O gênero Trichosporon é composto por leveduras artrosporadas do Filo Basidiomycota e é conhecido agente de infecção fúngica invasiva (IFI) em pacientes imunodeprimidos ou com outros fatores de risco. Em pacientes onco-hematológicos é a principal levedura responsável por IFI depois do gênero Candida. Entre as espécies responsáveis por infecções no homem encontram-se: T. asahii, T. inkin, T. mucoides, T. dermatis, T. jirovecii, T. ovoides, T. cutaneum, T. montevideense, T. domesticum, T. asteroides, T. coremiiforme, T. faecale, T. dohaense, T. lactis, T. japonicum. A tecnologia de identificação de fungos por espectrometria de massa (SM) MALDI-TOF ainda carece de padronização para identificação de fungos do gênero Trichosporon, mas a literatura mostra resultados encorajadores. O objetivo deste estudo é padronizar a técnica de espectrometria de massa MALDI-TOF para a identificação das espécies do gênero Trichosporon de importância médica. O estudo foi realizado em cooperação entre a Divisão de Laboratório Central do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (DLC, HC-FMUSP), Instituto de Medicina Tropical da USP (IMT-USP), Instituto Adolfo Lutz (IAL) e Laboratoire de Parasitologie-Mycologie do Hospital Saint Antoine de Paris, vinculado ao grupo de pesquisa INSERM/UPMC UMR S945 \"Immunité et Infection\" Faculté de Medecine et Université Pierre et Marie Curie de Paris. Noventa e três cepas/isolados foram analisado(a)s, sendo dezenove cepas de referência adquiridas junto à coleção holandesa Centraalbureau Schimmelcultures (CBS), 19 isolados do HC-FMUSP e IAL, e 55 isolados de diferentes hospitais franceses. A identificação molecular foi realizada através do sequenciamento da região IGS1 do rDNA e foi considerada como método de referência. O protocolo de extração de proteínas foi estabelecido através da comparação do desempenho de três metodologias (Bruker®, Cassagne et al., Sendid et al.). Os espectros de massa foram obtidos no laboratório de bacteriologia do Hospital Saint Antoine de Paris através do aparelho Microflex LT®. A interpretação dos resultados qualitativos e quantitativos (logscore) foi realizada através do Software Biotyper 3.0®. O desempenho de identificação do banco de espectros de referência Biotyper 3.0® foi comparado a outros cinco bancos criados a partir de espectros de referência (ERs) derivados de 18 cepas de referência CBS, sete isolados clínicos e 11 ERs do banco Biotyper 3.0. O protocolo de extração de proteínas descrito por Sendid et al. foi escolhido como protocolo de referência pois os espectros produzidos tiveram logscore superiores àqueles obtidos através do método do fabricante. O banco de ERs Biotyper 3.0® apresentou 32,3% de identificações corretas das espécies, sendo que o banco de ERs in house (número 5, constituído cepas CBS e isolados clínicos) apresentou 98,5% de identificações de espécies. Espectros de referência do banco de dados Biotyper 3.0® foram submetidos à identificação com a utilização dos ERs criados a partir de cepas CBS e isolados clínicos e foram evidenciados com erros de identificação: T. mucoides (2), T. ovoides (1) e T. cutaneum (2). Após padronização do protocolo de extração e criação de banco de ERs com cepas CBS e isolados clínicos caracterizados pelo sequenciamento da região IGS, a SM por MALDI-TOF apresentou-se como potente uma ferramenta para a identificação de fungos do gênero Trichosporon. O banco de ERs Biotyper 3.0® apresentou um fraco desempenho, relacionado a ERs que foram criados a partir de cepas mal identificadas / Trichosporon spp. are arthrospored yeasts from the Filum Basidiomycota that are known to produce invasive fungal infection (IFI) in patients with immunosupression or other risk factors. After Candida, Trichosporon is the second genus of yeasts responsible for IFI in patients with onco-hematological diseases. The most important species related to human infection are: T. asahii, T. inkin, T. mucoides, T. dermatis, T. jirovecii, T. ovoides, T. cutaneum, T. montevideense, T. domesticum, T. asteroides, T. coremiiforme, T. faecale, T. dohaense, T. lactis, T. japonicum. The technology of mass spectrometry (MS) for identification of Trichosporon species has not yet been standardized. However, preliminary promising results can be found in the literature. The objective of this study is to analyse and validate MS MALDI-TOF for the identification of Trichosporon species of medical relevance. This was a multicentric study with collaboration from the Central Laboratory Section from Clinics Hospital of the Medical School from the University of São Paulo (DLC-HCFMUSP), Tropical Medicine Institute from the University of São Paulo (IMT-USP), Instituto Adolfo Lutz (IAL) and Laboratoire de Parasitologie-Mycologie from the Hospital Saint Antoine of Paris and INSERM/UPMC UMR S945 \"Immunité et Infection\", Faculté de Medecine et Université Pierre et Marie Curie of Paris. Ninety three strains/isolates belonging to