Myelodysplastic syndromes (MDS) comprise a heterogeneous group of hematologic malignancies characterized by clonal hematopoiesis, one or more cytopenias such as anemia, neutropenia, or thrombocytopenia, abnormal cellular maturation, and a high risk of progression to acute myeloid leukemia. The bone marrow microenvironment (BMME) in general and mesenchymal stromal cells (MSCs) in particular contribute to both the initiation and progression of MDS. However, little is known about the role of MSC-derived extracellular matrix (ECM) in this context. Therefore, we performed a comparative analysis of in vitro deposited MSC-derived ECM of different MDS subtypes and healthy controls. Atomic force microscopy analyses demonstrated that MDS ECM was significantly thicker and more compliant than those from healthy MSCs. Scanning electron microscopy showed a dense meshwork of fibrillar bundles connected by numerous smaller structures that span the distance between fibers in MDS ECM. Glycosaminoglycan (GAG) structures were detectable at high abundance in MDS ECM as white, sponge-like arrays on top of the fibrillar network. Quantification by Blyscan assay confirmed these observations, with higher concentrations of sulfated GAGs in MDS ECM. Fluorescent lectin staining with wheat germ agglutinin and peanut agglutinin demonstrated increased deposition of N-acetyl-glucosamine GAGs (hyaluronan (HA) and heparan sulfate) in low risk (LR) MDS ECM. Differential expression of N-acetyl-galactosamine GAGs (chondroitin sulfate, dermatan sulfate) was observed between LR- and high risk (HR)-MDS. Moreover, increased amounts of HA in the matrix of MSCs from LR-MDS patients were found to correlate with enhanced HA synthase 1 mRNA expression in these cells. Stimulation of mononuclear cells from healthy donors with low molecular weight HA resulted in an increased expression of various pro-inflammatory cytokines suggesting a contribution of the ECM to the inflammatory BMME typical of LR-MDS. CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) displayed an impaired differentiation potential after cultivation on MDS ECM and modified morphology accompanied by decreased integrin expression which mediate cell-matrix interaction. In summary, we provide evidence for structural alterations of the MSC-derived ECM in both LR- and HR-MDS. GAGs may play an important role in this remodeling processes during the malignant transformation which leads to the observed disturbance in the support of normal hematopoiesis.

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Acute myeloid leukemia (AML) presents the deadliest form of blood cancer which leads to abrupt, premature deaths. Current therapeutic treatment options in AML are unspecific, resulting in high relapse rates and poor clinical responses in patients. Therapy-resistant, stem cell-like AML cells are believed to be protected by proximal stromal cells in their microenvironment, the leukemic stem cell niche. In part A of this work, an innovative first-of-its-kind arrayed endoribonuclease-prepared siRNA (esiRNA) screen was established for the targeted identification of stromal-derived, AML-supportive genes. Immortalized bone-marrow derived mesenchymal stromal cells (SCP-1) were subjected to individual esiRNA-mediated target gene knockdowns (KD) and subsequently cocultured with AML cell lines MV4-11, OCI-AML3, MOLM-13 and HL-60. AML proliferation and therapy resistance to cytostatic agents Cytarabine or Daunorubicin and tyrosine kinase inhibitor Midostaurin were assessed in direct cocultures. In SCP-1, several secreted, membrane-associated and intracellular molecules were identified which, upon esiRNA-mediated KD, resulted in proliferation inhibition and enhanced treatment response of cocultured AML cells. Carbonic anhydrase 9 (CA9), a stabilizer of intracellular pH, was identified as a supportive factor in proliferation and resistance of leukemic cells to Daunorubicin treatment whilst CA9-KD exerted only a comparably low toxicity in SCP-1 cells. Excitingly, published data by Chen and colleagues (Blood, 2017, Vol. 130, Suppl. 