Zugl.: Berlin, Freie University, Diss., 2008.

Mathematical modeling of biological systems is a powerful tool to systematically investigate the functions of biological processes and their relationship with the environment. To obtain accurate and biologically interpretable predictions, a modeling framework has to be devised whose assumptions best approximate the examined scenario and which copes with the trade-off of complexity of the underlying mathematical description: with attention to detail or high coverage. Correspondingly, the system can be examined in detail on a smaller scale or in a simplified manner on a larger scale. In this thesis, the role of photosynthesis and its related biochemical processes in the context of plant metabolism was dissected by employing modeling approaches ranging from kinetic to stoichiometric models. The Calvin-Benson cycle, as primary pathway of carbon fixation in C3 plants, is the initial step for producing starch and sucrose, necessary for plant growth. Based on an integrative analysis for model ranking applied on the largest compendium of (kinetic) models for the Calvin-Benson cycle, those suitable for development of metabolic engineering strategies were identified. Driven by the question why starch rather than sucrose is the predominant transitory carbon storage in higher plants, the metabolic costs for their synthesis were examined. The incorporation of the maintenance costs for the involved enzymes provided a model-based support for the preference of starch as transitory carbon storage, by only exploiting the stoichiometry of synthesis pathways. Many photosynthetic organisms have to cope with processes which compete with carbon fixation, such as photorespiration whose impact on plant metabolism is still controversial. A systematic model-oriented review provided a detailed assessment for the role of this pathway in inhibiting the rate of carbon fixation, bridging carbon and nitrogen metabolism, shaping the C1 metabolism, and influencing redox signal transduction. The demand of understanding photosynthesis in its metabolic context calls for the examination of the related processes of the primary carbon metabolism. To this end, the Arabidopsis core model was assembled via a bottom-up approach. This large-scale model can be used to simulate photoautotrophic biomass production, as an indicator for plant growth, under so-called optimal, carbon-limiting and nitrogen-limiting growth conditions. Finally, the introduced model was employed to investigate the effects of the environment, in particular, nitrogen, carbon and energy sources, on the metabolic behavior. This resulted in a purely stoichiometry-based explanation for the experimental evidence for preferred simultaneous acquisition of nitrogen in both forms, as nitrate and ammonium, for optimal growth in various plant species. The findings presented in this thesis provide new insights into plant system's behavior, further support existing opinions for which mounting experimental evidences arise, and posit novel hypotheses for further directed large-scale experiments. / Mathematische Modellierung biologischer Systeme eröffnet die Möglichkeit systematisch die Funktionsweise biologischer Prozesse und ihrer Wechselwirkungen mit der Umgebung zu untersuchen. Um präzise und biologisch relevante Vorhersagen treffen zu können, muss eine Modellierungsstrategie konzipiert werden, deren Annahmen das untersuchte Szenario bestmöglichst widerspiegelt und die dem Trade-off der Komplexität der zugrunde liegenden mathematischen Beschreibung gerecht wird: Detailtreue gegenüber Größe. Dementsprechend kann das System detailliert, in kleinerem Umfang oder in vereinfachter Darstellung im größeren Maßstab untersucht werden. In dieser Arbeit wird mittels verschiedener Modellierungsansätze, wie kinetischen und stöchiometrischen Modellen, die Rolle der Photosynthese und damit zusammenhängender biochemischer Prozesse im Rahmen des Pflanzenstoffwechsels analysiert. Der Calvin-Benson-Zyklus, als primärer Stoffwechselweg der Kohlenstofffixierung in C3-Pflanzen, ist der erste Schritt der Stärke- und Saccharoseproduktion, welche maßgeblich für das Wachstum von Pflanzen sind. Basierend auf einer integrativen Analyse zur Modellklassifizierung wurden aus der größten bekannten Sammlung von (kinetischen) Modellen des Calvin-Benson-Zyklus diejenigen ermittelt, die für die Entwicklung von Metabolic-Engineering-Strategien geeignet sind. Angeregt von der Fragestellung warum Kohlenstoff transitorisch vorwiegend in Form von Stärke anstatt Saccharose gespeichert wird, wurden die metabolischen Kosten beider Syntheseprozesse genauer betrachtet. Die Einbeziehung der Bereitstellungskosten der beteiligten Enzyme stützt die