El sòl és un recurs no renovable a curt i mitjà termini ja que els processos que generen un sòl són extremadament lents i requereixen de milers d’anys. A més a més, no és un sistema aïllat, sinó que presenta interaccions dinàmiques amb la geosfera, l’atmosfera i la hidrosfera, per la qual cosa està exposat a l’entrada de contaminants a través de moltes fonts de contaminació. L’origen dels metalls pesants en els sòls, que pot ser geogènic i antropogènic, marca el nivell de concentració, la forma química i la mobilitat a la qual es troben. La contaminació per metalls pesants en sòls presenta un problema a causa de la seva persistència en el medi, ja que no es degraden. Per tant, la seva presència en sòls s’ha anat incrementant des dels inicis de la revolució industrial. Els metalls pesants més comuns en el sòl són el Pb, Zn, Cd i Cu, i l’As com a metal•loide, i la forma química en la que es troben influencia la seva solubilitat, mobilitat i toxicitat en els compartiments ambientals i a la cadena tròfica. La consideració d’un sòl com a contaminat comporta desenvolupar i aplicar actuacions de recuperació ambiental de l’emplaçament. En nombrosos casos, les intervencions per tractar la contaminació de sòls per metalls pesants es basen en l’addició de materials, el que permet augmentar la retenció dels contaminants i diluir la concentració dels mateixos en les mescles sòl+material resultants, amb la finalitat de fer menys accessible el metall pesant a les plantes i evitar la possible contaminació a altres compartiments ambientals i a la cadena tròfica. En base a aquesta problemàtica, la present tesi s’ha estructurat de la següent manera: Primerament, es va fer una comparació de mètodes analítics, prèvia validació, per a la determinació del contingut total d’elements en mostres inorgàniques d’interès ambiental entre diferents tècniques d’anàlisi directa (FRX i µFRX), i mètodes basats en una digestió humida (Aigua Règia i microones) seguida d’una quantificació amb ICP­OES i ICP-MS (detallat en la secció 2.1). Sent la digestió amb microones, combinada amb la mesura per una tècnica òptica adient, el millor mètode per a la determinació, tant d’elements majoritaris com traces, en matrius ambientals inorgàniques. També es van avaluar els tests de lixiviació per a predir la mobilitat de metalls pesants en mostres ambientals emprant tests basats en extraccions simples fent servir diferents agents extractants, tals com 0,01 M i 1M CaCl2, 0,43 M CH3COOH i 0,05 M EDTA i el test de lixiviació Influència del pH sobre la lixiviació amb addició inicial d’àcid/base (pHstat) (detallat en la secció 2.2). Tot i que la fracció extraïble dels metalls amb EDTA va ser major que la obtinguda en el punt de pHstat equivalent, comparant aquest valor amb el punt de pH més àcid del pHstat, es va observar que aquest últim era el que donava la lixiviació màxima dels metalls i per tant, permet estimar la fracció mòbil màxima de metall a llarg termini. Finalment es va establir una metodologia de laboratori per a la selecció de materials per la immobilització de metalls pesants en sòls contaminats (detallat en la secció 2.3). Sent els materials amb una elevada capacitat de neutralització àcida i/o capacitat de sorció específica els més prometedors els més adients en ésser addicionats per a la remediació de sòls contaminats amb metalls pesants. Aquesta metodologia es va aplicar per avaluar l’eficiència de l’addició dels materials en un estudi a escala de planta pilot (detallat en la secció 2.4), on es van corroborar els resultats obtinguts prèviament a escala de laboratori. / Metal pollution in soils requires intervention actions to attenuate its impact. In-situ remediation of contaminated soils is recently receiving increasing attention since it is a more feasible and economically affordable approach than ex-situ strategies, especially when facing a large amount of soil to be remediated. In this context, the addition of materials, including non-hazardous wastes to contaminated soils may be a suitable remediation strategy due to a double mechanism: decrease in pollutant mobility and dilution of pollutant concentration (if large material doses are used). Candidate materials must ensure an increase in the pollutant-soil interaction by increasing the pollutant sorption in the resulting mixture and/or by modifying soil properties governing the leaching and related transport of the pollutants into groundwaters and trophic chain. Moreover, another indirect benefit from this remediation strategy is that it may allow the reuse of non-hazardous wastes generated by industrial processes. In order to give response on this lack of research, the thesis has been divided in the following parts: Firstly, it has done a comparison of analytical methods, previously validated, to determine the total content of elements in inorganic samples of methods that directly analyze samples without digestion (XRF and µXRF) and methods based on a previous wet digestion (Aqua Regia and Microwaves) followed by quantification with ICP-OES and ICP-MS (detailed in section 2.1). The microwave digestion was the best method to determine the total content of major and trace elements in inorganic environmental matrices. Also, it has done an evaluation of lixiviation tests to predict the mobility of heavy metals in environmental samples using simple extraction, 0,01 M and 1M CaCl2, 0,43 M CH3COOH and 0,05 M EDTA and the lixiviation test Influence of pH on leaching with initial acid/base addition (pHstat) (detailed in section 2.2). The EDTA extraction yield of metals was higher than pHstat, at the same pH, but if we compare with the most acidic pH of pHstat, we observed that the metal lixiviation was maxim, so the pHstat can estimate the maximum mobile fraction of the metal in a long period. Finally, it has done the establishment of the laboratory methodology to select the materials to immobilize the heavy metals in contaminated soils (detailed in section 2.3). The best candidates were those with a high acid neutralization capacity and/or specific sorption capacity. This methodology was applied in order to evaluate the efficiency of the materials in a pilot plant study (detailed in section 2.4). The results obtained in a pilot plant corroborated the results obtained in a laboratory scale.

