Retinal ganglion cells (RGCs) undergo continued maturation after birth. RGC development can be influenced by light, but for most RGCs this requires the development of functional retinal circuits that occurs up to 2 weeks after birth. A subpopulation of RGCs express melanopsin (MRGCs) making them intrinsically photosensitive at birth. I hypothesized that this intrinsic photosensitivity could affect the morphology of MRGCs during the postnatal (PN) developmental period (PN 3 to adult). I took advantage of the Clomeleon-expressing transgenic mouse line that, combined with melanopsin immunohistochemistry, allowed for the systematic identification of the M2 MRGC at different PN periods. The pattern of development of the M2 MRGC, characterized through the analysis of 6 morphological parameters, was similar to that described for other types of RGCs. Thus, despite being intrinsically photosensitive, M2 MRGCs did not show substantial developmental differences from other RGC types

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Os relógios biológicos são fundamentais para a sincronização do comportamento dos organismos a mudanças no fotoperíodo. Todas as alterações rítmicas são determinantes para a sobrevivência da espécie uma vez que elas prevêem que os ajustes internos coincidam com a fase mais propícia do ciclo ambiental, permitindo aos organismos a capacidade de sincronizar esses eventos internos com os ciclos ambientais. Muitos desses ritmos biológicos são claramente associados ao ciclo claro-escuro, sendo este ciclo de grande importância para as espécies que possuem algum tipo de pigmento fotossensível. Os melanóforos de Xenopus laevis são fotossensíveis, respondendo à luz com dispersão dos grânulos de melanina, devido à presença de duas melanopsinas, Opn4x e Opn4m. As células pigmentares dos vertebrados heterotérmicos respondem com migração pigmentar a uma variedade de agentes, incluindo as endotelinas. Em peixes teleósteos, ETs induzem a agregação pigmentar em melanóforos, enquanto que em anfíbios, ET-3 induz a dispersão de grânulos de pigmentos em melanóforos de Xenopus laevis e de Rana catesbeiana, através da ativação de receptores ETc. Propusemos determinar o padrão temporal de expressão dos genes das melanopsinas e do receptor ETc em melanóforos dérmicos de X. laevis em cultura, bem como os efeitos temporais e dose- dependentes da endotelina sobre essa expressão. Demonstramos, através de ensaios de PCR quantitativo, que o tratamento de 12C:12E , somado a uma troca de meio, assim como o de endotelina-3 10-9 e 10-8M em escuro constante, foi capaz de sincronizar a expressão de Opn4x e Opn4m. Entretanto, o receptor ETc parece não ser sincronizado pelo ciclo claro-escuro, ou pelo tratamento hormonal. Dependendo da dose utilizada e do ZT analisado, ET-3 pode promover um aumento ou inibição da expressão gênica de Opn4x, Opn4m e ETc, indicando uma modulação de forma dose-dependente. Além disso, pode atuar como um agente sincronizador da expressão dos transcritos das melanopsinas. / The biological clocks are critical for synchronizing the behavior of organisms to changes in photoperiod. All rhythmic changes are crucial to the survival of the species since they provide for internal adjustments to coincide with the phase of the cycle most favorable. Many of these biological rhythms are clearly associated with the light-dark cycle, of major importance for species that have some type of photosensitive pigment. Melanophores of Xenopus laevis are photosensitive, responding to light with dispersion of melanin granules, due to the presence of two melanopsins, Opn4x and Opn4m. The pigment cells of ectothermic vertebrates respond with pigment migration to a variety of agents including the endothelins. In teleost fish, ETs induce pigment aggregation in melanophores, whereas in amphibians, ET-3 induces the dispersion of pigment granules in melanophores of Xenopus laevis and Rana catesbeiana, by activation of ETc. We proposed to determine the temporal pattern of gene expression of the ETc receptor and melanopsins in dermal melanophores of X. laevis in culture as well as the effects of endothelin-3 on the temporal expression of the 3 genes. Using quantitative PCR, we demonstrated that 12L: 12D regimen, combined with medium changes, as well as the treatment with 10-9 and 10-8M endothelin-3, was able to synchronize the expression of Opn4x and Opn4m. However, ETc receptor seems not to be synchronized by light-dark cycle, or hormone treatment. Depending on the dose and the ZT, ET-3 may promote an increase or inhibition of gene expression of Opn4x, Opn4m and ETc, indicating a dose-dependent modulatory effect. In addition, endothelin-3 may also act as a synchronizing agent of the melanopsins transcripts.

