Rationnel : L’implication établie des progéniteurs endothéliaux circulants dans les phénomènes de néovascularisation chez l’adulte a stimulé la recherche de thérapeutiques angiogènes basées sur la greffe de ces cellules. Deux types cellulaires au phénotype endothélial sont actuellement définis entre autres par leur cinétique d’apparition en culture : les progéniteurs précoces (CFU-EC ou CAC) et tardifs (ECFC). Notre équipe a montré que l’injection thérapeutique de cellules mononucléées de moelle osseuse (BM-MNC) permettait la néovascularisation du site ischémié chez des patients atteints d’artériopathie des membres inférieurs, et que les néovaisseaux formés avaient le phénotype d’ECFC. Nous avons dans un premier temps mesuré les concentrations de différentes protéines modulant l’angiogenèse, chez des patients atteints de pathologies ischémiques et cardiovasculaires, ou impliquant des anomalies vasculaires associées à la fibrose. Ainsi, le transforming growth factor - β1 (TGF-β1) dans la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI), la thrombospondine-1 (TSP-1) dans l’artériopathie des membres inférieurs (AMI), et le placental growth factor (PlGF) chez les patients atteints de pathologies cardiovasculaires [syndrome coronarien aigu (SCA), ou patients devant subir une chirurgie de la valve ou un pontage coronarien], se sont distingués comme potentiel biomarqueur plasmatique dans ces pathologies, et ont été étudiés dans la biologie des ECFC humaines.Résultats : Le taux plasmatique de TGF-β1 est augmenté chez les patients atteints de FPI par rapport à la population contrôle ; il a un effet pro-angiogène in vivo (vascularisation des implants de Matrigel®) et in vitro (prolifération et migration des ECFC) via les récepteurs ALK-1, ALK-5 et TGF-βRII. Le taux plasmatique de TSP-1 est augmenté chez les patients artéritiques par rapport à la population contrôle. Par ailleurs les néovaisseaux formés de patients artéritiques ayant été traités par injection locale de BM-MNC expriment la TSP-1. Dans les modèles murins de Matrigel®-plugs et d’ischémie du membre inférieur (IMI), la TSP-1 induit une diminution de la vascularisation des implants ainsi qu’une diminution de la revascularisation du membre ischémié. In vitro, la TSP-1 augmente l’adhésion via un mécanisme N-Terminal dépendant, et diminue le potentiel angiogène (prolifération et migration) des ECFC via sa liaison au récepteur CD47, ce qui active la voie de signalisation SDF-1/CXCR4. Le taux plasmatique de PlGF est augmenté chez les patients atteints de SCA par rapport à 2 populations contrôles ; il est également augmenté chez les patients ayant subit une chirurgie cardiaque. Les PlGF-1 et -2 potentialisent la tubulogenèse des ECFC in vitro via la phosphorylation du récepteur VEGFR1. Cet effet est aboli lorsque le VEGFR1 est inhibé par ARN interférence ou par le composé chimique « 4321 ». De plus ce composé « 4321 » inhibe la vascularisation des implants de Matrigel®, ainsi que la revascularisation du membre ischémié dans le modèle d’IMI.Conclusions : Le TGF-β1 joue un rôle dans le remodelage vasculaire de la FPI via les ECFC ; la TSP-1 est un potentiel biomarqueur de l’angiogenèse induite par les ECFC dans l’AMI ; l’inhibition de la voie PlGF/VEGFR1 module la tubulogenèse induite par les ECFC, cellules impliquées dans la formation de nouveaux vaisseaux. Nous avons ainsi mis en évidence 3 protéines modulant l’angiogenèse dans 3 contextes pathologiques différents, caractérisés par un remodelage vasculaire et où les ECFC sont impliquées dans leurs mécanismes physiopathologiques. Ces 3 protéines se présentent donc comme de potentiels biomarqueurs plasmatiques, modulant les propriétés angiogènes des ECFC et pouvant influencer leur efficacité en tant que produit de thérapie cellulaire. Ces protéines jouent un rôle probable dans l’équilibre homéostatique au décours des pathologies concernées. / Rationale: The pro-angiogenic capacities of endothelial progenitor cells are now well established, and their involvement in neovascularization events in adults has stimulated the research in the field of angiogenic therapy based on transplant of these cells. Current data converge towards the notion of two cell types with endothelial phenotype, defined at least by their kinetics of appearance in culture: early endothelial progenitor cells (CFU-EC or CAC) and late (ECFC). Our team has shown that the therapeutic injection of bone marrow mononuclear cells (BM-MNC) led to neovascularization of the ischemic site in patients with critical limb ischemia, and that the new vessels formed bore the phenotype of ECFC. We initially measured the concentrations of different