Tatsache, dass bevorzugt Stärke als temporärer Kohlenstoffspeicher dient. Die entprechende Untersuchung erfolgte einzig auf Grundlage der Stöchiometrie der Synthesewege. In vielen photosynthetisch-aktiven Organismen findet zudem Photorespiration statt, die der Kohlenstofffixierung entgegenwirkt. Die genaue Bedeutung der Photorespiration für den Pflanzenmetabolismus ist noch umstritten. Eine detaillierte Einschätzung der Rolle dieses Stoffwechselweges bezüglich der Inhibierung der Kohlenstofffixierungsrate, der Verknüpfung von Kohlenstoff- und Stickstoffmetabolismus, der Ausprägung des C1-Stoffwechsels sowie die Einflussnahme auf die Signaltransduktion wurde in einer modell-basierten, kritischen Analyse vorgenommen. Um die Photosynthese in ihrem metabolischen Kontext verstehen zu können, ist die Betrachtung der angrenzenden Prozesse des primären Kohlenstoffmetabolismus unverzichtbar. Hierzu wurde in einem Bottom-up Ansatz das Arabidopsis core Modell entworfen, mittels dessen die Biomasseproduktion, als Indikator für Pflanzenwachtum, unter photoautotrophen Bedingungen simuliert werden kann. Neben sogenannten optimalen Wachstumsbedingungen kann dieses großangelegte Modell auch kohlenstoff- und stickstofflimitierende Umweltbedingungen simulieren. Abschließend wurde das vorgestellte Modell zur Untersuchung von Umwelteinflüssen auf das Stoffwechselverhalten herangezogen, im speziellen verschiedene Stickstoff-, Kohlenstoff- und Energiequellen. Diese auschließlich auf der Stöchiometrie basierende Analyse bietet eine Erklärung für die bevorzugte, gleichzeitige Aufnahme von Nitrat und Ammonium, wie sie in verschiedenen Spezies für optimales Wachstum experimentell beobachtet wurde. Die Resultate dieser Arbeit liefern neue Einsichten in das Verhalten von pflanzlichen Systemen, stützen existierende Ansichten, für die zunehmend experimentelle Hinweise vorhanden sind, und postulieren neue Hypothesen für weiterführende großangelegte Experimente.

This work presents mathematical and computational approaches to cover various aspects of metabolic network modelling, especially regarding the limited availability of detailed kinetic knowledge on reaction rates. It is shown that precise mathematical formulations of problems are needed i) to find appropriate and, if possible, efficient algorithms to solve them, and ii) to determine the quality of the found approximate solutions. Furthermore, some means are introduced to gain insights on dynamic properties of metabolic networks either directly from the network structure or by additionally incorporating steady-state information. Finally, an approach to identify key reactions in a metabolic networks is introduced, which helps to develop simple yet useful kinetic models. The rise of novel techniques renders genome sequencing increasingly fast and cheap. In the near future, this will allow to analyze biological networks not only for species but also for individuals. Hence, automatic reconstruction of metabolic networks provides itself as a means for evaluating this huge amount of experimental data. A mathematical formulation as an optimization problem is presented, taking into account existing knowledge and experimental data as well as the probabilistic predictions of various bioinformatical methods. The reconstructed networks are optimized for having large connected components of high accuracy, hence avoiding fragmentation into small isolated subnetworks. The usefulness of this formalism is exemplified on the reconstruction of the sucrose biosynthesis pathway in Chlamydomonas reinhardtii. The problem is shown to be computationally demanding and therefore necessitates efficient approximation algorithms. The problem of minimal nutrient requirements for genome-scale metabolic networks is analyzed. Given a metabolic network and a set of target metabolites, the inverse scope problem has as it objective determining a minimal set of metabolites that have to be provided in order to produce the target metabolites. These target metabolites might stem from experimental measurements and therefore are known to be produced by the metabolic network under study, or are given as the desired end-products of a biotechological application. The inverse scope problem is shown to be computationally hard to solve. However, I assume that the complexity strongly depends on the number of directed cycles within the metabolic network. This might guide the development of efficient approximation algorithms. Assuming mass-action kinetics, chemical reaction network theory (CRNT) allows for eliciting conclusions about multistability directly from the structure of metabolic networks. Although CRNT is based on mass-action kinetics originally, it is shown how to incorporate