Muitos vertebrados ectotérmicos ajustam suas cores corporais para serem confundidos com o ambiente, através da migração de pigmentos no interior de cromatóforos, regulada por sistemas neurais e/ou hormonais. Essas mudanças de coloração auxiliam no mimetismo, termorregulação, comunicação social e expressão de comportamentos como excitação sexual, agressividade e medo. Entretanto, cromatóforos de inúmeras espécies respondem diretamente à luz. Estudos sobre a resposta à luz nos melanóforos de Xenopus laevis levaram à descoberta do fotopigmento melanopsina, uma opsina que está presente na retina de todos os grupos de vertebrados, inclusive no homem. Vários hormônios podem regular o processo de mudança de cor nos vertebrados, dentre eles a melatonina, hormônio secretado pela glândula pineal. Este é o principal órgão responsável pela integração do sistema neuroendócrino dos vertebrados ao meio ambiente, traduzindo direta ou indiretamente a informação do fotoperíodo em sinal hormonal, coordenando assim os ritmos fisiológicos circadianos com o meio ambiente. Os objetivos deste trabalho foram: investigar se a expressão gênica das melanopsinas e do receptor de melatonina em melanóforos de Xenopus laevis apresenta variação temporal sob diferentes condições luminosas; verificar se a expressão gênica das melanopsinas e do receptor de melatonina em melanóforos de Xenopus laevis pode ser modulada por melatonina. Dados do trabalho demonstram que as melanopsinas em melanóforos de Xenopus laevis são sincronizadas aos ciclos de claro-escuro, expressando um robusto ritmo ultradiano com período de 16h para Opn4m e um ritmo circadiano com período de 25h para Opn4x. Curiosamente, essa ritmicidade só foi observada quando os melanóforos foram mantidos em ciclos 12C:12E e foram submetidos à troca de meio durante a fase clara do fotoperíodo. A constância na expressão gênica do receptor de melatonina Mel1, quer sob diferentes regimes de luz, quer sob tratamento por melatonina, sugere que esse gene é extremamente estável, não sofrendo alterações ao ser submetido a estímulos exógenos, podendo ser considerado um gene constitutivo. O tratamento com melatonina por 6h na fase clara do fotoperíodo, além de inibir drasticamente a expressão de Opn4x e Opn4m, aboliu a ritimicidade de ambas as melanopsinas. Nossos resultados indicam que os melanóforos de Xenopus laevis possuem um relógio funcional e podem ser caracterizados como relógios periféricos, porém necessitam do ciclo claro-escuro associado à troca de meio para exibirem sua sincronização. / Many ectothermic vertebrates adjust their body color to mimic the environment, through the pigment migration within chromatophores, regulated by neural and / or hormonal systems. These changes in color help in camouflage, thermoregulation, social communication and behaviors such as sexual arousal, agressiveness and fear. However, chromatophores of several species respond directly to light. Studies about light response in melanophores of Xenopus laevis have led to the discovery of the photopigment melanopsin, an opsin that is present in the retina of all vertebrate groups, including man. Various hormones may regulate the process of color change in vertebrates, among them melatonin, hormone secreted by the pineal gland. This is the main organ responsible for the integration of the neuroendocrine system of vertebrates to the environment, translating directly or indirectly the photoperiod information into hormonal signal, thus coordinating physiological circadian rhythms with the environment. The objectives of this work were: to investigate whether the gene expression of melanopsins and melatonin receptor in melanophores of Xenopus laevis exhibited temporal variation under different light conditions; to verify whether gene expression of melanopsins and melatonin receptor in melanophores of Xenopus laevis could be modulated by melatonin. Our data show that melanopsins in melanophores of Xenopus laevis are synchronized to light-dark cycles, expressing a robust ultradian rhythm with a period of 16h for Opn4m and circadian rhythm with a period of 25h for Opn4x. Interestingly, the rhythm was only observed when the melanophores were maintained in 12L: 12D regime and medium change was performed during the fotophase of photoperiod. The constancy in the expression of melatonin receptor Mel1c, either under different light regimes, or under treatment by melatonin, suggesting that this gene is extremely stable, not being altered by exogenous stimulus, and may be considered a constitutive gene. Treatment with melatonin for 6h during the fotophase of the photoperiod, drastically inhibit the expression of Opn4x and Opn4m, and abolished the rhythm of both melanopsins. Our results indicate that melanophores of Xenopus laevis possess a functional clock and can be characterized as peripheral clocks, but they need the light-dark cycle associated with change of medium to exhibit their synchronization.