DE LA TESIS:El tema central de la presente memoria es la utilización del análisis químico en serie de elementos trazas en muestras de roca para delimitar las áreas de repartición y el estudio de las relaciones entre los distintos elementos en vistas a su aplicación en la prospección minera. Para ello se ha procedido a la recogida de muestras en el Macizo del Montseny, siguiendo la línea de investigación iniciada en su momento por mi compañero Manuel Viladevall con su estudio sobre la petrología y geología estructural del sector nororiental y la geoquímica de los granitoides del mismo macizo. La existencia de indicios minerales dispersos y de antiguas labores mineras ofrecían el aliciente de poder efectuar el estudio desde una doble perspectiva: prospección de nuevas zonas anómalas y retrospección de las anomalías producidas por indicios y mineralizaciones ya conocidas. También se ha abordado la problemática de los materiales políticos Cambro-ordovícicos que integran casi las tres cuartas partes del Montseny, en un intento de establecer las variaciones químicas de la serie que nos permitan una interpretación de su litología. Para la consecución de los objetivos propuestos ha sido necesaria la recogida de casi quinientas muestras a partir de una malla irregular, dadas las condiciones del terreno, que nos permitiesen cubrir suficientemente el área de estudio. También ha requerido nuestra atención la puesta a punto de las diversas técnicas analíticas, especialmente el análisis de mercurio debido a los extraordinariamente bajos contenidos de este elemento en las rocas. La realización de los correspondientes análisis, tanto de elementos mayores como de trazas, nos ha proporcionado un conjunto de datos para cuya interpretación ha sido necesaria la utilización de diversos procedimientos de representación automática y de análisis estadístico mediante ordenador.

El interés en identificar los factores ecológicos que afectan a la abundancia y bienestar de los animales ha tomado una creciente importancia debido a la necesidad de desarrollar planes de conservación efectivos para las especies amenazadas. Con respecto a los primates de bosques tropicales, estos temas son particularmente críticos debido a la rápida transformación antropogénica de su hábitat. El objetivo general de este trabajo fue evaluar si las poblaciones de mono aullador de manto (Alouatta palliata mexicana) en la zona de Los Tuxtlas (México) se ven negativamente afectadas por los efectos de la fragmentación de su hábitat, en particular por aquellos relacionados con el estrés, así como la posible influencia de tales efectos sobre la competencia intragrupo por el alimento y distintos aspectos de su reproducción. Con este propósito, desde febrero de 2004 a enero de 2005, medimos distintos parámetros fisiológicos (glucocorticoides fecales) y conductuales (dimensión fractal del comportamiento) de 3 grupos de aulladores, cada uno en un fragmento de selva con características socio-ecológicas distintas reflejo de un gradiente en la calidad de hábitat entre tales fragmentos. Los mayores niveles de glucocorticoides -tanto en machos como en hembras- encontrados en el grupo habitante del fragmento de peor calidad sugieren que una excesiva fragmentación del hábitat puede conducir a una elevación crónica en los niveles de estrés y desembocar en efectos a largo plazo sobre la viabilidad de los grupos de aulladores recluidos en fragmentos de selva. Además se registró un gradiente ascendente en los niveles de agonismo en contexto de alimentación conforme disminuyó la extensión y la calidad del fragmento de selva ocupado. El efecto combinado de una menor disponibilidad de alimento y un mayor grado de competencia por el mismo podría ser la causa del patrón de estrés descrito a partir de los parámetros hormonales y conductuales. Por otro lado, la fragmentación del hábitat parece estar afectando al éxito reproductivo del mono aullador de manto en la zona de estudio, no así sobre su capacidad reproductiva. Con todo, los resultados obtenidos en esta tesis sugieren que, superado un umbral de perturbación y fragmentación del hábitat, se puede alcanzar una situación crónica estresante y, por tanto, comprometer de forma efectiva la salud y las probabilidades de supervivencia a largo plazo de las poblaciones de mono aullador en libertad. Por ello, las estrategias de conservación de la subespecie estudiada de mono aullador de manto (Alouatta palliata mexicana) deberían enfocarse al mantenimiento de grandes parches de selva no alterada más que a la preservación de núcleos marginales de población. Además, estas medidas deberían aplicarse de modo inmediato dada la especial propensión de las poblaciones de esta subespecie a la alteración antropogénica de su hábitat. / The interest in identifying the ecological factors that influence animal abundance has taken on a new importance with the need to develop informed conservation plans for endangered and threatened species. With respect to forest-dwelling primates, these issues are critical because tropical forests are undergoing rapid anthropogenic transformation. The objective of this thesis was to evaluate whether the Mexican howler monkeys population at Los Tuxtlas (Mexico) are negatively influenced by habitat fragmentation effects, particularly by those associated with stress and their possible influence on feeding intra-group competition and reproduction. To this end, over the course of a year, we studied several physiological (glucocorticoid levels) and behavioural parameters (fractal dimension of behaviour) of three groups of howler monkeys inhabiting three forest fragments characterised by decreasing habitat quality. The major levels of glucocorticoids found in the group inhabiting the poor quality fragment, suggest that an extensive habitat fragmentation could led to chronic elevation of stress levels and, with that, affect the viability of howler monkeys groups confine into forest fragments. Moreover, we registered an ascendant gradient in agonism levels in feeding context as decreasing the area and quality of the occupied fragment. Therefore, the pattern in stress level registered could be due to a low food availability and high intra-group competition for these resources. On the other hand, habitat fragmentation seems to affect the reproductive successes of howler monkeys at study area, but not yet their reproductive capacity. In conclusion, results suggest that exceeded a threshold of habitat disturbance and fragmentation, it is possible to reach a chronic stress situation, and therefore, to jeopardize the health and the long-term survival probabilities of free howler monkeys. We suggest that conservation strategies of this subspecies must be managed to the maintenance of great and not disturbing forests fragment more than the preservation of marginal population groups, and it should be immediately applied since the special tendency to the habitat disturbance of this subspecies.