sixteen Trichosporon species were analysed. Nineteen were purchased from Centraalbureau Schimmelcultures (CBS) yeast collection, 19 belonged to HC-FMUSP and IAL collections, 55 belonged to different French collections. The reference identification method was the IGS1 rDNA sequencing. A protein extraction protocol was first established after comparing the performance of three different methodologies (Bruker(TM), Cassagne et al., Sendid et al.). The mass spectra were obtained through a Microflex LT(TM) mass spectrometer located at the bacteriology laboratory from Saint Antoine Hospital, Paris. Mass spectra, qualitative and quantitative results were produced through the software Biotyper 3.0(TM). The performance of the original main spectrum (MSP) library was compared to other 5 in house libraries built with the combination of MSPs derived from CBS strains (18), clinical strains (7) or (Bruker Daltonics/BD, Germany/USA) (11). The extraction protocol described by Sendid et al. showed better performance when compared to the manufacturer\'s one and was chosen for the subsequent extractions. Among the 6 different reference spectra databases tested, a specific one composed of 18 reference strains plus 7 clinical isolates (database 5) allowed the correct identification of 66 amongst 67 clinical isolates (98,5%). Biotyper 3.0 library produced only 32,3% of correct identifications. Biotyper\'s MSPs were submitted to cross-identification with MSPs derived from CBS strains and clinical isolates and misidentified original MSPs were identified: T. mucoides (2), T. ovoides (1) e T. cutaneum (2). While until now less widely applied to basidiomycetous fungi, MALDI-TOF appears to be a valuable tool for identifying clinical Trichosporon isolates at the species level. The MSP library Biotyper 3.0 showed a poorer performance which was due to misidentified strains utilized as reference for the MSPs

Introdução: As endoftalmites infecciosas apresentam prognóstico visual reservado, sendo essencial o diagnóstico rápido assegurando tratamento imediato. O diagnóstico etiológico precoce pode ser importante para adequação do antibiótico e definir a melhor conduta. A cultura de amostra de humor vítreo para isolamento e identificação do agente etiológico apresenta como principal desvantagem o tempo necessário de alguns dias para um resultado definitivo. Desta forma, a busca por técnicas que proporcionem a identificação rápida e precisa se faz necessária. Objetivos: avaliar a análise direta do humor vítreo, inoculado em frasco de hemocultura infantil, de pacientes com endoftalmite infecciosa utilizando a espectrometria de massas (EM) por ionização e dessorção a laser assistida por matriz por tempo de voo (matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI-TOF); comparar os resultados obtidos com o método convencional de cultura; analisar as características clínicas de acordo com os agentes etiológicos detectados; analisar os fatores que podem influenciar a positividade na identificação do agente etiológico. Métodos: estudo prospectivo, observacional com análise de amostras de humor vítreo, não diluído e diluído, de 96 pacientes com suspeita de endoftalmite infecciosa (critério de inclusão) diagnosticados no período entre outubro de 2015 e junho de 2017. O material foi inoculado em frasco de hemocultura e analisado pela cultura convencional e pela análise direta do humor vítreo pela EM MALDI-TOF. O tempo de identificação (turnaround time, TAT) pelos dois métodos foi comparado (teste de Wilcoxon pareado). Prognóstico visual após 3 meses do diagnóstico foi avaliado conforme o agente identificado. As variáveis avaliadas quanto à amostra foram: uso de antibiótico intravítreo prévio, amostra diluída ou não, obtida por biópsia vitrea ou por vitrectomia via pars plana e obtida do 1º ou 2º procedimento. Resultados: Dos 96 pacientes avaliados, foram excluídos dois casos por contaminação da amostra e sete casos por não preencherem os critérios de inclusão. Dentre os 87 pacientes incluídos, a cultura foi positiva em 60,9% (53 pacientes), sendo isoladas bactérias Gram-positivas em 46 casos (86,7%) e bactérias Gram-negativas em seis casos (11,3%); dois casos com cultura polimicrobiana. Não foi identificada nenhuma bactéria anaeróbia. Em três casos foram identificados Candida albicans. A mediana do TAT do agente etiológico foi 50,6 horas (variação entre 18,5 e 187,50 horas) e de 15 horas (variação entre 3,1 e 94,0 horas) pela cultura convencional e com EM MALDI-TOF, respectivamente (p < 0,001). A concordância da análise direta do frasco de hemocultura infantil com EM MALDI-TOF em relação à cultura convencional foi 81,1%, sendo 80,4% para bactérias Gram-positivas e 100% para bactérias Gram-negativas. Não houve significância na análise dos fatores que podem interferir nos resultados: uso de antibiótico ou não (positividade de 42,8% vs 64,3%, p=0,131); amostra de humor vítreo diluído ou não (TAT de 18,05 horas vs 