A melanopsina foi descoberta em 1998 por Ignacio Provencio e colaboradores em melanóforos de Xenopus leavis. Desde sua descoberta, esse fotopigmento surgiu como um possível candidato a intermediar os fenômenos de sincronização nos vertebrados. Nos mamíferos, a melanopsina é encontrada num pequeno subgrupo de células ganglionares da retina, conhecido como células ganglionares retinianas intrinsecamente fotossensíveis (ipRGCs) e o seu papel como fotopigmento responsável pela percepção luminosa, que leva à sincronização das espécies dessa classe aos ciclos de claro e escuro, já foi estabelecido. A melanopsina está presente na retina de todas as classes de vertebrados estudadas até o momento, mas, em contraposição a essa afirmação, a sua estrutura tem maior semelhança com opsina de invertebrados do que com opsina de vertebrados, sugerindo que sua fototransdução ocorra através da via dos fosfoinositídeos. Essa hipótese foi confirmada por diversos trabalhos na literatura e estudos posteriores demonstraram que, em vertebrados não mamíferos, a melanopsina é codificada por dois genes: um ortólogo ao de mamíferos, Opn4m, e um ortólogo ao de X. leavis, Opn4x, levantando diversas questões a respeito da funcionalidade dessa opsina. Nosso grupo vem estudando esse fotopigmento nos tecidos periféricos de vertebrados desde 2001, sendo que foi pioneiro em demonstrar, em melanóforos de Xenopus laevis, que a dispersão dos grânulos de melanina se dá através da fotoativação da melanopsina que desencadeia a cascata de fosfoinositídeos. E estudos mais recentes vêm colocando a melanopsina como um dos possíveis fotopigmentos responsáveis pela sincronização de relógios periféricos em organismos como peixes e anfíbios. Nesse sentido, a linhagem de células ZEM-2S do peixe teleósteo Danio rerio é um ótimo modelo para o estudo das vias de fototransdução em relógios periféricos. Já foi demonstrado que essa linhagem de células é responsiva a estímulos luminosos, exibindo uma proliferação diferencial frente a diferentes regimes de claro e escuro, e ativando a expressão de genes de relógio como clock, per1 e cry1b, que conhecidamente são responsáveis por sincronizar os ritmos biológicos ao fotoperíodo ambiental. Nossos experimentos de imunocitoquímica detectaram a presença das duas proteínas codificadas pelos genes opn4m-1 e opn4m-2 da melanopsina, e mostraram uma significativa diferença na distribuição das proteínas Opn4m-1 e Opn4m-2. Análises de PCR quantitativo mostraram que um pulso de luz azul de 10 min é capaz de alterar a expressão dos genes de relógio per1b, per2, cry1a e cry1b, e que essa alteração ocorre através da via dos fosfoinositídeos em células embrionárias ZEM-2S de Danio rerio. Em adição mostramos que para promover a alteração dos genes de relógio, a via dos fosfoinositídeos interage com outras vias de sinalização como a via do óxido nítrico (NO) e a via das proteína quinases ativadas por mitógenos (MAPKs). Esses dados sugerem que a melanopsina seja um dos principais candidatos a intermediar os processos de sincronização nessas células, pois a somatória dos resultados de detecção da melanopsina, estimulação dentro de seu espectro de absorção e ativação da via dos fosfoinositídeos, a coloca a frente de outras opsinas como vertebrate ancient opsin (Va-opsin) e teleost multiple tissue opsin (Tmt-opsin) e de outros candidatos como Crys fotossensíveis e mecanismos de estresse oxidativo. No curso deste trabalho também conseguimos definir metodologias eficientes de transfecção de RNA de interferência e de DNA plasmidial em células ZEM-2S de D. rerio, que são ferramentas fundamentais nos estudos de expressão gênica nesse modelo / Melanopsin was discovered in 1998 by Ignacio Provencio and colleagues in Xenopus leavis melanophores. Since its discovery, this photopigment has emerged as a possible candidate to mediate synchronization in vertebrates. In mammals the melanopsin is found in a subset of retinal ganglion cells, known as intrinsically photosensitive retinal ganglion cells (ipRGCs) and their role as the photopigment responsible for photoentrainment in mammals has already been established. Melanopsin is present in the retina of all vertebrate classes studied to date, nevertheless, its structure is more similar to invertebrate than to vertebrates opsins, suggesting that their phototransduction pathway occurs through the phosphoinositide pathway. This hypothesis has been confirmed by several studies in the literature. Later studies showed that melanopsin is encoded by two genes in non-mammalian vertebrates, Opn4m orthologous to mammalian and Opn4x orthologous to X. leavis, raising