further reaction schemes by emulating molecular enzyme mechanisms. CRNT is used to compare several models of the Calvin cycle, which differ in size and level of abstraction. Definite results are obtained for small models, but the available set of theorems and algorithms provided by CRNT can not be applied to larger models due to the computational limitations of the currently available implementations of the provided algorithms. Given the stoichiometry of a metabolic network together with steady-state fluxes and concentrations, structural kinetic modelling allows to analyze the dynamic behavior of the metabolic network, even if the explicit rate equations are not known. In particular, this sampling approach is used to study the stabilizing effects of allosteric regulation in a model of human erythrocytes. Furthermore, the reactions of that model can be ranked according to their impact on stability of the steady state. The most important reactions in that respect are identified as hexokinase, phosphofructokinase and pyruvate kinase, which are known to be highly regulated and almost irreversible. Kinetic modelling approaches using standard rate equations are compared and evaluated against reference models for erythrocytes and hepatocytes. The results from this simplified kinetic models can simulate acceptably the temporal behavior for small changes around a given steady state, but fail to capture important characteristics for larger changes. The aforementioned approach to rank reactions according to their influence on stability is used to identify a small number of key reactions. These reactions are modelled in detail, including knowledge about allosteric regulation, while all other reactions were still described by simplified reaction rates. These so-called hybrid models can capture the characteristics of the reference models significantly better than the simplified models alone. The resulting hybrid models might serve as a good starting point for kinetic modelling of genome-scale metabolic networks, as they provide reasonable results in the absence of experimental data, regarding, for instance, allosteric regulations, for a vast majority of enzymatic reactions. / In dieser Arbeit werden mathematische und informatische Ansätze zur Behandlung diverser Probleme im Zusammenhang mit der Modellierung metabolischer Netzwerke vorgestellt, insbesondere unter Berücksichtigung der eingeschränkten Verfügbarkeit detaillierter Enzymkinetiken. Es wird gezeigt, dass präzise mathematische Formulierungen der Probleme notwendig sind, um erstens angemessene und, falls möglich, effiziente Algorithmen zur Lösung zu entwickeln. Und zweitens, um die Güte der so gefundenen Lösungen zu bewerten. Des weiteren werden Methoden zur Analyse dynamischer Eigenschaften metabolischer Netzwerke eingeführt, welche entweder nur auf der Struktur der Netzwerke basieren oder zusätzlich noch Informationen über stationäre Zustände mit berücksichtigen. Außerdem wird eine Strategie zur Bestimmung von Schlüsselreaktionen eines Netzwerkes vorgestellt, welche die Entwicklung kinetischer Modelle vereinfacht. Der Erfolg neuer Technologien ermöglicht eine immer billigere und schnellere Sequenzierung des Genoms. Dies wird in naher Zukunft die Analyse biologischer Netzwerke nicht nur für Spezies, sondern auch für einzelne Individuen ermöglichen. Die automatische Rekonstruktion metabolischer Netzwerke ist bestens dafür geeignet, diese großen Datenmengen auszuwerten. Eine mathematische Formulierung der Rekonstruktion als Optimierungsproblem wird vorgestellt, die sowohl bereits vorhandenes Wissen als auch theoretische Vorhersagen verschiedenster bioinformatischer Methoden berücksichtigt. Die rekonstruierten Netzwerke sind hinsichtlich möglichst großer und plausibler Zusammenhangskomponenten hin optimiert, um fragmentierte und isolierte Teilnetzwerke zu vermeiden. Als Beispiel dient die Rekonstruktion der Saccharosesynthese in Chlamydomonas reinhardtii. Es wird gezeigt, dass das Problem sehr rechenintensiv ist und somit Approximationsalgorithmen erforderlich macht. Das 'inverse scope' Problem hat als Optimierungsziel, für ein gegebenes metabolisches Netzwerk die minimale Menge notwendiger Metabolite zu bestimmen, um eine ebenfalls gegebene Menge von gewünschten Zielmetaboliten zu produzieren. Diese Zielmetabolite können entweder durch experimentellen Messungen festgelegt werden, oder sie sind die gewünschten Endprodukte einer biotechnologischen Anwendung. Es wird gezeigt, dass das 'inverse scope' Problem rechenintensiv ist. Allerdings wird angenommen, dass die Berechnungskomplexität stark von der Anzahl gerichteter Zyklen innerhalb des metabolischen Netzwerkes abhängt. Dies könnte die Entwicklung effizienter