La peste porcina africana (PPA) es una enfermedad hemorrágica altamente infecciosa que afecta principalmente a cerdos domésticos, causando verdaderos estragos en la producción porcina en los países afectados. El agente causal de la enfermedad, el virus de la peste porcina africana (VPPA), es extremadamente complejo e infecta tanto a suidos salvajes como domésticos y a las garrapatas del género Ornithodoros. A día de hoy, no existe una vacuna eficaz contra el VPPA, por lo que su erradicación depende de un diagnóstico rápido de la enfermedad acompañado del sacrificio de los animales infectados y/o expuestos al virus. Asimismo, existe un gran desconocimiento tanto sobre los mecanismos de protección implicados frente al VPPA, como respecto a los antígenos del virus potencialmente protectores, lo que dificulta aún más el desarrollo de estrategias vacunales efectivas. Así pues, dos fueron los principales objetivos de este trabajo. Primero, el desarrollo de nuevas estrategias vacunales frente a la PPA, caracterizando tanto el grado de protección alcanzado como los mecanismos y antígenos implicados en la misma. Segundo, la propuesta de un modelo de protección homóloga con virus atenuado que permitiera profundizar en el conocimiento de los mecanismos implicados tanto en protección como en inmunopatogenia. Los principales logros alcanzados se pueden resumir en: i) la caracterización, por primera vez en el caso del VPPA, de dos epítopos T-CD8+ con capacidad protectora, ambos localizados en la hemaglutinia (HA) del virus; ii) la demostración del enorme potencial de la estrategia de inmunización con librerías de expresión (ELI) utilizada, diseñada expresamente para optimizar una respuesta T-CD8+ específica, revelando su utilidad tanto para obtener niveles de protección nunca antes alcanzados con vacunas DNA, como para caracterizar nuevos antígenos virales capaces de estimular una respuesta T-CD8+ protectora; y iii) la puesta a punto de un modelo de protección homóloga utilizando un virus atenuado que ha permitido ratificar la relevancia de la respuesta celular en protección, esclareciendo los mecanismos implicados tanto en protección como en la inmunopatogenia asociada a la infección con cepas de VPPA altamente virulentas. Estamos convencidos de que los avances obtenidos durante esta Tesis Doctoral facilitarán el diseño más racional de futuras vacunas frente a la PPA. / African swine fever (ASF) is a fatal highly-infectious hemorrhagic disease which affects domestic and European wild pigs, albeit African wild boars and ticks from genus Ornithodoros can also be unapparently infected. ASF has a devastating effect on porcine production causing major economic impacts on the affected countries. The causal agent of the disease, African swine fever virus (ASFV), is an extremely complex virus and, unfortunately, against which there is no effective vaccine available. Consequently, ASF-eradication relies on its rapid diagnostic and the culling of the infected and/or exposed pigs. Little is known about both the mechanisms of protection and the potentially protective ASFV-viral antigens. Therefore, developing an efficient vaccine against ASFV is a must. The present study had two main objectives. On one hand, to develop new vaccine strategies against ASF, characterizing both the degree of protection achieved and the mechanisms and antigens involved in such protection. And, on the other hand, the proposal of an attenuated viral strain as the ideal model to deeply characterize the mechanisms implicated in homologous protection and for comparative immunopathogenesis studies. The main findings obtained can be summarized as follows: i) the characterization, for the first time in the case of ASFV, of two CD8+-protective epitopes, located in the viral hemagglutinin (HA); ii) the statement of the huge potential of an expression library immunization (ELI) as a vaccine strategy when designed to optimize a CD8+-specific response, such strategy has allowed us to obtain the highest levels of protection achieved using DNA-vaccines and to characterize new protective CD8+-antigenic determinants within the ASFV genome; and iii) the optimization of an animal model to characterize the mechanism involved in homologous protection based on the immunization with an attenuated viral strain, which has allowed us to ratify the relevance of the Tcell-response in the achieved protection, elucidating the specific mechanisms implicated in both the protection afforded by attenuated virus and the immunopathogenesis associated with the infection with highly pathogenic ASFV strains. We are convinced that the results obtained during the present Ph.D. Thesis will facilitate the design of more rational vaccines against ASF in the future.

La història natural de "Sciurus vulgaris" a l'àrea de distribució d'Europa occidental és coneguda en la zona nòrdicacentral (70º N - 50º N), però és gairebé desconeguda en el terç meridional (50° N - 37' N), tot i que té una importància notable en els ecosistemes forestals. Les publicacions o notes científiques sobre l'esquirol a la península Ibèrica fins a l'actualitat són escasses i tracten sobre temes molt concrets. A la vista d'aquest nivell de coneixements, tenia interès iniciar el present estudi per conèixer: I) La història natural de l'espècie en el límit meridional de la seva àrea de distribució d'Europa occidental (hàbitat mediterrani) en els aspectes següents: variacions estacionals del pes corporal i del cicle reproductor, dinàmica poblacional (densitat, ratio de sexes i estructura d'edats), comportament espacial, ús, selecció i ubicació dels nius i activitat mensual i anyal, en relació a l'abundància d'aliment, l'índex de depredació i el grau d'aïllament de l'hàbitat. II) Comparar les variables citades en relació a les que presenten les poblacions d'Europa central que resideixen en hàbitats amb menor predictibilitat d'aliment (d'alt poder energètic) en el temps i amb variables meteorològiques més extremes. Es va escollir un hàbitat amb abundància d'aliment que permetia fer un disseny d'estudi natural que serviria per confirmar les estratègies adaptatives dels rosegadors descrites en experiments puntuals en relació a la disponibilitat d'aliment. La present tesi s'ha estructurat en dues parts (inclouen 62 figures i 82 taules): I) Part primera. Consta d'una introducció general i material i mètodes generals. II) Part segona. Consta de set capítols (0-6) i cadascun d'ells té introducció, material i mètodes, resultats, discussió (el Cap. 0 també té conclusions) i sumari. Les taules i figures que acompanyen cada capítol tenen numeració pròpia. L'estudi s'ha realitzat en dues àrees no explotades forestalment: dos hàbitats mediterranis litorals madurs, situats a la serra de Collserola (prov. Barcelona, nord-est d'Espanya) que forma part del sistema Litoral amb una alçada màxima de 512 m (s.n.m.) (distant 7 km de la costa sense tenir en compte l'orografia del terreny) i que està delimitada pel tram final dels cursos dels rius Llobregat al sud i Besòs al nord.