new questions about the functionality of this opsin. Our group has studied this photopigment in vertebrate peripheral tissues since 2001 and, in Xenopus laevis melanophores, we demonstrated that pigment granule dispersion occurs through photoactivation of melanopsin and triggering of phosphoinositide pathway. More recent studies have put melanopsin as a possible photoreceptor responsible for peripheral clocks entrainment in organisms like fish and amphibians. In this context, the ZEM-2S cell line of the teleost fish Danio rerio is a good model to study the mechanism of phototransduction in peripheral clocks. It has been previously demonstrated that this cell line is responsive to light stimuli, exhibiting a differential proliferation when submitted to different light/dark regimes and activating the expression of clock genes such as clock, per1 and cry1b, known to synchronize the biological rhythms to environmental photoperiod. Our immunocytochemistry experiments detected the presence of two proteins encoded by the melanopsin genes opn4m-1 and opn4m-2, and showed a significant difference in the distribution of proteins Opn4m-1 Opn4m-2. Quantitative PCR analyses showed that a 10-min blue light pulse is able to change the expression of the clock genes per1b, per2, cry1b and cry1a, and that this change occurred through the phosphoinositide cascade in embryonic ZEM-2S cells of D. rerio. In addition we showed that, to promote the change in clock gene expression, the phosphoinositide pathway interacts with other signaling pathways such as the nitric oxide (NO) and the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways. These data suggest that melanopsin is a major candidate to mediate the photoentrainment in these cells, because taken together, the detection of melanopsin, stimulation within its absorption spectrum and activation of the phosphoinositide cascade, puts it ahead of other opsins, as the vertebrate ancient opsin (Va-opsin) and teleost multiple tissue opsin (Tmt-opsin), and other candidates, as photosensitive Crys and mechanisms of oxidative stress. In the course of this work, we could also define efficient methods for transfection of interference RNA and plasmidial DNA in ZEM-2S cells of D. rerio, which are fundamental tools in studies of gene expression in this model

The daily variation in background light intensity (irradiance) can entrain the endogenous clock in the suprachiasmatic nucleus (SCN) to the external environment. The only source of this photic information in mammals is the eye, which is primarily a visual organ. It is therefore highly specialised to detect high frequency spatiotemporal modulations. This together with the adaptation which occurs within the retina could be present difficulties when encoding global irradiance. This raises the question of whether spatial patterns, which are present in our everyday viewing, might affect the ability of the SCN to receive 'true irradiance' signals and entrain to the external environment. My first approach was to determine whether individual SCN cells might receive a 'true irradiance' signal. To this end I mapped and characterised the receptive field properties of SCN neurons using in vivo electrophysiology. Indeed a handful of neurons (full field cells) responded to light anywhere in the visual scene and thus may act as 'irradiance detectors'. However, the vast majority of cells only sampled local radiance from a limited area of the visual scene. Having mapped the receptive field properties it became clear that cells which sampled from a limited area of the visual scene would be sensitive to spatial contrast (patterns). To examine the effect of spatiotemporal contrast on the SCN I examined two SCN outputs: locomotor activity and neuronal firing rates. Although spatiotemporal modulation in light intensity could induce large amplitude oscillations in neuronal activity; the time averaged firing rate and locomotor activity, which are believed to be determined by irradiance, were largely unaffected by spatial patterns. This led to the conclusion that the SCN can multiplex photic information into information regarding irradiance, and spatial information by encoding them under different timescales. Melanopsin has been heralded as the key photopigment for encoding irradiance and entraining the SCN. However such experiments have been only performed using diffuse light stimuli. Here I investigated the role of melanopsin under natural viewing conditions which incorporated spatial patterns. Under such stimuli the SCN response can be almost entirely accounted for by the melanopic irradiance of the stimuli.