Approximationsalgorithmen ermöglichen. Unter der Annahme von Massenwirkungskinetiken erlaubt es die 'chemical reaction network theory' (CRNT), anhand der Struktur metabolischer Netzwerke Rückschlüsse auf Multistabilität zu ziehen. Auch weitere Kinetiken können durch Modellierung von Enzymmechanismen mit berücksichtigt werden. CRNT wird zum Vergleich von mehreren Modellen des Calvinzyklus, welche sich in Größe und Abstraktionsniveau unterscheiden, verwendet. Obwohl für kleinere Modelle Ergebnisse erzielt werden, erlauben es die verfügbaren Theoreme und Algorithmen der CRNT nicht, Aussagen für größere Modelle zu machen, da die gegenwärtigen Implementierungen der Algorithmen an ihre Berechnungsgrenzen stoßen. Sind sowohl die Stoichiometrie eines metabolischen Netzwerkes, als auch die Metabolitkonzentrationen und Flüsse im stationären Zustand bekannt, so kann 'structural kinetic modelling' angewandt werden, um das dynamische Verhalten des Netzwerkes zu analysieren, selbst wenn die expliziten Ratengleichung unbekannt sind. Dieser Ansatz wird verwendet, um den stabilisierenden Einfluss allosterischer Regulation in menschlichen Erythrozyten zu untersuchen. Des weiteren werden die Reaktionen anhand ihrer Bedeutung hinsichtlich Stabilität im stationären Zustand angeordnet. Die wichtigsten Reaktionen bezüglich dieser Ordnung sind Hexokinase, Phosphofructokinase und Pyruvatkinase, welche bekanntermaßen stark reguliert und irreversibel sind. Kinetische Modelle, die auf generischen Ratengleichung beruhen, werden mit detaillierten Referenzmodellen für Erythrozyten und Hepatozyten verglichen. Die generischen Modelle simulieren das Verhalten nur in der Nähe eines gegebenen stationären Zustandes recht gut. Der zuvor erwähnte Ansatz, wichtige Reaktionen bezüglich Stabilität zu identifizieren, wird zur Bestimmung von Schlüsselreaktionen genutzt. Diese Schlüsselreaktionen werden im Detail modelliert, während für alle anderen Reaktionen weiterhin generische Ratengleichung verwendet werden. Die so entstandenen Hybridmodelle können das Verhalten des Referenzmodells signifikant besser beschreiben. Die Hybridmodelle können als Ausgangspunkt zur Erstellung genomweiter kinetischer Modelle dienen.

Complex networks have been successfully employed to represent different levels of biological systems, ranging from gene regulation to protein-protein interactions and metabolism. Network-based research has mainly focused on identifying unifying structural properties, including small average path length, large clustering coefficient, heavy-tail degree distribution, and hierarchical organization, viewed as requirements for efficient and robust system architectures. Existing studies estimate the significance of network properties using a generic randomization scheme - a Markov-chain switching algorithm - which generates unrealistic reactions in metabolic networks, as it does not account for the physical principles underlying metabolism. Therefore, it is unclear whether the properties identified with this generic approach are related to the functions of metabolic networks. Within this doctoral thesis, I have developed an algorithm for mass-balanced randomization of metabolic networks, which runs in polynomial time and samples networks almost uniformly at random. The properties of biological systems result from two fundamental origins: ubiquitous physical principles and a complex history of evolutionary pressure. The latter determines the cellular functions and abilities required for an organism’s survival. Consequently, the functionally important properties of biological systems result from evolutionary pressure. By employing randomization under physical constraints, the salient structural properties, i.e., the smallworld property, degree distributions, and biosynthetic capabilities of six metabolic networks from all kingdoms of life are shown to be independent of physical constraints, and thus likely to be related to evolution and functional organization of metabolism. This stands in stark contrast to the results obtained from the commonly applied switching algorithm. In addition, a novel network property is devised to quantify the importance of reactions by simulating the impact of their knockout. The relevance of the identified reactions is verified by the findings of existing experimental studies demonstrating the severity of the respective knockouts. The results suggest that the novel property may be used to determine the reactions important for viability of organisms. Next, the algorithm is employed to analyze the dependence between mass balance and thermodynamic properties of Escherichia coli metabolism. The thermodynamic landscape in the vicinity of the metabolic network reveals two regimes of randomized