17,03 horas, p=0,126); biópsia vítrea em relação à vitrectomia (positividade 93,1% vs 100%, p=0,531). Os agentes mais prevalentes foram Staphylococcus epidermidis (n=15; 28,3%), Streptococcus pneumoniae (n=9; 17%) e Staphylococcus aureus (n=6; 11,3%). Dentre os casos por Staphylococcus epidermidis, 60% e 86,7% apresentaram, no 3º mês pós-tratamento, acuidade visual melhor ou igual que 20/60 e 20/200, respectivamente. Nos demais casos, apenas 12,1% tiveram acuidade visual melhor ou igual a 20/200. Observou-se resistência a ciprofloxacino (93% a 100%), moxifloxacino (93% a 100%) e oxacilina (50% a 79%) pelos Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus haemolyticus. Conclusão: O presente estudo aplicou a análise direta pela EM MALDI-TOF em amostras de humor vítreo inoculadas em frasco de hemocultura e demonstrou uma redução mediana de 67,6% no tempo para identificação do agente etiológico em relação ao método de cultura convencional. Este método mostrou-se viável na rotina de um laboratório de microbiologia. Observou-se que os casos de endoftalmite por Staphylococcus epidermidis apresentaram melhor prognóstico visual em relação aos outros agentes. Possíveis fatores que possam interferir na positividade das análises não foram significativos / Introduction: Infectious endophthalmitis presents a limited visual prognosis; rapid diagnosis is essential to assure prompt treatment. The early etiological diagnosis may be important to guide antibiotic therapy and to adjust treatment. The main disadvantage of using culture of vitreous humor for isolation and identification of the etiological agent is the required time of a few days for definitive results. Thus, the search for techniques that provide fast and accurate identification becomes necessary. Objectives: To evaluate direct analysis of vitreous humor in pediatric blood culture bottle of patients with infectious endophthalmitis using mass spectrometry (MS) with matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI-TOF); to compare the results obtained with the conventional culture method; to analyze the clinical characteristics according to the detected etiological agents; to analyze the factors that may influence positive identification of the etiologic agent. Methods: A prospective, observational study with undiluted and diluted vitreous humor samples of 96 patients with suspected infectious endophthalmitis (inclusion criterion), diagnosed from October 2015 to June 2017. The material was inoculated in a blood culture bottle and analyzed by conventional culture and by direct analysis of the vitreous humor by MALDI-TOF MS. The identification time (turnaround time, TAT) of the two methods was compared (Wilcoxon paired test). Visual prognosis three months after the diagnosis was assessed according to the identified agent. The variables evaluated in the sample were: the use of previous intravitreal antibiotics, diluted or not, obtained by vitreous biopsy or pars plana vitrectomy and obtained from the 1st or 2nd procedure. Results: Of the 96 patients evaluated, two cases were excluded due to contamination of the sample, while seven cases did not meet the inclusion criteria. Among the 87 patients that were included, the culture was positive in 60.9% (53 patients); Gram-positive bacteria were isolated in 46 cases (86.7%) and Gram-negative bacteria in six cases (11.3%); in two cases there was polymicrobial culture. No anaerobic bacteria were identified. In three cases Candida albicans were identified. The median TAT of the etiological agent was 50.6 hours (ranging from 18.5 to 187.50 hours), and 15 hours (ranging from 3.1 to 94.0 hours) in the conventional culture and with MALDI-TOF MS, respectively (p < 0.001). The agreement of results from direct analysis with MALDI-TOF MS in relation to the conventional culture was 81.1%, being 80.4% for Gram-positive bacteria and 100% for Gram-negative bacteria. There was no significance in the analysis of the factors that may interfere with the results: the use of antibiotic or not (positivity of 42.8% vs 64.3%, p = 0.131); diluted or non-diluted vitreous humor sample (TAT of 18.05 hours vs 17.03 hours, p = 0.126); vitreous biopsy in relation to vitrectomy (positivity 93.1% vs 100%, p = 0.531). The most prevalent agents were Staphylococcus epidermidis (n = 15; 28.3%), Streptococcus pneumoniae (n = 9; 17%) and Staphylococcus aureus (n = 6; 11.3%). Among the cases due to Staphylococcus epidermidis, 60% and 86.7% showed visual acuity better than or equal to 20/60 and 20/200, respectively, in the 3rd month after treatment. In other cases, only 12.1% had visual acuity better than or equal to 20/200. Resistance to ciprofloxacin (93 to 100%), moxifloxacin (93 to 100%) and oxacillin (50 to 79%) by Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus haemolyticus was observed. Conclusion: The present study applied direct analysis by MALDI-TOF MS in vitreous humor samples inoculated in a blood culture bottle, and it showed a median reduction of 67.6% in time to identify the etiological agent in relation to the conventional culture method. This method proved to be feasible in the routine of a microbiology laboratory. It was observed that cases of endophthalmitis caused by Staphylococcus epidermidis had a better visual prognosis than other ones individually. Possible factors that could interfere in the positivity of the analyses were not significant