La distribució sang-teixit, la permeabilitat en pell i la toxicitat en organismes aquàtics són exemples de propietats de biopartició de compostos químics. Són fonamentals en àmbits tan diversos com el desenvolupament de nous fàrmacs o cosmètics o l’avaluació del impacte mediambiental de contaminants emergents. No obstant, la seva determinació directa sol ser costosa, llarga, experimentalment complicada i inclús èticament qüestionable. Com a conseqüència, existeix un gran interès en poder estimar de manera senzilla propietats de biopartició de compostos químics. Concretament, els sistemes cromatogràfics ofereixen alternatives pràctiques i sostenibles, ja que les mesures cromatogràfiques són econòmiques, ràpides i simples. En aquest context, l’objectiu de la tesi doctoral ha estat estudiar l’emulació de processos biològics de partició a partir de sistemes cromatogràfics. Inicialment, s’han caracteritzat diversos sistemes de cromatografia electrocinètica micel•lar (MEKC) mitjançant el model de paràmetres de solvatació. Aquest model permet descriure tant processos biològics com fisicoquímics basats en la distribució de soluts neutres entre dues fases, de manera que ofereix també un marc comú per comparar ambdós tipus de processos. A la tesi, s’han caracteritzat mescles dels tensioactius colat i deoxicolat de sodi i també el tensioactiu pur taurocolat de sodi. S’ha estudiat la influència que té la composició de tensioactius sobre les caracteritzacions i també l’efecte del conjunt de soluts, els descriptors i el pH aquós. Les caracteritzacions obtingudes s’han afegit a la recopilació que s’ha fet tant de sistemes biològics com fisicoquímics (majoritàriament cromatogràfics, però també de partició aigua-solvent) que es troben descrits a la literatura segons aquest model. Cada parell de sistemes biològic i fisicoquímic s’ha comparat mitjançant un paràmetre de distància que permet avaluar la similitud entre parelles de sistemes. No obstant, de cara a identificar quins sistemes cromatogràfics tenen capacitat per modelar processos de biopartició, ha calgut desenvolupar una metodologia complementària per quantificar la precisió que s’obtindrà a les correlacions entre dades biològiques i cromatogràfiques. La metodologia desenvolupada consisteix en examinar les tres fonts d’error que determinen la variància total d’aquestes correlacions: la variància de les dades biològiques, la variància de les dades cromatogràfiques i la variància que prové de la dissimilitud entre els dos sistemes comparats. S’ha demostrat que les tres contribucions de variància es poden predir fàcilment a partir de la caracterització dels sistemes segons el model de paràmetres de solvatació. La seva suma permet estimar la variància total que s’espera obtenir a la correlació i, per tant, la bondat amb què el sistema cromatogràfic podrà emular el biològic. Aquesta metodologia ha permès seleccionar sistemes cromatogràfics adequats per modelar tres processos de biopartició concrets: la toxicitat en el peix fathead minnow, la sorció sòl-aigua i la permeabilitat en pell de substàncies neutres. Els sistemes cromatogràfics escollits han estat: tres sistemes de cromatografia de líquids d’alta resolució (HPLC), dos d’ells basats en columnes C18 convencionals i un d’ells en una columna artificial immobilitzada (IAM) que imita l’estructura de les biomembranes; dos sistemes de MEKC, un amb dodecilsulfat de sodi i l’altre amb taurocolat de sodi. També s’ha seleccionat el sistema de partició octanol-aigua perquè és el clàssic sistema de referència a l’hora de modelar processos biològics. S’ha comprovat experimentalment la bondat dels sistemes escollits per modelar els tres processos de biopartició estudiats, obtenint en tots els casos resultats concordants amb les prediccions de variància. Per tal d’emular la permeabilitat en pell ha calgut introduir el volum del solut com a variable addicional a les correlacions biologico-cromatogràfiques. Finalment, els millors models de correlació han permès predir amb precisió valors de sorció sòl-aigua d’herbicides i dades permeabilitat en pell d’herbicides i hormones a partir de mesures cromatogràfiques. S’ha obtingut una millor precisió que la que proporcionen altres mètodes com les particions octanolaigua o mètodes de càlcul a partir de l’estructura dels soluts, el que demostra el potencial dels sistemes cromatogràfics per estimar propietats de biopartició. / Experimental determination of biopartitioning properties, including toxicological and environmental ones, usually involves very expensive, time-consuming and difficult procedures, even ethically questionable. As a consequence, estimation methods from simple measurements are very valuable. In this sense, chromatographic systems can provide practical and sustainable alternatives because chromatographic measurements are economic, fast and easy. The present thesis has focused on studying the emulation of biopartitioning processes by chromatographic systems. Several micellar electrokinetic chromatography (MEKC) systems have been initially characterized by the solvation parameter model. Their characterizations have been included in a compilation made from literature of numerous biological and physicochemical (mostly chromatographic) systems already characterized by this model, which allows the comparison of the systems. A new methodology has been developed in order to identify which chromatographic systems can model biopartitioning processes. It is based on the estimation of the overall variance expected for the biological-chromatographic systems’ correlations, which is contribution of three factors: the variance of the biological data, the variance of the chromatographic data and the variance attributed to the dissimilarity between the two compared systems. According to this methodology, the most promising chromatographic systems, besides the reference octanol-water partition system, have been selected to test their performances in the emulation of three biopartitioning processes: the toxicity to the fathead minnow fish, the soil-water sorption and the human skin permeability of neutral compounds. The chromatographic systems that have been chosen and experimentally tested are: three systems of high-performance liquid chromatography (HPLC), two of them based on conventional C18 columns and one of them based on an immobilized artificial membrane (IAM) column; two MEKC systems of sodium dodecylsulfate on one hand and sodium taurocholate on the other hand. It has been shown that in all cases the experimental results agree with the predictions of variance. For the modeling of human skin permeation, a correction using the volume of the solutes has been required to obtain good correlations. The best correlation models have been successfully applied to the prediction of soil-water sorption and human skin permeation values of several herbicides and hormones. Last but not least, it has been shown that the precision achieved with this method is better than the one obtained by other approaches (e.g. octanol-water partition measurements or calculation from structure).