proteins modulating angiogenesis in patients with ischemic and cardiovascular diseases, or involving vascular abnormalities associated with fibrosis. Thus, the transforming growth factor - ß1 (TGF-ß1) in idiopathic pulmonary fibrosis, the thrombospondin-1 (TSP-1) in peripheral artery disease, and the placental growth factor (PlGF) in patients with cardiovascular diseases [acute coronary syndrome (ACS), patients undergoing valve surgery or coronary artery bypass surgery], emerged as potential plasmatic biomarkers in these pathological settings, and have been studied in the biology of human ECFC.Results: TGF-ß1 plasma level is increased in patients with idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) compared to the control population; it exerts a pro-angiogenic effect in vivo (vascularization of Matrigel ®-plugs) and in vitro (proliferation and migration of ECFC) via ALK-1, ALK-5 and TGF-ßRII receptors. TSP-1 plasma level is increased in patients with peripheral artery disease (PAD) compared to the control population. In addition, the new vessels formed in PAD patients treated by local injection of BM-MNC express TSP-1. In murine models of Matrigel ®-plugs and hindlimb ischemia, TSP-1 induces a decrease in plugs vascularization and impaired revascularization of ischemic limb. In vitro, TSP-1 increases ECFC adhesion via an N-terminal dependent mechanism and reduces their angiogenic potential (proliferation and migration) via its binding to CD47 receptor, which activates the SDF-1/CXCR4 signaling pathway. PlGF plasma level is increased in ACS patients compared with the control population and stable angina patients and is also increased in patients undergoing cardiac surgery. PlGF-1 and -2 potentiate ECFC tubulogenesis in vitro via phosphorylation of the VEGFR1 receptor. This effect was abolished when the ECFC VEGFR1 is inhibited by RNA interference or by the chemical compound "4321". In addition this compound "4321" inhibits the vascularization of Matrigel ®-plugs, and revascularization of the ischemic limb in the hindlimb ischemia model.Conclusions: TGF-ß1 is involved in the IPF vascular remodeling through ECFC; TSP-1 is a potential biomarker of angiogenesis induced by ECFC in PAD; the inhibition of the PlGF/VEGFR1 pathway modulates ECFC tubulogenesis, cells involved in the formation of new vessels. We thus identified three proteins that modulate angiogenesis in three different pathological settings characterized by a vascular remodeling and where ECFC are involved in their pathophysiology. These three proteins therefore state as potential plasmatic biomarkers, modulating ECFC angiogenic properties and are able to influence their efficacy as a cell therapy product. These plasmatic biomarkers likely play a role in the homeostasis of those pathologies progress.

La sévérité potentielle de la thrombose veineuse superficielle (TVS) des membres inférieurs a récemment été documentée par des études réalisées en soins secondaires et tertiaires. Son épidémiologie reste cependant inconnue en soins primaires. Le premier objectif de ce travail était de mesurer la prévalence de la TVS en soins primaires, ainsi que le taux d'évènements thromboemboliques concomitants au moment du diagnostic. Pour y répondre, un réseau de recherche collaborative entre médecins généralistes et médecins vasculaires de la région stéphanoise a été mis en place. Une étude transversale descriptive a été réalisée au sein de ce réseau pendant un an. La prévalence annuelle de la TVS a été mesurée à 0,64 pour mille habitants. Au moment du diagnostic, 24,6% des TVS étaient associées à une thrombose veineuse profonde symptomatique et 4,7% à une embolie pulmonaire symptomatique. Une seconde étude a recherché une variation saisonnière de la fréquence de la TVS en analysant les données individuelles de trois études aux designs différents ; l'étude STENOX, l'étude POST et l'étude STEPH. Une variation significative n'a été retrouvée que dans l'étude POST, et les peak-to-low ratios étaient inférieurs à 1,2 dans les trois études. Ainsi, si une variation existe, celle-ci parait être de faible envergure, sans conséquence sur la pratique et la recherche / The potential severity of superficial vein thrombosis (SVT) of the lower limbs has recently been shown by studies perfomed in secondary and tertiary care. The epidemiology of SVT remains unknown in primary care. The first objective of this study was to measure the prevalence of SVT in primary care, and the rate of concomitant thromboembolic events at diagnosis. A collaborative research network between general practitioners and vascular physicians from Saint-Etienne has been set up. A cross-sectional