networks: those with thermodynamically favorable reactions, similar to the original network, and those with less favorable reactions. The results suggest that there is an intrinsic dependency between thermodynamic favorability and evolutionary optimization. The method is further extended to optimizing metabolic pathways by introducing novel chemically feasibly reactions. The results suggest that, in three organisms of biotechnological importance, introduction of the identified reactions may allow for optimizing their growth. The approach is general and allows identifying chemical reactions which modulate the performance with respect to any given objective function, such as the production of valuable compounds or the targeted suppression of pathway activity. These theoretical developments can find applications in metabolic engineering or disease treatment. The developed randomization method proposes a novel approach to measuring the significance of biological network properties, and establishes a connection between large-scale approaches and biological function. The results may provide important insights into the functional principles of metabolic networks, and open up new possibilities for their engineering. / In der Systembiologie und Bioinformatik wurden in den letzten Jahren immer komplexere Netzwerke zur Beschreibung verschiedener biologischer Prozesse, wie Genregulation, Protein-Interaktionen und Stoffwechsel (Metabolismus) rekonstruiert. Ein Hauptziel der Forschung besteht darin, die strukturellen Eigenschaften von Netzwerken für Vorhersagen über deren Funktion nutzbar zu machen, also eine Verbindung zwischen Netzwerkeigenschaften und Funktion herzustellen. Die netzwerkbasierte Forschung zielte bisher vor allem darauf ab, gemeinsame Eigenschaften von Netzwerken unterschiedlichen Ursprungs zu entdecken. Dazu zählen die durchschnittliche Länge von Verbindungen im Netzwerk, die Häufigkeit redundanter Verbindungen, oder die hierarchische Organisation der Netzwerke, welche als Voraussetzungen für effiziente Kommunikationswege und Robustheit angesehen werden. Dabei muss zunächst bestimmt werden, welche Eigenschaften für die Funktion eines Netzwerks von besonderer Bedeutung (Signifikanz) sind. Die bisherigen Studien verwenden dafür eine Methode zur Erzeugung von Zufallsnetzwerken, welche bei der Anwendung auf Stoffwechselnetzwerke unrealistische chemische Reaktionen erzeugt, da sie physikalische Prinzipien missachtet. Es ist daher fraglich, ob die Eigenschaften von Stoffwechselnetzwerken, welche mit dieser generischen Methode identifiziert werden, von Bedeutung für dessen biologische Funktion sind, und somit für aussagekräftige Vorhersagen in der Biologie verwendet werden können. In meiner Dissertation habe ich eine Methode zur Erzeugung von Zufallsnetzwerken entwickelt, welche physikalische Grundprinzipien berücksichtigt, und somit eine realistische Bewertung der Signifikanz von Netzwerkeigenschaften ermöglicht. Die Ergebnisse zeigen anhand der Stoffwechselnetzwerke von sechs Organismen, dass viele der meistuntersuchten Netzwerkeigenschaften, wie das Kleine-Welt-Phänomen und die Vorhersage der Biosynthese von Stoffwechselprodukten, von herausragender Bedeutung für deren biologische Funktion sind, und somit für Vorhersagen und Modellierung verwendet werden können. Die Methode ermöglicht die Identifikation von chemischen Reaktionen, welche wahrscheinlich von lebenswichtiger Bedeutung für den Organismus sind. Weiterhin erlaubt die Methode die Vorhersage von bisher unbekannten, aber physikalisch möglichen Reaktionen, welche spezifische Zellfunktionen, wie erhöhtes Wachstum in Mikroorganismen, ermöglichen könnten. Die Methode bietet einen neuartigen Ansatz zur Bestimmung der funktional relevanten Eigenschaften biologischer Netzwerke, und eröffnet neue Möglichkeiten für deren Manipulation.

Living organisms throughout evolution have developed desired properties, such as the ability of maintaining functionality despite changes in the environment or their inner structure, the formation of functional modules, from metabolic pathways to organs, and most essentially the capacity to adapt and evolve in a process called natural selection. It can be observed in the metabolic networks of modern organisms that many key pathways such as the citric acid cycle, glycolysis, or the biosynthesis of most amino acids are common to all of them. Understanding the evolutionary mechanisms behind this development of complex biological systems is an intriguing and important task of current research in biology as well as artificial life. Several competing hypotheses for the formation of metabolic pathways and the mecha- nisms that shape metabolic networks have been discussed in the