In the mammalian retina, a small population of retinal ganglion cells are intrinsically photosensitive due to the expression of the photopigment melanopsin. These intrinsically photosensitive retinal ganglion cells (ipRGCs) integrate their own intrinsic light response with that of rod and cone photoreceptors to drive a variety of physiological and behavioural responses to light. Recently, however, a subset of these cells have been shown to project to the dorsal Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the visual thalamus, where they directly contribute to visual perception. In the case of retinal degenerations (the most common being retinitis pigmentosa which affects up to 1:2000 people worldwide), the death of the rod and cone photoreceptors results in complete visual blindness with no available treatment. At least some ipRGCs survive retinal degeneration and can continue signalling light information to the dLGN, suggesting that these cells could support some form of visual perception. However, to-date little is known about this projection during retinal degeneration. Thus, characterising its anatomy and physiology is key to determining the quality of visual information that is conveyed to the dLGN during retinal degeneration and what prevents these cells supporting behaviourally relevant vision. A subset of ipRGCs target the dLGN and continue signalling light information even at advanced stages of retinal degeneration. However, it is unknown whether all ipRGC subtypes survive following the death of rod and cone photoreceptors, and whether they retain normal dendritic architecture following reorganisation of the remnant neural retina. We set out to answer these questions using the multi-colour labelling technique Brainbow. In doing so, we design and describe a unique methodology and toolset, based on Principal Component Analysis (PCA), to analyse 3-Dimensional (3D) multi-colour images. We then demonstrate its utility by identifying, isolating and reconstructing the 3D morphology of individual ipRGCs from a population of labelled cells in the degenerate retina and quantitatively characterise their dendritic architecture. The results indicate that all known ipRGC subtypes are resilient to the effects of outer photoreceptor degeneration. Melanopsin responses in the dLGN have been shown to support global brightness perception in mice with advanced retinal degeneration. However, to-date, it is unknown whether these cells can encode spatial information. Using in-vitro and in-vivo electrophysiological recordings from mice in advanced stages of retinal degeneration, we demonstrate for the first time that ipRGCs in the retina, and their target neurones in the dLGN, possess discrete spatial receptive fields. These receptive fields are large and lack a centre-surround organisation. The retinotopic organisation of these cells' projections would suggest they could support spatial vision. However the poor temporal resolution of the deafferented melanopsin response is the most significant limitation precluding melanopsin signalling from supporting behaviourally relevant vision under naturalistic viewing conditions. Considering these temporal limitations, we finally investigated if melanopsin could contribute to visual perception at earlier stages of degeneration which is more representative of clinical conditions in humans. Here, vision can rely on both the intrinsic melanopsin-driven light response and residual cone function. Using silent substitution in combination with in-vivo electrophysiological recordings from the dLGN of mice in early-stage degeneration, we identify a number of cone-driven responses which could support normal visual function. However, we were unable to detect a significant and robust contribution of melanopsin signalling to these residual light-responses using our silent substitution stimuli in both retinally degenerate and wildtype mice at these age. However, we did find a significant contribution to the Olivary Pretectal Nucleus (OPN) of visually intact mice at equivalent ages, and to the adult dLGN. Supported by anatomical data, this suggests that there is a specific temporal delay in the maturation of ipRGCs which project to the dLGN during development of the visual system.