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica (IRB) / The present doctoral thesis has been devoted to the development of a new synthetic strategy to obtain a new member of the thiopeptide, or thiazolyl peptide, family of antibiotics. This new member, baringolin, was isolated and characterized by the Spanish pharmaceutical company Instituto Biomar S.A. Although a structure was proposed, no stereochemical information was provided. Thus, this thesis has several objectives; first, a novel modular and straightforward strategy must be developed to achieve its total synthesis, but also to facilitate the preparation of analogues. The achievement of the total synthesis of baringolin should serve as the final confirmation of its structure and stereochemistry. The strategy developed herein is based in cross-coupling reactions and required the preparation of suitable building blocks and optimization of the required methodology. Moreover, L –series amino acids were chosen as the sole source of chirality to be introduced in the molecule, which is presumably synthesized in the ribosome of the producing bacteria. Once the synthetic methodology was set up and building blocks were ready, condensation of all fragments and final steps gave rise to synthetic baringolin, which was identical to its natural counterpart, confrming its structure and stereochemistry. Comparison of both products was made by spectroscopic methods and biological function assessment. Given the successful outcome of our synthetic plan, a small library of analogues was designed. Two different moieties of the molecule were modified: the thiazoline ring and the peptidic tail. As a result of minimum inhibitory concentration of Gram positive bacteria growth assessment of the library, different conclusions could be drawn from the results thus obtained. First, thiazoline was shown to be crucial to keep a broad activity profile against many strains; its substitution for a more rigid thiazole ring resulted in loss of activity towards most strains, while potency was only maintained against S. aureus. On the other hand, shortening of the peptidic tail had almost no effect in either activity or potency. Substitution of the peptidic tail with a cyclohexanoic acid moiety in the thiazole series resulted in recovery of activity against all strains and a potency increase against most of them. The good results obtained are good evidence of the efficiency of the synthetic strategy developed during this thesis and demonstrate that chemical synthesis is a useful tool for both structure determination and structure-activity relationship studies. / En la presente tesis doctoral se ha llevado a cabo el desarrollo de una nueva estrategia sintética para la obtención de un nuevo miembro de la familia de antibióticos conocida como tiopéptidos, o tiazolil péptidos. Este nuevo miembro, la baringolina, fue aislado y caracterizado por la empresa farmacéutica española Biomar S.A., la cual no elucidó la estereoquímica del compuesto. Así, el propósito inicial de esta tesis es múltiple; por un lado se pretende desarrollar una estrategia que permita su obtención de forma directa y modular, facilitando la futura síntesis de análogos; por otro lado, la obtención de la baringolina sintética debe ofrecer una confirmación definitiva de su estructura y su estereoquímica. La estrategia desarrollada se basó en reacciones de acoplamiento cruzado, lo cual requería la preparación de los fragmentos necesarios y la optimización de la metodología a utilizar. Además, se escogió utilizar amino ácidos de la serie L como única fuente de quiralidad en la molécula, la cual presumiblemente está formada a partir de estos, dado el origen ribosomal de los tiopéptidos. Con la metodología puesta a punto y los fragmentos correspondientes preparados, se pudo llevar a cabo su ensamblaje, dando lugar a la baringolina sintética, la cual resultó ser idéntica a la natural, confirmándose así su estructura y estereoquímica. Dado el éxito de la síntesis total, se procedió a la síntesis de una pequeña librería de análogos, en la cual se modificaron dos zonas diferentes de la molécula, el anillo de tiazolina y la cola peptídica. Como resultado de la evaluación de la capacidad de inhibición de cultivos de bacterios Gram positivo, se extrajeron diversas conclusiones relativas a las relaciones estructura-actividad de las partes modificadas. En primer lugar, la tiazolina demostró ser necesaria para mantener un amplio espectro de actividad frente a diversas cepas, ya que su substitución por un anillo de tiazol, más rígido, prácticamente solo mantuvo el mismo nivel de potencia frente a S.aureus. Por otro lado, el papel de la cola peptídica resultó ser limitado, ya que su acortamiento no causó grandes diferencias de actividad y potencia. Por último, se substituyó la cola por un grupo de ácido ciclohexanoico en la versión que poseía un anillo de tiazol en lugar de tiazolina, lo cual resultó en el restablecimiento de la actividad frente a todas las cepas y un aumento de potencia frente a la mayoría de estas.