literature, each of which finds support from comparative analysis of extant genomes. However, while being powerful tools for the investigation of metabolic evolution, these traditional methods do not allow to look back in evolution far enough to the time when metabolism had to emerge and evolve to the form we can observe today. To this end, simulation studies have been introduced to discover the principles of metabolic evolution and the sources for the emergence of metabolism prop- erties. These approaches differ considerably in the realism and explicitness of the underlying models. A difficult trade-off between realism and computational feasibility has to be made and further modeling decisions on many scales have to be taken into account, requiring the combination of knowledge from different fields such as chemistry, physics, biology and last but not least also computer science. In this thesis, a novel computational model for the in silico evolution of early metabolism is introduced. It comprises all the components on different scales to resemble a situation of evolving metabolic protocells in an RNA-world. Therefore, the model contains a minimal RNA-based genetics and an evolving metabolism of catalytic ribozymes that manipulate a rich underlying chemistry. To allow the metabolic organization to escape from the confines of the chemical space set by the initial conditions of the simulation and in general an open- ended evolution, an evolvable sequence-to-function map is used. At the heart of the metabolic subsystem is a graph-based artificial chemistry equipped with a built-in thermodynamics. The generation of the metabolic reaction network is realized as a rule-based stochastic simulation. The necessary reaction rates are calculated from the chemical graphs of the reactants on the fly. The selection procedure among the population of protocells is based on the optimal metabolic yield of the protocells, which is computed using flux balance analysis. The introduced computational model allows for profound investigations of the evolution of early metabolism and the underlying evolutionary mechanisms. One application in this thesis is the study of the formation of metabolic pathways. Therefore, four established hypothe- ses, namely the backwards evolution, forward evolution, patchwork evolution and the shell hypothesis, are discussed within the realms of this in silico evolution study. The metabolic pathways of the networks, evolved in various simulation runs, are determined and analyzed in terms of their evolutionary direction. The simulation results suggest that the seemingly mutually exclusive hypotheses may well be compatible when considering that different pro- cesses dominate different phases in the evolution of a metabolic system. Further, it is found that forward evolution shapes the metabolic network in the very early steps of evolution. In later and more complex stages, enzyme recruitment supersedes forward evolution, keeping a core set of pathways from the early phase. Backward evolution can only be observed under conditions of steady environmental change. Additionally, evolutionary history of enzymes and metabolites were studied on the network level as well as for single instances, showing a great variety of evolutionary mechanisms at work. The second major focus of the in silico evolutionary study is the emergence of complex system properties, such as robustness and modularity. To this end several techniques to analyze the metabolic systems were used. The measures for complex properties stem from the fields of graph theory, steady state analysis and neutral network theory. Some are used in general network analysis and others were developed specifically for the purpose introduced in this work. To discover potential sources for the emergence of system properties, three different evolutionary scenarios were tested and compared. The first two scenarios are the same as for the first part of the investigation, one scenario of evolution under static conditions and one incorporating a steady change in the set of ”food” molecules. A third scenario was added that also simulates a static evolution but with an increased mutation rate and regular events of horizontal gene transfer between protocells of the population. The comparison of all three scenarios with real world metabolic networks shows a significant similarity in structure and properties. Among the three scenarios, the two static evolutions yield the most robust metabolic networks, however, the networks evolved under environmental change exhibit their own strategy to a robustness more suited to their conditions. As expected from theory, horizontal gene transfer and changes in the environment seem to produce higher degrees of modularity in metabolism. Both scenarios develop rather different kinds of modularity, while horizontal gene transfer provides for more isolated modules, the modules of the second scenario are far more interconnected.