study has been conducted within this network during one year. The annual prevalence of SVT was measured to 0.64 per thousand inhabitants. At diagnosis, 24.6% of SVT were associated with symptomatic deep vein thrombosis and 4.7% with symptomatic pulmonary embolism. A second study was looking for a seasonal variation of SVT frequency by analyzing individual data from three studies with different designs; the STENOX study, the POST study and the STEPH study. A significant variation was found only in the POST study, and peak-to-low ratios were below 1.2 in the three studies. Thus, if other more powerful and exhaustive studies could find a seasonal variation, that variation would probably be of low magnitude and without clinical significance

Cette thèse est consacrée à un nouveau modèle d'apparence pour la segmentation d'images basée modèle. Ce modèle, dénommé Multimodal Prior Appearance Model (MPAM), est construit à partir d'une classification EM de profils d'intensité combinée avec une méthode automatique pour déterminer le nombre de classes. Contrairement aux approches classiques basées ACP, les profils d'intensité sont classifiés pour chaque maillage et non pour chaque sommet. Tout d'abord, nous décrivons la construction du MPAM à partir d'un ensemble de maillages et d'images. La classification de profils d'intensité et la détermination du nombre de régions par un nouveau critère de sélection sont expliquées. Une régularisation spatiale pour lisser la classification est présentée et la projection de l'information d'apparence sur un maillage de référence est décrite. Ensuite, nous présentons une classification de type spectrale dont le but est d'optimiser la classification des profils pour la segmentation. La représentation de la similitude entre points de données dans l'espace spectral est expliquée. Des résultats comparatifs sur des profils d'intensité du foie à partir d'images tomodensitométriques montrent que notre approche surpasse les modèles basés ACP. Finalement, nous présentons des méthodes d'analyse pour les structures des membres inférieurs à partir d'images IRM. D'abord, notre technique pour créer des modèles spécifiques aux sujets pour des simulations cinématiques des membres inférieurs est décrite. Puis, la performance de modèles statistiques est comparée dans un contexte de segmentation des os lorsqu'un faible ensemble de données est disponible.

Dans la dysfonction endothéliale, le compartiment endothélial circulant joue simultanément le rôle d’acteur impliqué dans la régénération du tissu lésé et celui d’indicateur de l’état d’altération ou de régénération de l’endothélium. Dans l’artérite oblitérante des membres inférieurs (AOMI), l’un des axes de recherche porte sur le développement d’un produit de thérapie cellulaire capable d’induire la formation de néo-Vaisseaux. Face à la difficulté d’obtenir et d`amplifier des cellules progénitrices endothéliales (CPE) chez l’adulte sain, et a fortiori chez le patient, l’une des hypothèses laisse envisager le recours à d’autres types cellulaires ayant des propriétés vasculogéniques. Chez patients atteints de maladies cardiovasculaires, et d’AOMI en particulier, les cellules mononuclées de moelle osseuse et les CPE montrent des propriétés angiogéniques diminuées. Nous avons mis en évidence la capacité des cellules souches mésenchymateuses (CSM) isolées de patients atteints d’AOMI à induire une reperfusion, par recrutement de cellules endothéliales in situ, avec la même efficacité que celles de donneurs sains. Les CSM ne se différencient pas en cellules endothéliales mais agissent par paracrinie. La seconde hypothèse d’obtention d’un produit de thérapie cellulaire autologue angiogène est de trier des cellules plus immatures que les CPE afin de les différencier secondairement vers la lignée endothéliale à l’image du modèle pathologique de la cellule souche d’hémangiome CD133+ qui laisse envisager les Very Small Embryonic Like stem cells (VSEL), cellules souches multipotentes CD133+, comme un candidat de cellules post-Natales à potentiel vasculaire. Nous avons dérivés, en culture en conditions angiogéniques, des VSEL qui acquièrent un phénotype mésenchymateux mais présentent un profil sécrétoire proche de celui des CPE. Les VSEL favorisent la revascularisation post-Ischémique et acquièrent un phénotype endothélial in vitro et in vivo suggérant que les VSEL peuvent être à l’origine de la lignée endothéliale. Les VSEL se présentent également comme un biomarqueur de la dysfonction endothéliale mobilisé de la moelle osseuse (MO) vers le sang périphérique (PB) chez les patients souffrant d’AOMI. Les biomarqueurs cellulaires circulants représentent