1, 2521) indicated an upregulation of CA9 in hypoxic ex vivo cultures of leukemic cells, measured an anti-leukemic effect of pharmacological CA9 inhibition and identified a synergistic effect on leukemic cells via combinatorial treatment of CA9-inhibition and Cytarabine under hypoxic culture conditions. Taken together, an arrayed esiRNA screen identified CA9 and other stromal-derived factors which potentially open up new avenues for selective therapeutic treatments targeting the leukemic microenvironment in AML. Currently, preclinical leukemia research relies on artificial suspension cultures of AML cells and highly sophisticated, patient-derived xenograft (PDX) mouse models that are marked by suboptimal translation of findings of PDX experiments into the clinic. Recent developments in complex three-dimensional (3D) hydrogel star-shaped poly(ethylene glycol) (starPEG)-heparin cocultures of leukemic and stromal cells of human origin showed promising results in proliferation and drug response studies. Therefore, in part B of this work, a high throughput screening (HTS)-compatible 3D hydrogel culture setup of human stromal cells was established in 384-well plates. Implementation of design of experiments (DoE) enabled an efficient, cost-effective optimization of hydrogel monocultures of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Optimized culture conditions favored angiogenic sprouting of hydrogel-embedded HUVECs which responded to angiogenic inhibitors Axitinib, AZD4547 and Bevacizumab in a dose-dependent manner. A coculture with bone marrow derived MSCs altered the angiogenic network formation of endothelial CD31+ vessel-like structures. The hydrogel coculture was further stabilized by extensive hydrogel degradation and ECM deposition of MSCs. Stromal MSC networks were illustrated as highly interconnected and elongated F-Actin filament structures (CD31- F-Actin+) that were closely associating with CD31+ F-Actin+ endothelial vessel-like structures. Excitingly, the established 3D hydrogel HTS platform of primary human stromal cells enables future addition of patient-derived leukemic cells for targeted leukemic vulnerability screens in an ex vivo cell culture model of the perivascular stem cell niche. / Akute myeloische Leukämie (AML) gilt als die tödlichste Form der Blutkrebserkrankungen, welche untherapiert zum abrupten, vorzeitigen Tod führt. Etablierte therapeutische Verfahren der AML sind unspezifisch, welche durch heterogene Behandlungseffekte gekennzeichnet sind und zu hohen Rückfallquoten führen. Man vermutet, dass therapie-resistente, stammzellähnliche leukämische Zellen von proximal residierenden Stromazellen in ihrem Mikromilieu, in der sogenannten leukämischen Stammzellnische, vor therapeutischen Behandlungen geschützt werden. In Teil A dieser Arbeit wurde ein innovativer, neuartiger Screen basierend auf Endoribonuklease-generierten kleinen, interferierenden Ribonukleinsäuren (esiRNAs) für eine gezielte Identifikation von AML-supportiven, stromalen Faktoren etabliert. Immortalisierte, mesenchymale Stromazellen aus dem Knochenmark (SCP-1) wurden in einem Array mit spezifischen esiRNAs transfiziert, um esiRNA-basierende inhibierende Effekte (Knockdown) auf die Genexpression von Zielgenen in SCP-1 zu studieren und indirekte Auswirkungen auf Proliferationsrate und Therapieresistenz