Kam, Kin Ting. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2008. / Includes bibliographical references (leaves 169-192). / Abstracts in English and Chinese. / Chapter 1. --- Abstract --- p.ii / English --- p.ii / Chinese --- p.v / Chapter 2. --- Acknowledgments --- p.vii / Chapter 3. --- Abbreviations and N-glycan representation --- p.viii / Chapter 4. --- Introduction --- p.1 / Chapter 5. --- Review of Literatures --- p.2 / Chapter 5.1. --- Introduction to Liver Fibrosis --- p.2 / Chapter 5.1.1. --- Pathogenesis of Liver Fibrosis --- p.2 / Chapter 5.1.2. --- Changes of liver architecture - basis of liver fibrosis diagnosis --- p.4 / Chapter 5.2. --- Current Diagnosis of Liver Fibrosis - from Biopsy Examination to Serum Test --- p.5 / Chapter 5.3. --- Glycomics and its Potential as Biomarkers --- p.9 / Chapter 5.3.1. --- Overview of Biochemical and Functional Characteristics of Glycan --- p.13 / Chapter 5.3.2. --- N-linked and O-linked Glycosylations - A Valuable Source of Biomarkers --- p.15 / Chapter 5.3.3. --- Glycomics 一 An Uprising Approach for Biomarker Discovery --- p.17 / Chapter 5.3.4. --- Human Proteome Organisation Human Disease Glycomics/Proteome Initiative --- p.19 / Chapter 5.3.5. --- Recent Applications of Glycomics to Biomarker Discovery --- p.20 / Chapter 5.4. --- Current Technologies for Glycomic Study --- p.22 / Chapter 5.4.1. --- MALDI-TOF MS --- p.22 / Chapter 5.4.2. --- Lectin Microarray --- p.25 / Chapter 5.4.3. --- Liquid Chromatography --- p.27 / Chapter 5.4.4. --- Capillary Electrophoresis --- p.29 / Chapter 5.4.5. --- Quantitative Profiling of Tissue Glycome --- p.31 / Chapter 6 --- Project Rationales and Objectives --- p.36 / Chapter 7 --- Section 1: Methodology Development of Quantitative N- glycomic Profiling --- p.37 / Chapter 1. --- Introduction --- p.37 / Chapter 2. --- Method and Materials --- p.39 / Chapter 3. --- Results --- p.46 / Chapter 4. --- Discussion --- p.65 / Chapter 5. --- Conclusion --- p.71 / Chapter 8. --- Section 2: Serum N-glycomic Profile as Biomarker for Liver Fibrosis 一 Pilot Study --- p.73 / Chapter 1. --- Introduction --- p.73 / Chapter 2. --- Method and Materials --- p.75 / Chapter 3. --- Results --- p.79 / Chapter 4. --- Discussion --- p.86 / Chapter 5. --- Conclusion --- p.94 / Chapter 9. --- Section 3: Serum N-glycomic Profile as Biomarker for Liver Fibrosis -Verification Study --- p.96 / Chapter 1. --- Introduction --- p.96 / Chapter 2. --- Method and Materials --- p.98 / Chapter 3. --- Results --- p.104 / Chapter 4. --- Discussion --- p.137 / Chapter 5. --- Conclusion --- p.152 / Chapter 10. --- General Discussion --- p.153 / Chapter 11. --- Conclusion --- p.167 / Chapter 12. --- Original Data --- p.168 / Chapter 13. --- References --- p.169 / Chapter 14. --- Publications --- p.196

Orientador: Carlos Emílio Levy / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-27T01:21:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CarvalhoFilho_ElioBarreto_M.pdf: 1484872 bytes, checksum: da445ed854a5a8f11143d06dd28aab5c (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Introdução: Bacilos gram-negativos não fermentadores (BGN-NFs) são microrganismos que se caracterizam pela incapacidade de utilizar a glicose como fonte de energia pela fermentação, degradando-a pela via oxidativa. A identificação dos BGN-NFs continua sendo um desafio para os laboratórios de rotina em microbiologia pela dificuldade de identificação, em virtude, da baixa ocorrência em amostras ambulatoriais, assim como, pela falta de recursos rápidos, eficientes e pela complexidade e alto custo dos testes de identificação. Estes microrganismos têm importância clínica para pacientes imunocomprometidos com infecções sistêmicas e pacientes com Fibrose Cística, com infecções oportunistas pulmonares. Nosso objetivo foi utilizar técnicas fenotípicas e de espectrometria de massas para identificar BGN-NFs pouco frequentes isolados em amostras clínicas de pacientes com FC e de pacientes internados no Hospital de Clínicas-Unicamp. Método: Foram analisados 71 isolados de amostras clínicas recuperadas do Banco de bactérias do Laboratório de Microbiologia do HC-Unicamp, envolvendo Chryseobacterium indologenes, Elizabethkingia meningoseptica, Cupriavidus pauculus, Ochrobactrum anthropi, Ralstonia pickettii, Ralstonia mannitolilytica, Ralstonia insidiosa, identificados por técnicas fenotípicas (provas bioquímicas manuais padronizadas pelo Laboratório de Microbiologia [método fenotípico manual] e