non seulement des marqueurs non invasifs de l’endothélium mais peuvent également apporter des informations utiles pour le diagnostic, le pronostic et le suivi thérapeutique des patients souffrant de pathologies associées à une dysfonction endothéliale. Une modification du nombre de CPE et de cellules endothéliales circulantes (CEC) dans la circulation a été rapportée dans différentes situations pathologiques respectivement associées à une régénération et une altération endothéliale telle l’augmentation du taux de CEC chez des patients présentant une hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). La technique de référence pour le dénombrement des CEC dans le sang périphérique est l’immunoséparation magnétique (IMS). Cette méthode non automatisée et chronophage, repose sur l’énumération par microscopie à fluorescence des cellules CD146+ préalablement isolées. Bien que reproductible, cette numération est soumise à de nombreux biais de quantification, difficile à mettre en oeuvre et sujette à interprétation. La mise au point d’une méthode de détection automatisée des CEC par cytométrie à focalisation acoustique (AFC) s’est montrée fiable et robuste, dans une cohorte de patients atteints d’HTAP traitée ou non, constituant une alternative pertinente à l’analyse par microscopie. L’ensemble de ces travaux ouvre donc de nouvelles perspectives dans la détection des biomarqueurs cellulaires circulants impliqués dans la dysfonction endothéliale, proposant les VSEL comme nouvel acteur vasculogénique. / In endothelial dysfunction, circulating endothelial compartment simultaneously plays the role of actor involved in the regeneration of injured tissue and reflects endothelium state. In peripheral arterial disease (PAD), one of the research areas is the development of a cellular therapy product capable of inducing the formation of neo-Vessels. Faced with the difficulty to obtain and amplify endothelial progenitor cells (EPC) in adults, one of the assumptions lets consider the use of other cell types with vasculogenic properties. In patients with cardiovascular disease, and PAD in particular, bone marrow mononuclear cells and EPC show reduced angiogenic properties. We have demonstrated the ability of isolated mesenchymal stem cells (MSCs) from PAD patients to induce reperfusion by recruitment of endothelial cells in situ, with the same efficiency as that of healthy donors MSCs. MSCs do not differentiate into endothelial cells but act by paracrine. The second hypothesis of obtaining an autologous angiogenic cell therapy product is to sort cells more immature than the CPE and to differentiate them secondarily into endothelial lineage as the pathological cell model of hemangioma stem cells CD133 + which lets consider the Very Small Embryonic like stem cells (VSEL), CD133 + multipotent stem cells as a potential candidate of postnatal vascular cell. We have derived and cultured in angiogenic conditions VSEL that acquired a mesenchymal phenotype but exhibited a secretory profile similar to that of EPC. VSEL promote post-Ischemic revascularization and acquire an endothelial phenotype in vitro and in vivo suggesting that VSEL may be responsible for the endothelial lineage. VSEL also appear as a biomarker of endothelial dysfunction mobilized from bone marrow (BM) to peripheral blood (PB) in patients with PAD. Cellular circulating biomarkers are not only non-Invasive markers of endothelium but can also provide useful information for the diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring of patients with endothelial dysfunction associated pathologies. Changing the number of EPC and circulating endothelial cells (CEC) in the circulation has been reported in different pathological situations respectively associated with endothelial regeneration and alteration such as the increase of CEC in patients with pulmonary arterial hypertension (PAH). The reference technique for the enumeration of CEC in peripheral blood is magnetic immunoseparation (IMS). This non-Automated and time-Consuming method, based on the enumeration by fluorescence microscopy of CD146 + cells isolated. Although reproducible, this count is subject to many through quantification, difficult to implement and subject to interpretation. The development of an acoustic focusing cytometry (AFC) method for automated detection of CEC has proved reliable and robust results, in a cohort of patients with PAH treated or not, constituting a relevant alternative analysis to microscopy. All of this work opens new perspectives in the detection of cellular circulating biomarkers involved in endothelial dysfunction, suggesting VSEL as new vasculogenic actor.