von kokultivierten leukämischen Zelllinien, MV4-11, OCI-AML3, MOLM-13 und HL-60, bei Behandlung mit Cytarabin, Daunorubicin und Midostaurin, zu studieren. Mehrere sezernierte, membranständige und intrazelluläre Faktoren wurden in SCP-1 identifiziert, deren esiRNA-vermittelter Knockdown zu einer Proliferationsminderung sowie verstärkten Toxizitätseffekten von applizierten Therapeutika in Leukämiezellen führten. Beispielhaft wurde Carboanhydrase (CA9), ein Enzym welches den intrazellularen pH einer Zelle stabilisert, als Target identifiziert. Ein Knockdown von CA9 in SCP-1 resultierte in einer Proliferationsminderung von kokultivierten Leukämiezellen, welche des Weiteren in einer Behandlung mit Daunorubicin verstärkt abgetötet wurden. Publizierte Daten von Chen et al. (Blood, 2017, Vol. 130, Suppl. 1, 2521) zeigten, dass CA9 in hypoxischen ex vivo Kulturen in leukämischen Zellen hochreguliert war und, dass dessen pharmakologische Inhibition einen anti-leukämischen Effekt aufwies. Zudem wurde ein synergistischer Therapieffekt, bei einer Kombinationstherapie mit einem CA9-Inhibitor und Cytarabin, auf AML Zellen in hypoxischer Zellkultur festgestellt. Zusammenfassend wurden in einem esiRNA-Screen CA9 und weitere stromal-exprimierte Faktoren identifiziert, die das Potential besitzen neuartige Therapiestrategien zu ermöglichen, welche auf die leukämische Stammzellnische als Zielstruktur ausgerichtet sind. In der präklinischen Forschung von hämatologischen Erkrankungen werden vorrangig artifizielle zweidimensionale Suspensionskulturen von Leukämiezellen verwendet oder ausgefeilte, patienten-derivierende Xenograft (PDX) Mausmodelle eingesetzt. Bedauerlicherweise weisen Erkenntnisse aus Mausmodellen eine geringe Translationseffizienz in die klinische Forschung auf. Neuste Entwicklungen mit komplexen, dreidimensionalen Hydrogelkulturen, bestehend aus sternförmigem Polyethylenglykol (starPEG) und Heparin, von stromalen und leukämischen Zellen humanen Ursprungs zeigten vielversprechende Ergebnisse in präklinischen Proliferations- und Vulnerabilitätsstudien. Daher wurde in Teil B dieser Arbeit ein hochdurchsatzfähiges dreidimensionales Kultursystem von humanen Stromazellen in Hydrogelen entwickelt. Per statistischer Versuchsplanung wurde eine effiziente, kostengünstige Optimierung von etablierten Hydrogelkulturen für die Hochdurchsatz-kompatible Kultur von humanen venösen Endothelzellen aus Nabelschnuren (HUVECs) durchgeführt. Optimierte Kulturbedingungen führten zur Angiogenese von Hydrogel-eingebetteten HUVECs, welche des Weiteren auf die Angiogenese-Inhibitoren Axitinib, AZD4547 und Bevacizumab in einer konzentrationsabhängigen Weise mit verminderter Bildung von gefäßähnlichen Strukturen reagierten. Eine Kokultur von HUVECs mit primären, mesenchymalen Stromazellen aus dem Knochenmark (MSCs) beeinflusste die Bildung von CD31+ gefäßähnlichen Strukturen. Die Hydrogel-Kokultur wurde des Weiteren durch verstärkte Degradation des Hydrogels und Deposition von Komponenten der extrazellulären Matrix via MSCs verändert und dadurch zusätzlich stabilisiert. Geformte Netzwerkstrukturen von MSCs und HUVECs wurden mittels F-Actin Färbung identifiziert, wodurch ersichtlich wurde, dass Strukturen von MSCs (CD31- F-Actin+) in enger räumlicher Distanz zu HUVEC Strukturen (CD31+ F-Actin+) gebildet wurden. Spannenderweise ermöglicht die, in dieser Arbeit etablierte, Hochdurchsatz-kompatible Kokultur von humanen Stromazellen die Möglichkeit auch leukämische Zellen in die Hydrogelmatrix einzubetten. Eine humane AML-Stroma Kokultur in Hydrogelen wird gezielte Vulnerabilitätsscreens von AML Zellen in einem komplexen ex vivo Zellkulturmodel der perivaskulären Stammzellnische ermöglichen.