automatizadas pelo Vitek®2, Phoenix¿) e por espectrometria de massa MALDI-TOF MS (BioMerieux®) e MALDI BD (Becton& Dickson®). Para 41 isolados de Ralstonia spp e Ochrobactrum anthropi estes métodos também foram comparados com PCR, pois não foram encontrados oligonucleotídeos específicos para os demais BGN-NFs estudados. Resultados: pelo método Fenotípico Manual foi possível identificar ao nível de espécie 54,9% dos isolados, apenas gênero 19,7% e 25,4% não puderam ser identificados. Houve uma baixa concordância entre as técnicas Fenotípica Manual e a Automatizada Vitek®2, sendo de 50,7%, quando considerada a concordância pelo menos ao nível de gênero. A maior concordância verificou-se entre os dois equipamentos de MALDI-TOF, de 87,3%, quando considerada a concordância pelo menos ao nível de gênero. Discussão: Quando comparamos todos os métodos utilizados para identificação dos 71 isolados encontramos uma concordância simultânea de 23,9% (17/71), quando considerado pelo menos ao nível de gênero e apenas 2 (2,8%) ao nível de espécie. Quando comparamos os métodos Fenotípico Manual, Vitek®2, Phoenix®, MALDI MS, MALDI BD e incluindo PCR para a identificação de 41 amostras de Ralstonia spp e Ochrobactrum anthropi, encontramos uma concordância simultânea de 19,5% (8/41) quando considerado pelo menos ao nível de gênero e 2 (2,8%) de espécie. Possíveis justificativas para a baixa concordância entre as metodologias seriam a diversidade de princípios, de acurácia e de bancos de dados dos métodos. Conclusão: É muito baixa a concordância entre as diferentes metodologias utilizadas, sendo que os equipamentos de MALDI-TOF possuem entre si uma correlação muito boa para identificação de BGN-NFs, porém mostram-se discordantes aos níveis de confiança dos resultados. Foi encontrada uma importante limitação na PCR apresentando reação cruzada com gêneros testados, sugerindo não ser confiável para este fim. Para os gêneros estudados e as metodologias empregadas, a discordância dos resultados sugerem cautela pela possibilidade de erro de identificação / Abstract: Introduction: Gram-negative non-fermenting (GN-NFB) are microorganisms that are characterized by the inability to use glucose by fermentation as an energy source, degrading it by the oxidative pathway. The identification of BGN-NFS remains a challenge for the routine of microbiology laboratories, due to the low occurrence in outpatient samples, the lack of fast and efficient resources and the complexity and high cost of the tests. These microorganisms are clinically important for immunocompromised patients with systemic infections and patients with Cystic Fibrosis, with opportunistic pulmonary infections. Our goal was to use phenotypic and mass spectrometry techniques to identify uncommon GN-NFB isolated in samples from CF patients and patients admitted to the Hospital de Clinicas Unicamp. Method: 71 isolates recovered from clinical specimens were selected from the from the Microbiology Laboratory bacteria collection, previously identified by fenotipic methods as Chryseobacterium indologenes, Elizabethkingia meningoseptica, Cupriavidus pauculus, Ochrobactrum anthropi, Ralstonia pickettii, Ralstonia mannitolilytica, Ralstonia insidiosa. The samples were identified by in house Phenotypic manual method, automated by Vitek®2, by Phoenix¿ and MALDI-TOF mass spectrometry MS (BioMerieux®) and MALDI BD (Becton Dickson®). These methods were also compared to PCR for only 41 isolates of Ralstonia spp and Ochrobactrum anthropi, because they were not found specific primers for the other GN-NFB analised. Results: the phenotypic Manual method identified to species level 54.9% of the isolates, 19.7% only to genera and 25.4% were not identified. There was a poor correlation between the techniques phenotypic Manual method and Automated Vitek®2, with 50.7% of agreement, when considering at least in terms of gender. The best agreement of 87.3% occurred between the results of the two MALDI-TOF equipment, when considering the correlation of at least at the level of genus. Discussion: When comparing all the methods used for the identification of 71 isolates were found simultaneous agreement of 23.9% (17/71) when considered at least to genus level and only 2 (2.8%) to species level. When analyzed the phenotypic Manual method, Vitek®2, Phoenix®, MALDI MS, MALDI BD and PCR applied to 41-GN-NFB samples, simultaneous agreement were found for 19.5% (8/41) when considered at least to genus level and 2 (2.8%) to species. Possible reasons for the low agreement between the methodologies could be the diversity of principles, accuracy and databases of the methods. Conclusion: The two methods of MALDI-TOF have a very good correlation for GN-NFB identification, however showed discordance for the confidence levels of results. With the primers tested one important limitation of the PCR is the cross-reaction among many genera, suggesting not to be safe for the discrimination of the analyzed genera. For the genera and methods analised the discrepancy of results suggests caution because of the possibility of wrong identification / Mestrado / Saude da Criança e do Adolescente / Mestre em Ciências