Muitos vertebrados ectotérmicos ajustam suas cores corporais para serem confundidos com o ambiente, através da migração de pigmentos no interior de cromatóforos, regulada por sistemas neurais e/ou hormonais. Essas mudanças de coloração auxiliam no mimetismo, termorregulação, comunicação social e expressão de comportamentos como excitação sexual, agressividade e medo. Entretanto, cromatóforos de inúmeras espécies respondem diretamente à luz. Estudos sobre a resposta à luz nos melanóforos de Xenopus laevis levaram à descoberta do fotopigmento melanopsina, uma opsina que está presente na retina de todos os grupos de vertebrados, inclusive no homem. Vários hormônios podem regular o processo de mudança de cor nos vertebrados, dentre eles a melatonina, hormônio secretado pela glândula pineal. Este é o principal órgão responsável pela integração do sistema neuroendócrino dos vertebrados ao meio ambiente, traduzindo direta ou indiretamente a informação do fotoperíodo em sinal hormonal, coordenando assim os ritmos fisiológicos circadianos com o meio ambiente. Os objetivos deste trabalho foram: investigar se a expressão gênica das melanopsinas e do receptor de melatonina em melanóforos de Xenopus laevis apresenta variação temporal sob diferentes condições luminosas; verificar se a expressão gênica das melanopsinas e do receptor de melatonina em melanóforos de Xenopus laevis pode ser modulada por melatonina. Dados do trabalho demonstram que as melanopsinas em melanóforos de Xenopus laevis são sincronizadas aos ciclos de claro-escuro, expressando um robusto ritmo ultradiano com período de 16h para Opn4m e um ritmo circadiano com período de 25h para Opn4x. Curiosamente, essa ritmicidade só foi observada quando os melanóforos foram mantidos em ciclos 12C:12E e foram submetidos à troca de meio durante a fase clara do fotoperíodo. A constância na expressão gênica do receptor de melatonina Mel1, quer sob diferentes regimes de luz, quer sob tratamento por melatonina, sugere que esse gene é extremamente estável, não sofrendo alterações ao ser submetido a estímulos exógenos, podendo ser considerado um gene constitutivo. O tratamento com melatonina por 6h na fase clara do fotoperíodo, além de inibir drasticamente a expressão de Opn4x e Opn4m, aboliu a ritimicidade de ambas as melanopsinas. Nossos resultados indicam que os melanóforos de Xenopus laevis possuem um relógio funcional e podem ser caracterizados como relógios periféricos, porém necessitam do ciclo claro-escuro associado à troca de meio para exibirem sua sincronização. / Many ectothermic vertebrates adjust their body color to mimic the environment, through the pigment migration within chromatophores, regulated by neural and / or hormonal systems. These changes in color help in camouflage, thermoregulation, social communication and behaviors such as sexual arousal, agressiveness and fear. However, chromatophores of several species respond directly to light. Studies about light response in melanophores of Xenopus laevis have led to the discovery of the photopigment melanopsin, an opsin that is present in the retina of all vertebrate groups, including man. Various hormones may regulate the process of color change in vertebrates, among them melatonin, hormone secreted by the pineal gland. This is the main organ responsible for the integration of the neuroendocrine system of vertebrates to the environment, translating directly or indirectly the photoperiod information into hormonal signal, thus coordinating physiological circadian rhythms with the environment. The objectives of this work were: to investigate whether the gene expression of melanopsins and melatonin receptor in melanophores of Xenopus laevis exhibited temporal variation under different light conditions; to verify whether gene expression of melanopsins and melatonin receptor in melanophores of Xenopus laevis could be modulated by melatonin. Our data show that melanopsins in melanophores of Xenopus laevis are synchronized to light-dark cycles, expressing a robust ultradian rhythm with a period of 16h for Opn4m and circadian rhythm with a period of 25h for Opn4x. Interestingly, the rhythm was only observed when the melanophores were maintained in 12L: 12D regime and medium change was performed during the fotophase of photoperiod. The constancy in the expression of melatonin receptor Mel1c, either under different light regimes, or under treatment by melatonin, suggesting that this gene is extremely stable, not being altered by exogenous stimulus, and may be considered a constitutive gene. Treatment with melatonin for 6h during the fotophase of the photoperiod, drastically inhibit the expression of Opn4x and Opn4m, and abolished the rhythm of both melanopsins. Our results indicate that melanophores of Xenopus laevis possess a functional clock and can be characterized as peripheral clocks, but they need the light-dark cycle associated with change of medium to exhibit their synchronization.