Tesi realitzada a la Unitat de Química Combinatòria - Parc Científic de Barcelona / Para frenar la creciente resistencia del Plasmodium, el parásito causante de la malaria, se necesitan nuevos fármacos con modos de acción diferentes a los de los fármacos actualmente existentes. Esta tesis se centra en el estudio de las enzimas aminoacil-tRNA sintetasas (ARS) como potenciales dianas terapéuticas. El objetivo principal es el de diseñar y sintetizar distintas quimiotecas de compuestos que actúen como inhibidores específicos y selectivos de las enzimas ARS del Plasmodium falciparum para el tratamiento de la malaria. Las enzimas ARS son las responsables de la síntesis proteica mediante la traducción de la información genética contenida en el ARN mensajero (ARNm). Además, son muy específicas, esenciales y conservadas. Cada especie contiene como mínimo 20 ARS distintas, una por cada aminoácido. Desde un punto de vista teórico, las ARS son potenciales dianas terapéuticas para el tratamiento de la malaria por cuanto: a) son esenciales, pues su inhibición conlleva la inviabilidad celular y muerte del parásito; b) son enzimas altamente expresadas durante el ciclo asexual intraeritrocítico que tiene lugar en el huésped; y c) aunque no se conoce su estructura de rayos-X, son estructuralmente viables para diseñar modelos homólogos. Además, las ARS son dianas terapéuticas validadas, ya que se ha demostrado que existen compuestos, en su mayoría antibióticos y antifúngicos, capaces de inhibir su funcionalidad. Todas las ARS del P. falciparum tienen su enzima homóloga humana. No obstante, existen diferencias filogenéticas que otorgan cierta divergencia estructural a las enzimas, por lo que podrían ser inhibidas selectivamente, como podría ser el caso de las ARS apicolásticas del parásito. El apicoplasto es un orgánulo presente en casi todos los apicomplejos, éste, tiene carácter bacteriano, está evolutivamente bien conservado y fue descubierto hace relativamente poco, por lo que se desconocen muchas de sus funcionalidades. Sin embargo, se trata de un orgánulo que contiene información genética y es esencial para la supervivencia del parásito. Para diseñar los posibles inhibidores de ARS del P. falciparum, se ha contado con información biológica a nivel molecular y celular del parásito proporcionada por los distintos grupos de investigación que forman parte del proyecto Mephitis, así como por la realización de varios ensayos biológicos de los compuestos sintetizados para determinar su actividad antimalárica y su capacidad de inhibir las funcionalidades del apicoplasto del parásito. Durante el transcurso de esta investigación, se han sintetizado cuatro familias de compuestos; - Miméticos del intermedio Lisil-ARNt sintetasas. Mediante síntesis en fase sólida y en solución se sintetizaron compuestos basados en el complejo intermedio Lisil-adenilato. Se demostró mediante ensayos in vitro que dos de ellos fueron capaces de inhibir selectivamente la Lisil-ARNt sintetasa del apicoplasto sin alterar la funcionalidad de la enzima homóloga humana. - Ligandos múltiples basados en los beta-aminoácidos cispentacina e icofungipen. Los beta-aminoácidos cispentacina e icofungipen están descritos como inhibidores de la Proy la Ile-ARNt sintetasa de C. albicans respectivamente. La idea inicial fue sintetizar ligandos múltiples uniendo los farmocóforos antes citados, mediante un aminoácido, formando tripéptidos. Al no obtener resultados satisfactorios en los ensayos in vitro frente a P. falciparum de los di- y tri-péptidos formados con la cispentacina, se abandonó la síntesis del icofungipen. - Derivados del benzimidazol Se decidió crear una quimioteca de derivados del benzimidazol como posibles compuestos duales, es decir que inhibieran más de una enzima ARS. Los compuestos se sintetizaron a partir de distintas o-fenilendiaminas substituidas, distintos aminoácidos utilizados como espaciadores y distintos ácidos carboxílicos que dieron diversidad a la quimioteca. Aunque no se pudo evaluar el modo de acción ni la diana de dichos compuestos, se obtuvieron seis derivados del benzimidazol con actividad antimalárica in vitro (IC50 menor de 40 milimicras) pero no in vivo. - gamma-péptidos derivados de la prolina A partir de un péptido patrón sintetizado previamente en nuestro laboratorio, formado con cadenas laterales indólica que mimetiza al triptófano, se sintetizó en fase sólida una quimioteca de derivados de aquél. Seis de los gamma-péptidos mostraron actividad antimalárica in vitro (IC50; 1.3-3.6 milimicras). No se pudo determinar el modo de acción de dichos compuestos. / The resistance of malaria parasites to available drugs continues to grow, which makes the need for new antimalarial therapies pressing. The main goal of this research is the design and synthesis of new specific and selective inhibitors of the aminoacyl-tRNA synthetases (ARSs) of Plasmodium falciparum. Aminoacyl-tRNA synthetases (ARSs) are essential and conserved enzymes that catalyze the esterification of a specific amino-acid to its cognate transfer RNA (tRNA). Despite the fact that every species has a set of ARSs, there are some differences among them that can becurcial in the sense of selectivity. One example is the apicoplast, an organelle present in almost all the apicomplexan parasites that derived from a secondary endosymbiosis of cyanobacteria. Although the main role of this organelle is unknown, it is essential for the parasite’s survival. The apicoplastic ARSs differed substantially from the mammalian homologues enzymes. Even more, the ARSs are well-established antimicrobial drug targets. For all these reasons, ARSs represent an interesting new target for antimalarial drug discovery. During the research, we collaborated with different teams of scientists in Mephities consortium. They gave us the biological and molecular information needed for the design of potentially antimalarial compounds. With the aim of inhibiting different ARSs of P. falciparum, we synthesized four different libraries of compounds based on: 1) mimetic of Lys-ARSs intermediated; 2) beta-amino acids derivatives; 3) benzimidazole derivatives and 4) some gamma-peptides derived from L-Proline. We demonstrated that some compounds are active in vitro against P. falciparum at a millimicrons range. And, what is more, we confirmed that two of them had inhibited the apicoplastic Lys- ARS of P. falciparum. Some compounds were assayed in vivo but none of them cured the disease.