INTRODUÇÃO: As infecções por bactérias anaeróbias são geralmente de origem endógena, polimicrobianas e mistas. Devido a sua natureza fastidiosa, essas bactérias necessitam de uma prévia incubação em meios líquidos enriquecidos, como o caldo Thioglicolato (CT) para serem recuperadas, o isolamento desses microrganismos é trabalhoso e o tempo de resposta - TAT (turn around time) estendido desse exame pode estar associado a falhas terapêuticas e ao aumento da resistência bacteriana. A cultura de anaeróbios (CANA) ainda é um desafio para os laboratórios clínicos de rotina e novas estratégias para diminuir o TAT são fundamentais para que esse exame forneça um impacto clínico significativo. OBJETIVO: Otimizar o processo de triagem da CANA pela modificação do CT; comparar a identificação dos anaeróbios pelas metodologias fenotípicas ANC (Vitek 2- bioMérieux, France) e MALDI-TOF (Vitek MS - bioMérieux, France) e verificar o impacto econômico das ações propostas MÉTODOS: O caldo de triagem CT foi modificado eluindo individualmente discos comerciais de antibióticos (em concentrações fixas) selecionados por apresentarem baixa ou nenhuma ação contra microrganismos anaeróbios e com um bom espectro de ação para os principais aeróbios associados em culturas mistas e foram escolhidos aqueles que após uma bateria de testes frente a 15 cepas dos principais anaeróbios envolvidos em infecções humanas mantiveram a viabilidade inicial. O caldo Thioglicolato modificado (CTM) foi composto pela adição dos antibióticos que apresentaram a melhor \"performance\" acima descrita. A sensibilidade e especificidade do CTM foram avaliadas paralelamente com CT na rotina de CANA do HCFMUSP. Para a avaliar a identificação fenotípica, 421 anaeróbios isolados no período de seis meses foram submetidos a identificação pelo ANC (Vitek 2) e MALDI-TOF (Vitek MS). Os resultados discordantes ou com baixa discriminação da espécie foram avaliados pelo sequenciamento 16S rRNA. O impacto econômico da introdução do CTM bem como os custos diretos da identificação pelo MALDI-TOF foram avaliados. RESULTADOS: O CTM foi composto por amicacina, gentamicina e aztreonam. Das 159 amostras clínicas triadas pelo CT e CTM, 11 (7%) foram positivas para CANA com as mesmas espécies isoladas em ambos os meios. Utilizando o CTM, foi obtida uma redução dos falsos positivos de 97 (61%) para 69 (43%) quando comparado ao CT (p < 0,05). O TAT do resultado negativo da CANA com o CTM foi reduzido de 14 para sete dias em 28 (18%) amostras; o CTM permitiu a liberação do resultado positivo da CANA 48 horas à frente do CT. A sensibilidade do CTM foi igual ao CT, porém a especificidade foi superior em 19%. Das 421 cepas avaliadas, 35 foram identificadas somente pelo MALDI-TOF (Vitek MS) sendo que uma (Clostridium innocum) foi identificada somente pelo sequenciamento 16S rRNA. Das 386 avaliadas por ambas as metodologias, houve uma concordância de 97% e os resultados das 13 (3%) cepas submetidas ao sequenciamento foram concordantes em 92% com o MALDI-TOF (Vitek MS) que promoveu a redução do TAT do resultado positivo em cinco dias. A implementação do CTM possibilitou uma redução de custos nessa amostragem, de R$ 2.240,00 e a identificação pelo MALDI-TOF proporcionou uma economia de R$ 7.786,00. Considerando os valores econômicos encontrados nesse estudo e projetando-os nas estatísticas de CANA do HCFMUSP em 2017, o CTM poderia proporcionar uma economia de R$ 132.560,00 /ano e o MALDI-TOF uma redução nos gastos de R$ 13.579,00/ ano CONCLUSÕES: A padronização e implementação do CTM permitiu uma um aumento significativo de especificidade da cultura anaeróbia com redução do TAT e dos custos. A utilização do MALDI-TOF diminuiu o TAT das identificações aliado a uma melhor performance de forma custo efetiva / INTRODUCTION: Anaerobic bacterial infections are usually of endogenous origin, polymicrobial and mixed. Because of their fastidious nature, these bacteria require prior incubation in enriched liquid media, such as Thioglycolate broth (TB) to be recovered, the isolation of these microorganisms is laborious, and the TAT (turn around time) extended time of this examination may be associated with therapeutic failures and increased bacterial resistance. Anaerobic culture (AC) is still a challenge for routine clinical laboratories, and new strategies for lowering TAT are critical to provide a significant clinical impact. OBJECTIVE: To optimize the AC screening process by modifying the TB; Compare anaerobical identification between (Vitek 2- bioMérieux, France) and MALDI-TOF (Vitek MS - bioMérieux, France) and to verify the economic impact of the proposed actions. METHODS: TB broth was modified by eluting individually antibiotic commercial