A melanopsina foi descoberta em 1998 por Ignacio Provencio e colaboradores em melanóforos de Xenopus leavis. Desde sua descoberta, esse fotopigmento surgiu como um possível candidato a intermediar os fenômenos de sincronização nos vertebrados. Nos mamíferos, a melanopsina é encontrada num pequeno subgrupo de células ganglionares da retina, conhecido como células ganglionares retinianas intrinsecamente fotossensíveis (ipRGCs) e o seu papel como fotopigmento responsável pela percepção luminosa, que leva à sincronização das espécies dessa classe aos ciclos de claro e escuro, já foi estabelecido. A melanopsina está presente na retina de todas as classes de vertebrados estudadas até o momento, mas, em contraposição a essa afirmação, a sua estrutura tem maior semelhança com opsina de invertebrados do que com opsina de vertebrados, sugerindo que sua fototransdução ocorra através da via dos fosfoinositídeos. Essa hipótese foi confirmada por diversos trabalhos na literatura e estudos posteriores demonstraram que, em vertebrados não mamíferos, a melanopsina é codificada por dois genes: um ortólogo ao de mamíferos, Opn4m, e um ortólogo ao de X. leavis, Opn4x, levantando diversas questões a respeito da funcionalidade dessa opsina. Nosso grupo vem estudando esse fotopigmento nos tecidos periféricos de vertebrados desde 2001, sendo que foi pioneiro em demonstrar, em melanóforos de Xenopus laevis, que a dispersão dos grânulos de melanina se dá através da fotoativação da melanopsina que desencadeia a cascata de fosfoinositídeos. E estudos mais recentes vêm colocando a melanopsina como um dos possíveis fotopigmentos responsáveis pela sincronização de relógios periféricos em organismos como peixes e anfíbios. Nesse sentido, a linhagem de células ZEM-2S do peixe teleósteo Danio rerio é um ótimo modelo para o estudo das vias de fototransdução em relógios periféricos. Já foi demonstrado que essa linhagem de células é responsiva a estímulos luminosos, exibindo uma proliferação diferencial frente a diferentes regimes de claro e escuro, e ativando a expressão de genes de relógio como clock, per1 e cry1b, que conhecidamente são responsáveis por sincronizar os ritmos biológicos ao fotoperíodo ambiental. Nossos experimentos de imunocitoquímica detectaram a presença das duas proteínas codificadas pelos genes opn4m-1 e opn4m-2 da melanopsina, e mostraram uma significativa diferença na distribuição das proteínas Opn4m-1 e Opn4m-2. Análises de PCR quantitativo mostraram que um pulso de luz azul de 10 min é capaz de alterar a expressão dos genes de relógio per1b, per2, cry1a e cry1b, e que essa alteração ocorre através da via dos fosfoinositídeos em células embrionárias ZEM-2S de Danio rerio. Em adição mostramos que para promover a alteração dos genes de relógio, a via dos fosfoinositídeos interage com outras vias de sinalização como a via do óxido nítrico (NO) e a via das proteína quinases ativadas por mitógenos (MAPKs). Esses dados sugerem que a melanopsina seja um dos principais candidatos a intermediar os processos de sincronização nessas células, pois a somatória dos resultados de detecção da melanopsina, estimulação dentro de seu espectro de absorção e ativação da via dos fosfoinositídeos, a coloca a frente de outras opsinas como vertebrate ancient opsin (Va-opsin) e teleost multiple tissue opsin (Tmt-opsin) e de outros candidatos como Crys fotossensíveis e mecanismos de estresse oxidativo. No curso deste trabalho também conseguimos definir metodologias eficientes de transfecção de RNA de interferência e de DNA plasmidial em células ZEM-2S de D. rerio, que são ferramentas fundamentais nos estudos de expressão gênica nesse modelo / Melanopsin was discovered in 1998 by Ignacio Provencio and colleagues in Xenopus leavis melanophores. Since its discovery, this photopigment has emerged as a possible candidate to mediate synchronization in vertebrates. In mammals the melanopsin is found in a subset of retinal ganglion cells, known as intrinsically photosensitive retinal ganglion cells (ipRGCs) and their role as the photopigment responsible for photoentrainment in mammals has already been established. Melanopsin is present in the retina of all vertebrate classes studied to date, nevertheless, its structure is more similar to invertebrate than to vertebrates opsins, suggesting that their phototransduction pathway occurs through the phosphoinositide pathway. This hypothesis has been confirmed by several studies in the literature. Later studies showed that melanopsin is encoded by two genes in non-mammalian vertebrates, Opn4m orthologous to mammalian and Opn4x orthologous to X. leavis, raising new questions about the functionality of this opsin. Our group has studied this photopigment in vertebrate peripheral tissues since 2001 and, in Xenopus laevis melanophores, we demonstrated that pigment granule dispersion occurs through photoactivation of melanopsin and triggering of phosphoinositide pathway. More recent studies have put melanopsin as a possible photoreceptor responsible for peripheral clocks entrainment in organisms like fish and amphibians. In this context, the ZEM-2S cell line of the teleost fish Danio rerio is a good model to study the mechanism of phototransduction in peripheral clocks. It has been previously demonstrated that this cell line is responsive to light stimuli, exhibiting a differential proliferation when submitted to different light/dark regimes and activating the expression of clock genes such as clock, per1 and cry1b, known to synchronize the biological rhythms to environmental photoperiod. Our immunocytochemistry experiments detected the presence of two proteins encoded by the melanopsin genes opn4m-1 and