Les pàgines 69 a 72 han estat retirades seguint instruccions de l’autora de la tesi, en existir participació d’empreses, existir conveni de confidencialitat o existeix la possibilitat de generar patents / Las págínas 69 a 72 han sido retiradas siguiendo instrucciones de la autora, al existir participación de empresas, convenio de confidencialidad o la posibilidad de generar patentes / Pages from 69 to 72 have been withdrawn on the instructions of the author, as there is participation of undertakings, confidentiality agreement or the ability to generate patent / Els alquilbenzens lineals són els precursors per a la fabricació dels alquilbenzens lineals sulfonats, un dels principals surfactants aniònics per a usos domèstics i industrials. Aquest producte és una barreja de diversos homòlegs i isòmers, composats per una part alifàtica i una part aromàtica, que presenten una molt baixa solubilitat en aigua. Els LABs s’han detectat en aigües i sediments en nombrosos estudis. La present tesi doctoral ofereix la valoració de l’estat d’un aqüífer contaminat per LABs i l’avaluació de diverses estratègies de remediació; alhora que estudia les comunitats microbianes implicades en les diverses estratègies de bioremediació i es fa una comparació entre diverses tècniques emprades per la caracterització de les poblacions microbianes. S’ha avaluat la biodegradabilitat dels LABs per part de consorcis degradadors obtinguts prèviament al grup de recerca, comparant-la amb la biodegradabilitat per part de la microbiota autòctona amb diverses estratègies de bioestimulació; obtenint molt bons resultats emprant la microbiota autòctona. En segon lloc, s’ha avaluat la biodegradabilitat d’aquests compostos sota diverses condicions redox, per tal de mimetitzar les condicions variables de l’emplaçament. S’ha comparat la degradació dels LABs en condicions aeròbies, desnitrificants i seqüencials aeròbies- desnitrificants per part de la població autòctona, obtenint degradacions relativament ràpides en tots els casos. Les poblacions microbianes implicades en cadascun dels casos s’han caracteritzat, tant mitjançant mètodes de fingerprinting (DGGE) com per piroseqüenciació i quantificant les poblacions i gens relacionats amb la degradació. D’altra banda, s’ha estudiat la possibilitat d’acoblar les tecnologies d’oxidació química i bioremediació per intentar obtenir degradacions més ràpides; emprant permanganat de potassi i reacció de Fenton modificada. Els resultats obtinguts no aconsegueixen millorar la degradació obtinguda amb la bioremediació sola. S’ha avaluat també l’afectació de les poblacions microbianes per l’aplicació dels oxidants químics, tant en assajos de tipus batch com emprant columnes de sòl, un mètode més aproximat a la situació real in situ. L’avaluació de la degradació en columnes de sòl ha mostrat també la diferència entre l’ús de batch i aquestes, requerint temps d’actuació molt més llargs. Les poblacions microbianes implicades en cadascun dels casos s’han descrit mitjançant DGGE i quantificant les poblacions i gens relacionats amb la degradació. Per últim, s’ha comparat els resultats obtinguts en la caracterització de les poblacions microbianes in situ emprant diversos mètodes, tant relacionats amb la microbiologia clàssica com tècniques moleculars. Les tècniques valorades han estat l’aïllament de microorganismes, tècniques de fingerprinting (DGGE), l’enriquiment de poblacions microbianes actives in situ (emprant les perles BioSep) seguida de DGGE i tècniques de seqüenciació massiva (piroseqüenciació). Aquesta comparació ha demostrat que els resultats obtinguts depenen fortament de la tècnica emprada, i que no existeix una tecnologia idònia per a la caracterització de les poblacions microbianes, sinó que s’ha te tenir en compte els avantatges i limitacions de cadascuna de les tècniques. L’opció recomanada és emprar diverses tecnologies combinant els resultats de cadascuna d’elles per tenir una idea global de la presència i composició de les comunitats microbianes. Mitjançant aquesta combinació de tecnologies, s’ha descrit la microbiota autòctona de l’aqüífer en condicions normals i en presència de la contaminació. A més, s’ha identificat diversos phya i gèneres relacionats amb la presència o absència dels contaminants, servint així com a indicadors de la presència de contaminants o de l’ocurrència de processos de degradació. / Linear alkyl benzenes (LABs) are used to manufacture alkyl benzene sulphonates, one of the most widely used anionic surfactants in domestic and industrial applications. An industrial site near Barcelona (Spain) whose groundwater was polluted following the rupture of an old storage tank was examined. The purpose of the present thesis is to assess the present state of the aquifer and evaluate diverse remediation strategies. In addition, microbial populations characterization was performed, as well as a comparison between several techniques used for this characterization. The biodegradability of LABs using a hydrocarbon-degrading consortium and using the autochthonous microbiota has been assessed using diverse biostimulation strategies; obtaining high levels of degradation by using the indigenous microbiota. Also, the ability of the autochthonous microbiota to degrade LABs under aerobic, denitrifying and sequential aerobic-denitrifying conditions was tested, obtaining promising results. In all cases, the quantification of functional genes related to alkane and aromatic biodegradation pathways was assessed. Additionally, in order to increase the degradation rates in vitro chemical oxidation assays were performed, coupled to bio stimulation. Potassium permanganate and a modified Fenton reaction were tested. In addition the capability of subsequent natural attenuation after chemical oxidation and the changes on the product bioavailability were also assessed. The results showed that chemical oxidation did not increase the degradation compared to biostimulation. To determine the effect of the oxidant on autochthonous microbiota the microbial populations were characterized. The evaluation of biodegradation and chemical oxidation was also performed in soil columns, evaluating the affectation of microbial populations using this method, more similar to the real in situ conditions than the batch experiments. Finally, the results obtained in the in situ microbial communities characterizations by means of diverse techniques were compared. The considered techniques were isolation, fingerprinting techniques (DGGE), enrichment of active microbial populations in situ (using BioSep beads, spiked or not with LABs) and further DGGE; and new generation sequencing tools (pyrosequencing). This comparison has shown the strong effect of the used technique in the microbial population characterization. Phyla and genera related with the presence of pollutant and the occurrence of biodegradation have been identified.