Das Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss unterschiedlich zusammengesetzter Tränken auf den Säuren-Basen-Haushalt bei Kälbern mit experimentell induzierter metabolischer Azidose zu untersuchen. Bei gesunden Kälbern konnte nachgewiesen werden, dass die Fütterung von milchbasierten ORL mit einer [SID3] ≥92 mmol/l eine Erhöhung der Plasma-[SID3] zur Folge hat (BACHMANN et al. 2009b) und damit eine alkalische Wirkung auf den SBS. Zu prüfen galt die Hypothese, ob es bei Kälbern mit experimentell induzierter metabolischer Azidose zu einem stärkeren alkalisierenden Effekt nach Gabe einer Tränke mit einer hohen [SID3] kommt. Bessere alkalisierende Eigenschaften einer Tränke könnten potentiell genutzt werden, um den Genesungsprozess von Kälbern mit metabolischer Azidose zu beschleunigen. Material und Methoden Zur Verfügung standen zwölf Kälber der Rasse Holstein-Friesian im Alter von weniger als vier Lebenswochen. Unter Verwendung von in der Literatur beschriebenen Induktionsprotokollen konnte per Infusion bei jeweils sechs Tieren eine manifeste hyperchlorämische Azidose und bei weiteren sechs Kälbern eine D-/L-Laktatazidose ausgelöst werden. Die Tiere wurden im Anschluss mit Milchaustauscher, wasser- oder milchaustauscher-basierter oraler Rehydratationslösung getränkt bzw. blieben im nüchternen Zustand. Zur Bestimmung von Stewart-Parametern des Säuren-Basen-Haushaltes im Plasma wurden nach einem festgelegten zeitlichen Schema vor und nach Induktion sowie vor und nach der Tränkegabe venöse Blutproben entnommen. Ergebnisse Bedingt durch die Einleitungsprotokolle war die Interpretation der Messergebnisse durch den starken Anstieg des Plasmavolumens bedeutend erschwert. Die eingesetzten Induktionsprotokolle sind nicht für Untersuchungen des Säuren-Basen-Haushaltes bei Kälbern nach unterschiedlicher Fütterung geeignet. Aus diesem Grund kann die aufgestellte Hypothese, dass die Verabreichung von milchaustauscher-basierter ORL zu einer besseren alkalischen Wirkung bei Kälbern mit metabolischer Azidose führt, anhand der vorliegenden Ergebnisse weder abgelehnt noch bestätigt werden. Einige Untersuchungsergebnisse zeigten positive Effekte auf Parameter des SBS bei Kälbern, denen eine Tränke verabreicht wurde, im Vergleich zu nüchternen Tieren. Diese Parameter waren die Plasma-D-Laktatkonzentration, die Strong Ion Difference [SID3] und [SID4] und ionisiertes Calcium [Ca2+]. Die Effekte waren nicht auf eine bestimmte der drei eingesetzten Tränkevarianten zurückzuführen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass ein quadratischer Zusammenhang zwischen der berechneten Variable Strong Ion Gap [SIGAlb/TP] und den gemessenen D-/L-Laktatkonzentrationen im Plasma besteht. Dies könnte zukünftig genutzt werden, um Faktoren zu etablieren, welche die Ableitung der Plasma-D-/L-Laktatkonzentration bei durchfallkranken Kälbern mit ZNS-Symptomatik aus gängigen Parametern ermöglicht, ohne die Laktatkonzentration direkt messen zu müssen. Schlussfolgerungen Für zukünftige Untersuchungen dieser Art wäre ein Induktionsprotokoll wünschenswert, das sowohl eine metabolische Azidose bei gleichzeitiger Dehydratation der Kälber vereint und so die metabolischen Bedingungen durchfallkranker Kälber simuliert. Die Gabe von ORL als direkte Einmischung in Milch bzw. MAT wird kritisch betrachtet. Ein negativer Effekt bei der Gabe von MAT-basierter ORL konnte bei diesen Untersuchungen auf keinen der bestimmten Parameter des SBS im Vergleich zu den anderen Tränkezusammensetzungen festgestellt werden. Klinische Nebenwirkungen Bei dieser Untersuchung traten nach der mehrfachen Infusion von D-/L-Laktat unerwartete Nebenwirkungen auf. Die Verabreichung führte zu starken Irritationen der Vena jugularis externa und zu Ödembildungen. Erhöhte D-Laktatkonzentrationen werden beim Menschen und verschiedenen Tierarten als Marker für traumatische Prozesse, Ischämie, Diabetes, gastrointestinale und neurologische Störungen diskutiert. Die weitere gezielte Untersuchung des Einflusses der wiederholten oder anhaltenden Einwirkung von D-Laktat auf Epithelzellen könnte nach den vorliegenden Untersuchungsergebnissen einen weiteren Anhaltspunkt für die Aufklärung der genauen pathologischen Mechanismen des D-Laktates bieten.