opn4m-2, and showed a significant difference in the distribution of proteins Opn4m-1 Opn4m-2. Quantitative PCR analyses showed that a 10-min blue light pulse is able to change the expression of the clock genes per1b, per2, cry1b and cry1a, and that this change occurred through the phosphoinositide cascade in embryonic ZEM-2S cells of D. rerio. In addition we showed that, to promote the change in clock gene expression, the phosphoinositide pathway interacts with other signaling pathways such as the nitric oxide (NO) and the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways. These data suggest that melanopsin is a major candidate to mediate the photoentrainment in these cells, because taken together, the detection of melanopsin, stimulation within its absorption spectrum and activation of the phosphoinositide cascade, puts it ahead of other opsins, as the vertebrate ancient opsin (Va-opsin) and teleost multiple tissue opsin (Tmt-opsin), and other candidates, as photosensitive Crys and mechanisms of oxidative stress. In the course of this work, we could also define efficient methods for transfection of interference RNA and plasmidial DNA in ZEM-2S cells of D. rerio, which are fundamental tools in studies of gene expression in this model

Os relógios biológicos são fundamentais para a sincronização do comportamento dos organismos a mudanças no fotoperíodo. Todas as alterações rítmicas são determinantes para a sobrevivência da espécie uma vez que elas prevêem que os ajustes internos coincidam com a fase mais propícia do ciclo ambiental, permitindo aos organismos a capacidade de sincronizar esses eventos internos com os ciclos ambientais. Muitos desses ritmos biológicos são claramente associados ao ciclo claro-escuro, sendo este ciclo de grande importância para as espécies que possuem algum tipo de pigmento fotossensível. Os melanóforos de Xenopus laevis são fotossensíveis, respondendo à luz com dispersão dos grânulos de melanina, devido à presença de duas melanopsinas, Opn4x e Opn4m. As células pigmentares dos vertebrados heterotérmicos respondem com migração pigmentar a uma variedade de agentes, incluindo as endotelinas. Em peixes teleósteos, ETs induzem a agregação pigmentar em melanóforos, enquanto que em anfíbios, ET-3 induz a dispersão de grânulos de pigmentos em melanóforos de Xenopus laevis e de Rana catesbeiana, através da ativação de receptores ETc. Propusemos determinar o padrão temporal de expressão dos genes das melanopsinas e do receptor ETc em melanóforos dérmicos de X. laevis em cultura, bem como os efeitos temporais e dose- dependentes da endotelina sobre essa expressão. Demonstramos, através de ensaios de PCR quantitativo, que o tratamento de 12C:12E , somado a uma troca de meio, assim como o de endotelina-3 10-9 e 10-8M em escuro constante, foi capaz de sincronizar a expressão de Opn4x e Opn4m. Entretanto, o receptor ETc parece não ser sincronizado pelo ciclo claro-escuro, ou pelo tratamento hormonal. Dependendo da dose utilizada e do ZT analisado, ET-3 pode promover um aumento ou inibição da expressão gênica de Opn4x, Opn4m e ETc, indicando uma modulação de forma dose-dependente. Além disso, pode atuar como um agente sincronizador da expressão dos transcritos das melanopsinas. / The biological clocks are critical for synchronizing the behavior of organisms to changes in photoperiod. All rhythmic changes are crucial to the survival of the species since they provide for internal adjustments to coincide with the phase of the cycle most favorable. Many of these biological rhythms are clearly associated with the light-dark cycle, of major importance for species that have some type of photosensitive pigment. Melanophores of Xenopus laevis are photosensitive, responding to light with dispersion of melanin granules, due to the presence of two melanopsins, Opn4x and Opn4m. The pigment cells of ectothermic vertebrates respond with pigment migration to a variety of agents including the endothelins. In teleost fish, ETs induce pigment aggregation in melanophores, whereas in amphibians, ET-3 induces the dispersion of pigment granules in melanophores of Xenopus laevis and Rana catesbeiana, by activation of ETc. We proposed to determine the temporal pattern of gene expression of the ETc receptor and melanopsins in dermal melanophores of X. laevis in culture as well as the effects of endothelin-3 on the temporal expression of the 3 genes. Using quantitative PCR, we demonstrated that 12L: 12D regimen, combined with medium changes, as well as the treatment with 10-9 and 10-8M endothelin-3, was able to synchronize the expression of Opn4x and Opn4m. However, ETc receptor seems not to be synchronized by light-dark cycle, or hormone treatment. Depending on the dose and the ZT, ET-3 may promote an increase or inhibition of gene expression of Opn4x, Opn4m and ETc, indicating a dose-dependent modulatory effect. In addition, endothelin-3 may also act as a synchronizing agent of the melanopsins transcripts.