1. Introduction TomB/YmoB family of proteins was proposed as antitoxins of Hha/YmoA family of proteins. Toxin antitoxin (TA) systems are involved in the regulation of biofilm in bacteria, among other functions. Hha-TomB proteins were related with the regulation of biofilm formation and dispersion. This PhD thesis was focused on solving the 3D structure of a member of TomB/YmoB family of proteins using Nuclear Magnetic Resonance (NMR), on the realization of functional studies of TomB/YmoB proteins and on the study the oxidation and oligomerization process that seems to control the biological function of the TomB/YmoB family of proteins. 2. Optimization of NMR sample parameters to elucidate the 3D structure of a member of TomB family of proteins by NMR Compared to other spectroscopic techniques NMR is a relatively insensitive method. To determine the structure of proteins multidimensional experiments require long acquisition times and protein concentrations at the millimolar (mM) range. Optimization of the protein constructs to achieve the required solubility and stability to obtain good quality NMR spectra was the first, non-trivial step for 3D protein structure elucidation. The final conditions of the NMR sample to obtain the 3D-structure of a member from TomB family of proteins were: H6-YmoB-C117S at 1.4mM, pH=7.00 buffered with 20mM [NaH2PO4 + Na2HPO4], 150mM NaCl, 1mM TCEP, 0.1mM EDTA and 0.1% NaN3. 3. Functional studies of TomB family of proteins Understanding the different mechanisms of biofilm regulation and in particular clarifying the biological activity of TomB family of proteins as antitoxins of Hha in biofilms becomes of primary interest. In order to validate the YmoB constructs used, we also determined the effect of YmoB and [C117S] YmoB in the well-studied biofilm system formed by E. coli. We concluded that; Hha-TomB proteins form a toxin-antitoxin system with Hha the toxin and TomB the antitoxin, in planktonic cells as well as in biofilms, and we also demonstrated that the biological activity of TomB proteins is always related to Hha. We showed that TomB and YmoB are functionally interchangeable in planktonic cells and in biofilms, demonstrating that this TA module is functional in enteric bacteria and we confirmed that the C117S YmoB mutant, our optimal construct for NMR studies, is a biologically active antitoxin of Hha in E. coli planktonic and biofilm systems. 4. 3D Structure determination of [C117S] YmoB by NMR We obtained a high resolution structure, in which the 20 lowest energy models present an average pairwise RMSD under 1.5Å for the heavy atoms of residues forming α-helices. [C117S] YmoB structure consists in a four helix bundle. The protein is mainly negatively charged, but present two positives patches. 5. Oxidation and oligomerization of YmoB: a structure-driven hypothesis for YmoB function We observed that YmoB and TomB are labile proteins. Both formed oligomers involving cysteine oxidation. A mutant of YmoB containing a single cysteine residue was relatively stable but even this construct required a special fast NMR data acquisition protocol to determine its three dimensional structure, suggesting that this construct still undergoing slow modifications. The remaining Cys18 and its immediate environment are conserved between YmoB and TomB and C18 is buried in the hydrophobic core of [C117S] YmoB. We hypothesized that this cysteine may be functionally relevant and we investigated the reactivity of this residue and the oligomerization of YmoB. On the basis of the results obtained at least three possibilities exists as to the identity of the active antitoxin: a) the reduced YmoB monomer, b) YmoB dimers (or higher oligomers) and c) YmoB monomer with C18 oxidized as sulphenic acid. Further experiments will be necessary to determine which YmoB identity is the active antitoxin, to elucidate the mechanism of action of TomB/YmoB proteins as antitoxins and to define the exact role of C18 and its capacity to be oxidized into sulphenic acid and thiosulphinate in biofilm regulation. / 1. Introducció Seguint els treballs previs realitzats al laboratori del professor Miquel Pons, aquest projecte s’ha focalitzat en els estudis funcionals i estructurals de la proteïna YmoB. Aquesta proteïna de Yersinia spp. Comparteix una elevada homologia de seqüència amb la proteïna TomB de Escherichia coli. Homòlegs de la família de proteïnes TomB/YmoB estan presents en els bacteris entèrics sense que existeixi homologia de seqüència obvia amb altres famílies de proteïnes ni que es conegui l’estructura tridimensional de cap d’elles. Així doncs, aquesta tesi doctoral s’ha focalitzat en la obtenció de l’estructura tridimensional mitjançant Ressonància Magnètica Nuclear (RMN) de la proteïna YmoB, en la realització d’estudis funcionals de les proteïnes TomB/YmoB i la valdació funcional de la construcció utilitzada en els experiments de RMN y finalment en l’estudi dels processos d’oxidació cisteínica i oligomeritzacio que semblen regir la funcionalitat biològica de la família de proteïnes TomB/YmoB. 2. Resum dels resultats obtinguts Els principals resultats obtinguts en aquesta tesi doctoral són: 1. Obtenció d’una mostra óptima per a la realització dels experiments de RMN; mutant [C117S] YmoB a 1.4mM, 20mM de [Na2HPO4 + NaH2PO4], 150mM NaCl, 0.2mM EDTA, 1mM TCEP, 0.01% NaN3, pH=7.00. 2. Demostració de la funció com a Toxina-Antitoxina del parell Hha-TomB, sent Hha la toxina i TomB l’antitoxina, en cèl•lules E. Coli planctòniques i en biofilms. Complementació en E. Coli de la funció com a antitoxina de TomB per part de Ymo i de [C117S] YmoB en cèl•lules planctòniques i en biofilms. 3. Resolució de l’estructura tridimensional de la construcció [C117S] YmoB. La proteïna forma un feix de quatre hèlix i la seva superfície electrostàtica es majoritàriament negativa, mostrant dues àrees ben definides amb càrrega positiva. 4. Identificació de tres possibles espècies de YmoB com a forma activa d’antitoxina; YmoB en la seva forma monomèrica reduïda, dímers (o formes oligomèriques majors) de YmoB y YmoB amb la cisteïna 18 oxidada en forma d’àcid sulfènic.