures, with a leader-follower hierarchy. Performing the charac-terization of these migrating structures, we identified supracellular actomyosin structures, opening new questions and investigative pathways to explore cell-cell communication me-chanisms. Moreover, we showed that MAP4K4 regulates finger formation and the density of the supracellular cables, impairing the emergence of leader cells and coordinating cell-cell communication. Overall, this work underscores the central role of MAP4K4 in regulating collective cancer cell migration through focal adhesion and cell-cell junction modulation, ultimately impacting cell force generation and transmission, coordinating collective movement. Furthermore, we dis-cuss the potential of MAP4K4 inhibition as a strategy for metastasis therapy.