The primary goal of this project is to develop an experimental setup for testing membrane materials. The membranes tested are all porous, hydrophilic and non- selective. The secondary goal is that the module finds use as an educational tool for learning about diffusion on a university level. The final setup consisted of two modified 250 ml polyethylene bottles with a wide neck joined together with a flange pinning the test object in between. In the experiments one side is loaded with a sodium chloride solution, while the other is loaded with pure deionized water. The conductivity change is then monitored in the chamber loaded with deionized water using a conductivity probe. Two test subjects are tested, an alpha Cellulose filter and a polycarbonate membrane. The mass transfer coefficient are determined to be 8.99*10-6 ± 3.90*10-6 [cm/min] and 3.62*10-5 ± 1.49*10-6 [cm/min] respectively. The large inconsistencies in the alpha cellulose filters results in large standard deviations, whereas the polycarbonate is very consistent and therefore have very small error bars. Meaning that the largest error in this design originates from inconsistencies between samples of the test subject. The setup is suitable as an educational tool due to short run times of one hour, the generated data only requires simple linear regression to extract mass transfer coefficients from the slope. The experiment can be varied further by adjusting temperature and stirring. / Det primära målet med det här projektet är att utveckla en experimentell uppställning för att testa membran. Alla testade membran är porösa, hydrofila och icke-selektiva. Det sekundära målet är att uppställningen kan användas som ett pedagogiskt verktyg för kurser i masstransport. Den slutliga uppställningen består av två modifierade 250 ml polyeten flaskor med vid hals, ihopsatta med en fläns som håller testobjektet på plats emellan flaskorna. I experimenten fylls en av kamrarna med saltlösning och den andra med avjoniserat vatten, konduktiviteten mäts i kammaren som laddas med avjoniserat vatten. Två objekt testades, ett alfacellulosa filter och ett polykarbonat membran. Massöverförings koefficienter bestämdes till 8.99*10-6 ± 3.90*10-6 [cm/min] för alfacellulosa filtret och 3.62*10-5 ± 1.49*10-6 [cm/min] för polykarbonat membranet. Det finns stora variationer i alfacellulosa materialet vilket leder till stora standardavvikelse i körningarna på alfacellulosa filtret, medan polykarbonat membranen var identiska och därmed har väldigt små felstaplar. Därmed kunde det fastslås att stora avvikelser nästan bara beror på variationer i testobjektet. Uppställningen lämpar sig för undervisning eftersom körningstiden är kort (1 timme) och massöverföringskoefficienten kan tas fram med linjär regression. Experimentet kan bland annat varieras genom att ändra temperatur och omrörning.

<p> Polyurea microcapsules are micron-scale, hollow polymer spheres commonly used in agriculture to encapsulate pesticides for controlled diffusive release onto target crops. Diffusion of these active materials through a protective polymer wall offers a safer and more effective method of delivery compared to the direct spraying of crops with toxicants. The approach we are taking to control the release rate is to coat pre-formed porous polyurea capsules with a separate release-controlling outer layer. This allows us to separately optimize the load-bearing capsule wall and the release control layer, an approach commonly used in other membrane diffusion systems.</p> <p> Montmorillonite clay incorporation into polymer matrices can reduce membrane permeability by forcing diffusants to take a tortuous path around the stacked silicate sheets. Effective formation of clay-polyurea composites requires the delamination of clay particles into thin sheets with high aspect ratios, and their incorporation into polyurea microcapsules either during interfacial polymerization, or post-polymerization. The net negative surface charge of the silicate sheets should facilitate their initial binding to the cationic polyurea surfaces, as well as subsequent binding of polycations to the clay-coated polyurea capsules to create layer-by-layer (LbL) capsule assemblies with decreasing release rates of internal materials.</p> <p> The main focus of this project is to gain a fundamental understanding of montmorillonite clay and polyurea microcapsules, and the development of a model polyurea composite capsule for release rate analysis. Emphasis will be placed on the reduced permeability of microcapsules coated with clay by LbL assembly post-polymerization, followed by an exploration of further layering with polycations.</p> / Thesis / Master of Science (MSc)