Endothelzell-basierte Therapien vermitteln regenerative Effekte hinsichtlich der Revaskularisierung von ischämischen Geweben. Doch ist die Verfügbarkeit von autologen Endothelzellen aufgrund einer krankheitsbedingt reduzierten Frequenz im peripheren Blut oder einer verminderten Integrität der endogenen Endothelzell-Populationen eingeschränkt. Hingegen ist es möglich, allogene endotheliale Vorläuferzellen aus der Nabelschnur in zelltherapeutisch relevanten Mengen zu isolieren. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst die Eigenschaften allogener humaner Nabelschnur (NS)-abgeleiteter sog. Endothelial Colony-Forming Cells (ECFCs) mit denen von venösen NS-abgeleiteten Endothelzellen verglichen. Aufgrund der nachgewiesenen Immunogenität von allogenen ECFCs wurde eine weiterführende Strategie zur Reduktion dieser immunogenen Eigenschaften durch die Koapplikation mit Mesenchymalen Vorläuferzellen (MSCs) verfolgt. Humane ECFCs wurden mit MSCs desselben Spenders kombiniert und in funktionellen in vitro- und in vivo-Assays untersucht. Dadurch konnte nachgewiesen werden, dass IFNγ-stimulierte ECFC/MSC-Kokulturen eine reduzierte Expression von HLA-Molekülen zeigen. Entsprechend induzierten spezifische CD8+ T-Zellen eine reduzierte Lyse der kokultivierten ECFCs und MSCs. Die Kokultur von ECFCs und MSCs mit allogenen Immunzellen führte zu einer nahezu vollständigen Inhibition der T-Zell-Proliferation. Um die reduzierte Immunogenität von ECFC und MSC in vivo zu verifizieren, wurden die Zellen in immundefiziente Mäuse injiziert, welche nachfolgend mit humanen PBMCs rekonstituiert wurden. So konnte nachgewiesen werden, dass die Koapplikation von ECFCs und MSCs nicht nur die Entstehung von stabilen Gefäßnetzwerken begünstigt, sondern zudem in den Transplantaten zu einer verringerten Immunzell-Infiltration führte. Die Koapplikation von ECFCs mit MSCs könnte daher eine klinische Nutzung dieser allogenen Quelle für die therapeutische Unterstützung der Vaskularisierung ermöglichen. / Endothelial cell-based therapies promote tissue regeneration and vascularization after ischemic damage. The availability of autologous endothelial progenitor cells is restricted in diseased patients, however therapeutically relevant numbers of allogeneic Endothelial Progenitor Cells can be isolated from an umbilical cord (UC). In the present study, the immunogenic properties of these Endothelial Colony Forming Cells (ECFCs) were first compared to human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Both cytokine-treated endothelial cells induced CD4+ and CD8+ T cell proliferation after coculture with allogeneic immune cells. So far, the potential interactions between ECFCs and Mesenchymal Stem/Progenitor Cells (MSCs) concerning their immunological features is poorly understood, but we hypothesize that MSCs might improve the immune compatibility and vessel building characteristics of ECFCs. Therefore, human UC-derived ECFC and MSC cocultures from the same donor were analyzed using various functional in vitro and in vivo assays. Stimulation of these cocultures with IFNγ caused strongly reduced expression levels of HLA-molecules compared to ECFC monocultures. The decreased molecular density on the cocultured ECFCs resulted in reduced cytotoxic CD8+ T cell-mediated lysis. Further, during IFNγ stimulation, the combination of ECFCs with MSCs prevented initiation of allogeneic T cell proliferation. To verify this concept in vivo, ECFCs and MSCs were co-transplanted in a humanized allograft mouse model in immunodeficient mice in order to effectively induce stable microvessels. These experiments demonstrate that when MSCs are co-applied with ECFCs, they not only support the formation of stable blood vessels, but also lead to fewer HLA-DR+ human vascular structures and fewer infiltrating human leukocytes. The data presented indicate that crosstalk between UC-derived ECFCs and MSCs might lower the risk of allogeneic ECFC rejection.