discs (at fixed concentrations) selected for low or no action against anaerobic microorganisms and with a good action spectrum for the main associated aerobes in mixed cultures. Those who maintained the initial viability after a battery of tests against 15 strains of the major anaerobes involved in human infections were selected. Modified Thioglycolate Broth (MTB) was composed of the antibiotics that presented the best performance described above. The sensitivity and specificity of MTB were evaluated in parallel with TB in the HCFMUSP AC routine. To evaluate the phenotypic identification, 421 anaerobes isolated in the six-month period were submitted to identification by ANC (Vitek 2) and MALDI-TOF (Vitek MS). Discordant results or those with low discrimination of the species were submitted to 16S rRNA sequencing. The economic impact of the introduction of MTB as well as the direct costs of MALDI-TOF identification were assessed. RESULTS: MTB was composed of amikacin, gentamicin and aztreonam. Of the 159 clinical samples screened by TB and MTB, 11 (7%) were positive for AC with the same species isolated in both media. Using MTB, a reduction of false positives was obtained from 97 (61%) to 69 (43%) when compared to TB (p < 0.05). The TAT of the negative result of the AC with the MTB was reduced from 14 to 7 days in 28 (18%) samples; the MTB allowed the release of the AC positive result 48 hours ahead of the TB. The sensitivity of MTB was equal to TB, but the specificity was higher in 19%. Of the 421 strains evaluated, 35 were identified only by MALDI-TOF (Vitek MS) and one (Clostridium innocum) was identified only by 16S rRNA sequencing. Of the 386 evaluated by both methodologies, there was a concordance of 97% and the results of the 13 (3%) strains submitted to the sequencing were concordant in 92% with the MALDI-TOF (Vitek MS) that promoted TAT of the positive result reduction in five days. The implementation of the MTB made possible a reduction of costs in this sampling, of US $ 677,00 and the identification by MALDI-TOF provided a saving of US $ 2354,00. Considering the economic values found in this study and projecting them in the HCFMUSP AC statistics in 2017, the MTB could provide savings of US $40,070.00 / year and MALDI-TOF a reduction in expenses of US $ 4,100.00 / year. CONCLUSIONS: Standardization and implementation of MTB allowed a significant increase of anaerobic culture specificity with TAT and costs reduction. The use of MALDI-TOF reduced the TAT of the identifications and also resulted in a better performance in a cost effective way

INTRODUÇÃO: As infecções por bactérias anaeróbias são geralmente de origem endógena, polimicrobianas e mistas. Devido a sua natureza fastidiosa, essas bactérias necessitam de uma prévia incubação em meios líquidos enriquecidos, como o caldo Thioglicolato (CT) para serem recuperadas, o isolamento desses microrganismos é trabalhoso e o tempo de resposta - TAT (turn around time) estendido desse exame pode estar associado a falhas terapêuticas e ao aumento da resistência bacteriana. A cultura de anaeróbios (CANA) ainda é um desafio para os laboratórios clínicos de rotina e novas estratégias para diminuir o TAT são fundamentais para que esse exame forneça um impacto clínico significativo. OBJETIVO: Otimizar o processo de triagem da CANA pela modificação do CT; comparar a identificação dos anaeróbios pelas metodologias fenotípicas ANC (Vitek 2- bioMérieux, France) e MALDI-TOF (Vitek MS - bioMérieux, France) e verificar o impacto econômico das ações propostas MÉTODOS: O caldo de triagem CT foi modificado eluindo individualmente discos comerciais de antibióticos (em concentrações fixas) selecionados por apresentarem baixa ou nenhuma ação contra microrganismos anaeróbios e com um bom espectro de ação para os principais aeróbios associados em culturas mistas e foram escolhidos aqueles que após uma bateria de testes frente a 15 cepas dos principais anaeróbios envolvidos em infecções humanas mantiveram a viabilidade inicial. O caldo Thioglicolato modificado (CTM) foi composto pela adição dos antibióticos que apresentaram a melhor \"performance\" acima descrita. A sensibilidade e especificidade do CTM foram avaliadas paralelamente com CT na rotina de CANA do HCFMUSP. Para a avaliar a identificação fenotípica, 421 anaeróbios isolados no período de seis meses foram submetidos a identificação pelo ANC (Vitek 2) e MALDI-TOF (Vitek MS). Os resultados discordantes ou com baixa discriminação da espécie foram avaliados pelo sequenciamento 16S rRNA. O impacto econômico da introdução do CTM bem como os custos diretos da identificação pelo MALDI-TOF foram avaliados. RESULTADOS: O CTM foi composto por amicacina, gentamicina e aztreonam. Das 159 amostras clínicas triadas pelo CT e CTM, 11 (7%) foram positivas para CANA com as mesmas espécies isoladas em ambos os meios. Utilizando o CTM, foi obtida uma redução dos falsos positivos de 97 (61%) para 69 (43%) quando comparado ao CT (p < 0,05). O TAT do resultado negativo da CANA com o CTM foi reduzido de 14 para sete dias em 28 (18%) amostras; o CTM permitiu a liberação do resultado positivo da CANA 48 horas à frente do CT. A sensibilidade do CTM foi igual ao CT, porém a especificidade foi superior em 19%. Das 421 cepas avaliadas, 35 foram identificadas somente pelo MALDI-TOF (Vitek MS) sendo que uma (Clostridium innocum) foi identificada somente pelo sequenciamento 16S rRNA. Das 386 avaliadas por ambas as metodologias, houve uma concordância de 97% e os resultados das 13 (3%) cepas submetidas ao sequenciamento foram concordantes em 92% com o MALDI-TOF (Vitek MS) que promoveu a redução do TAT do resultado positivo em cinco dias. A implementação do CTM possibilitou uma redução de custos nessa amostragem, de R$ 2.240,00 e a identificação pelo MALDI-TOF proporcionou uma economia de R$ 7.786,00. Considerando os valores econômicos encontrados nesse estudo e projetando-os nas estatísticas de CANA do HCFMUSP em 2017, o CTM poderia proporcionar uma economia de R$ 132.560,00 /ano e o MALDI-TOF uma redução nos gastos de R$ 13.579,00/ ano CONCLUSÕES: A padronização e implementação do CTM permitiu uma um aumento significativo de especificidade da cultura anaeróbia com redução do TAT e dos custos. A utilização do MALDI-TOF diminuiu o TAT das identificações aliado a uma melhor performance de forma custo efetiva / INTRODUCTION: Anaerobic bacterial infections are usually of endogenous origin, polymicrobial and mixed. Because of their fastidious nature, these bacteria require prior incubation in enriched liquid media, such as Thioglycolate broth (TB) to be recovered, the isolation of these microorganisms is laborious, and the TAT (turn around time) extended time of this examination may be associated with therapeutic failures and increased bacterial resistance. Anaerobic culture (AC) is still a challenge for routine clinical laboratories, and new strategies for lowering TAT are critical to provide a significant clinical impact. OBJECTIVE: To optimize the AC screening process by modifying the TB; Compare anaerobical identification between (Vitek 2- bioMérieux, France) and MALDI-TOF (Vitek MS - bioMérieux, France) and to verify the economic impact of the proposed actions. METHODS: TB broth was modified by eluting individually antibiotic commercial discs (at fixed concentrations) selected for low or no action against anaerobic microorganisms and with a good action spectrum for the main associated aerobes in mixed cultures. Those who maintained the initial viability after a battery of tests against 15 strains of the major anaerobes involved in human infections were selected. Modified Thioglycolate Broth (MTB) was composed of the antibiotics that presented the best performance described above. The sensitivity and specificity of MTB were evaluated in parallel with TB in the HCFMUSP AC routine. To evaluate the phenotypic identification, 421 anaerobes isolated in the six-month period were submitted to identification by ANC (Vitek 2) and MALDI-TOF (Vitek MS). Discordant results or those with low discrimination of the species were submitted to 16S rRNA sequencing. The economic impact of the introduction of MTB as well as the direct costs of MALDI-TOF identification were assessed. RESULTS: MTB was composed of amikacin, gentamicin and aztreonam. Of the 159 clinical samples screened by TB and MTB, 11 (7%) were positive for AC with the same species isolated in both media. Using MTB, a reduction of false positives was obtained from 97 (61%) to 69 (43%) when compared to TB (p < 0.05). The TAT of the negative result of the AC with the MTB was reduced from 14 to 7 days in 28 (18%) samples; the MTB allowed the release of the AC positive result 48 hours ahead of the TB. The sensitivity of MTB was equal to TB, but the specificity was higher in 19%. Of the 421 strains evaluated, 35 were identified only by MALDI-TOF (Vitek MS) and one (Clostridium innocum) was identified only by 16S rRNA sequencing. Of the 386 evaluated by both methodologies, there was a concordance of 97% and the results of the 13 (3%) strains submitted to the sequencing were concordant in 92% with the MALDI-TOF (Vitek MS) that promoted TAT of the positive result reduction in five days. The implementation of the MTB made possible a reduction of costs in this sampling, of US $ 677,00 and the identification by MALDI-TOF provided a saving of US $ 2354,00. Considering the economic values found in this study and projecting them in the HCFMUSP AC statistics in 2017, the MTB could provide savings of US $40,070.00 / year and MALDI-TOF a reduction in expenses of US $ 4,100.00 / year. CONCLUSIONS: Standardization and implementation of MTB allowed a significant increase of anaerobic culture specificity with TAT and costs reduction. The use of MALDI-TOF reduced the TAT of the identifications and also resulted in a better performance in a cost effective way