Les récepteurs du glutamate de type AMPA (rAMPA) sont les acteurs principaux de la transmission synaptique excitatrice rapide. Leur abondance au niveau de la densité postsynaptique est essentielle pour l'établissement et le maintien de la fonction synaptique, et est le résultat d'un trafic hautement dynamique. De nombreuses études ont permis de caractériser les mécanismes de diffusion membranaire impliqués dans l’adressage des rAMPA jusqu’à la synapse. Le rôle majeur des protéines auxiliaires des rAMPA dans la modulation de cette étape de trafic a été démontré. Par ailleurs, il est suggéré que la localisation synaptique des rAMPA est aussi régulée lors des phases plus précoces du trafic intracellulaire, c’est-à-dire de l'appareil de Golgi vers la membrane plasmique via les vésicules post-Golgiennes. Cependant le trafic vésiculaire post-Golgien des rAMPA n'a jamais été visualisé et reste donc encore très mal compris. En collaboration avec l'équipe de Guus Smit (Amsterdam), j’ai participé à la caractérisation d’une nouvelle protéine auxiliaire des rAMPA, appelée Shisa6. Dans le cadre de ce projet, j’ai pu étudier le rôle de cette protéine sur la diffusion membranaire des rAMPA en utilisant une technique de suivi de particule unique (Quantum dot) développée au laboratoire. Mon projet de thèse principal a consisté à étudier le trafic vésiculaire post-Golgien des rAMPA par le développement d’une nouvelle méthode d’étude. En effet, l'échec dans la visualisation dynamique du trafic vésiculaire des récepteurs pourrait être expliqué par un faible rapport signal/bruit, conséquence d'une faible concentration vésiculaire en rAMPA combinée à un bruit de fond important dû aux marquages provenant du réticulum endoplasmique (RE) et de la membrane plasmique. Dans le but de surpasser cette difficulté, nous avons mis au point un outil ingénieux (système ARIAD) afin de bloquer les rAMPA dans le RE et contrôler, par l'ajout d'un ligand, leur sécrétion du RE jusqu'à la membrane plasmique. Grâce à cet outil, nous avons non seulement augmenté considérablement la concentration des rAMPA dans les vésicules post-Golgiennes, mais aussi éliminé le bruit de fond membranaire. Par la technique de FRAP nous avons pu éliminer le bruit de fond provenant du RE. Une telle approche, combinée à des techniques d'imagerie sur neurones vivants, nous a permis de visualiser pour la première fois le trafic vésiculaire post-Golgien des rAMPA et de l’étudier. / AMPA-type glutamate receptors (AMPAR) are the main actors of the fast excitatory synaptic transmission. Their abundance at the postsynaptic density is essential for the establishment and maintenance of synaptic function, and is the result of a highly dynamic trafficking. Many studies have characterized the membrane diffusion mechanisms involved in the AMPAR synaptic localization, and revealed the critical role of the AMPAR auxiliary proteins in the modulation of this trafficking. Furthermore, it is suggested that AMPAR synaptic localization is also regulated during the early steps of the intracellular trafficking, from the Golgi apparatus to the plasma membrane via the post-Golgi vesicles. However, the post-Golgi vesicular trafficking of AMPAR has never been visualized and therefore remains poorly understood. In collaboration with the Guus Smit team (Amsterdam), I participated in the caracterization of a novel AMPAR auxiliary protein called Shisa6. As part of this project, I studied the role of this protein on the AMPAR membrane diffusion, using a method of single particle tracking (Quantum dot) developed in the laboratory. My main thesis project was to study the post-Golgi vesicular trafficking of AMPAR through the development of a new experimental protocol. Indeed, the failure in the dynamic visualization of the receptor vesicular trafficking could be explained by a low signal/noise ratio resulting of a poor AMPAR vesicular concentration, combined with a high background noise due to receptors localized both in the endoplasmic reticulum (ER) and at the plasma membrane. In order to overcome this difficulty, we have used an ingenious tool (ARIAD system) so as to block AMPAR into the ER and, by adding a ligand, control their trafficking from the ER to the plasma membrane. Thanks to this tool we have not only significantly increased the AMPAR concentration in the post-Golgi vesicles, but also eliminated the plasma membrane background noise. The FRAP imaging technique was used in order to remove the ER background noise. Such methodological approach combined with imaging techniques in living neurons, allowed us to clearly visualize for the first time the post-Golgi vesicular trafficking of AMPAR, and to study the mechanisms involved in this trafficking.

La protéine OSBP est un transporteur de lipides qui régule la distribution cellulaire du cholestérol. OSBP comprend un domaine PH, deux séquences « coiled coil », un motif FFAT (deux phénylalanines dans un environement acide), et un domaine de liaison de lipides (ORD) à son extrémité C-terminale. Le domaine PH interagit avec le PI(4)P et la petite protéine G Arf1-GTP au niveau du Golgi, alors que le motif FFAT interagit avec la protéine VAP-A, résidente du réticulum endoplasmique (RE). En liant simultanément tous ces déterminants, OSBP stabilise des sites de contact membranaire entre RE et Golgi, permettant ainsi un contre-échange cholestérol / PI(4)P par l'ORD. OSBP contient également une longue séquence N-terminale d’environ 80 aa, intrinsèquement désordonnée, composée principalement de glycine, proline et d'alanine. Nous démontrons que la présence de ce N-terminus désordonné augmente le rayon de Stoke de OSBP tronquée du domaine ORD, et limite sa densité d’association sur la membrane portant le PI(4)P. La protéine dépourvue du N terminus favorise l'agrégation symétrique des liposomes PI(4)P (mimant la membrane du Golgi) par les deux domaines PH du dimère OSBP, alors que la présence de la séquence désordonnée empêche cette association symétrique. De même, nous observons que la distribution d’OSBP sur la membrane de vésicules unilamellaires géantes (GUV) varie selon la présence ou l'absence du N-terminus. En présence de la séquence désordonnée, la protéine est répartie de manière homogène sur toute la surface du GUV, alors que la protéine sans N-terminal a tendance à s'accumuler à l'interface entre deux GUV de type Golgi. Cette accumulation locale ralentit fortement la mobilité de la protéine à l’interface. Un effet similaire du N-terminal sur la dynamique des protéines est observé lorsque l’association de membranes de type ER et Golgi est assuré par des protéines monomériques (dépourvue du coiled coil) en présence de Vap-A. Les résultats de nos expériences in vitro ont été confirmés en cellules vivantes, où la séquence intrinsèquement désordonnée contrôle le recrutement d’OSBP sur les membranes Golgiennes, sa mobilité et sa dynamique d’activité au cours des cycles de transfert de lipides. La plupart des protéines de la famille d’OSBP contiennent des séquences N-terminales de faible complexité, suggérant un mécanisme général de régulation. / Oxysterol binding protein (OSBP) is a lipid transfer protein that regulates cholesterol distribution in cell membranes. OSBP consists of a pleckstrin homology (PH) domain, two coiled-coils, a “two phenylalanines in acidic tract” (FFAT) motif and a C-terminal lipid binding OSBP-Related Domain (ORD). The PH domain recognizes PI(4)P and small G protein Arf1-GTP at the Golgi, whereas the FFAT motif interacts with the ER-resident protein VAP-A. By binding all these determinants simultaneously, OSBP creates membrane contact sites between ER and Golgi, allowing the counter-transport of cholesterol and PI(4)P by the ORD. OSBP also contains an intrinsically disordered ~80 aa long N-terminal sequence, composed mostly of glycine, proline and alanine. We demonstrate that the presence of disordered N-terminus increases the Stoke’s radius of OSBP truncated proteins and limits their density and saturation level on PI(4)P-containing membrane. The N-terminus also prevents the two PH domains of OSBP dimer to symmetrically tether two PI(4)P-containing (Golgi-like) liposomes, whereas protein lacking the disordered sequence promotes symmetrical liposome aggregation. Similarly, we observe a difference in OSBP membrane distribution on tethered giant unilamellar vesicles (GUVs), based on the presence/absence of N-terminus. Protein with disordered sequence is homogeneously distributed all over the GUV surface, whereas protein without N-terminus tends to accumulate at the interface between two PI(4)P-containing GUVs. This protein accumulation leads to local overcrowding, which is reflected by slow in-plane diffusion. The effect of N-terminus is also manifested in monomeric OSBPderived proteins that tether ER-like and Golgi-like membranes in the presence of VAP-A. Findings from our in vitro experiments are confirmed in living cells, where N-terminus controls the recruitment of OSBP on Golgi membranes, its motility and the on-and-off dynamics during lipid transfer cycles. Most OSBP-related proteins contain low complexity N-terminal sequences, suggesting a general effect.

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