In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Verhaltensaspekte von Kindern und Jugendlichen mit Phenylketonurie (PKU) mit Hilfe des Strengths and Difficulties Questionnaire (SDQ) untersucht. Hierzu erfolgte die Einschätzung von Verhaltensauffälligkeiten und -stärken von 49 PatientInnen mittels einer Fremdbeurteilung durch die Eltern sowie zusätzlich bei den 11- bis 17-Jährigen in einer Selbstbeurteilung. Die Ergebnisse wurden mit denen stoffwechselgesunder AltersgenossInnen verglichen. Erfreulicherweise erzielten Kinder und Jugendliche mit PKU gute Ergebnisse im SDQ. Sowohl in der Fremd- als auch Selbstbewertung konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen PatientInnen mit PKU und Kontrollpersonen in Bezug auf den SDQ-Gesamtproblemwert verzeichnet werden. Auffälligkeiten innerhalb sowie Unterschiede zwischen den PatientInnen und stoffwechselgesunden Kontrollpersonen zeigten sich jedoch in einzelnen Subskalen des SDQ. Der Vergleich innerhalb der Populationen ergab sowohl bei den Jungen mit PKU als auch bei stoffwechselgesunden Jungen im Alter von 2 bis 10 Jahren signifikant häufiger „Verhaltensprobleme“ verglichen mit den 11- bis 17-Jährigen. Dem gegenüber erreichten die 2- bis 10-jährigen PatientInnen mit PKU in der Fremdbeurteilung im Gegensatz zu den stoffwechselgesunden Kindern ausschließlich normale Ergebnisse im „prosozialen Verhalten“. In der Altersgruppe 11 bis 17 Jahre bewerteten sich Mädchen mit PKU hinsichtlich „emotionaler Probleme“ stärker beeinträchtigt als stoffwechselgesunde Altersgenossinnen. Mädchen und Jungen mit PKU zwischen 11 und 17 Jahren berichteten weiterhin signifikant häufiger über „Hyperaktivität“ als die stoffwechselgesunden Jugendlichen. Eine durchweg positive Korrelation zwischen dem Gesamtproblemwert und dem Impact-Score macht deutlich, dass die durch den SDQ ermittelten Verhaltensauffälligkeiten Auswirkungen auf den Alltag von betroffenen Kindern mit PKU haben. Das Therapieregime und die metabolische Einstellung hatten in dieser Studie keinen signifikanten Einfluss auf die Ergebnisse des SDQ-Gesamtproblemwertes. Eine zu erwartende negative Korrelation zwischen dem sozioökonomischen Status und dem SDQ-Gesamtproblemwert ergab sich lediglich den Kindern der Altersgruppe 2 bis 10 Jahre unabhängig von der Diagnose PKU.:Tabellenverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1. Einführung 1.1 Phenylketonurie 1.1.1 Historische Aspekte 1.1.2 Definition und Prävalenz 1.1.3 Biochemie und genetische Ursachen 1.1.4 Klassifikation 1.1.5 Diagnostik im Rahmen des erweiterten Neugeborenenscreenings 1.1.6 Klinik 1.1.7 Pathogenese 1.1.8 Therapie 1.1.8.1 Ernährungstherapie 1.1.8.2 Medikamentöse Therapie 1.1.8.3 Therapiekontrolle 1.1.9 Prognose und maternales PKU-Syndrom 1.2 Auswirkung der PKU auf die psychische Gesundheit von betroffenen Kindern und Jugendlichen 1.2.1 Entstehung von Verhaltensauffälligkeiten im Kindes- und Jugendalter 1.2.2 Die PKU als zusätzlicher Risikofaktor für die Entwicklung von Verhaltens- auffälligkeiten 1.2.3 Einfluss der PKU auf das Wohlbefinden der Eltern 1.3 Forschungsbedarf 2. Aufgabenstellung 3. Materialien und Methoden 3.1 Studiendesign und PatientInnenrekrutierung 3.1.1 Einschlusskriterien 3.1.2 Ausschlusskriterien 3.2 Kontrollkollektiv 3.3 Datenerhebung 3.3.1 Strengths and Difficulties Questionnaire (SDQ) 3.3.2 Metabolische Einstellung 3.3.3 Anthropometrische Daten 3.3.4 Sozioökonomischer Status 3.4 Statistische Datenanalyse 4. Ergebnisse 4.1 PatientInnenkollektiv 4.2 Ergebnisse des SDQ 4.2.1 SDQ-Ergebnisse von PatientInnen mit PKU 4.2.1.1 Fremdbeurteilung durch die Eltern 4.2.1.2 Selbstbeurteilung der PatientInnen mit PKU 4.2.1.3 Vergleich zwischen der Fremd- und Selbstbeurteilung bei jugendlichen PatientInnen mit PKU 4.2.2 SDQ-Ergebnisse von stoffwechselgesunden Kontrollpersonen 4.2.2.1 Fremdbeurteilung durch die Eltern 4.2.2.2 Selbstbeurteilung der stoffwechselgesunden Jugendlichen 4.2.2.3 Vergleich zwischen der Fremd- und Selbstbeurteilung bei stoffwechsel- gesunden Jugendlichen 4.2.3 Vergleich der SDQ-Ergebnisse zwischen PatientInnen mit PKU und stoffwechselgesunden Kontrollpersonen 4.2.4 Vergleich der SDQ-Ergebnisse zwischen PatientInnen mit PKU mit und ohne Diät 4.2.4.1 Fremdbeurteilung durch die Eltern 4.2.4.2 Selbstbeurteilung der PatientInnen mit PKU 4.3 Zusammenhang zwischen dem SDQ-Gesamtproblemwert und der metabolischen Einstellung 4.4 Zusammenhang zwischen dem SDQ-Gesamtproblemwert und dem sozio- ökonomischen Status 4.5 Ergebnisse des SDQ-Impact-Scores 5. Diskussion 5.1 Auffälligkeiten in den SDQ-Subskalen 5.2 Vergleich zwischen der Fremd- und Selbstbeurteilung bei Jugendlichen 5.3 Zusammenhang zwischen der diätetischen Therapie und den SDQ-Ergebnissen 5.4 Zusammenhang zwischen der metabolischen Einstellung und den SDQ-Ergebnissen 5.5 Zusammenhang zwischen dem sozioökonomischen Status und den SDQ-Ergebnissen 5.6 Schlussfolgerung 5.7 Limitationen 6. Zusammenfassung der Arbeit 7. Literaturverzeichnis 8. Anlagen 8.1 SDQ-Fremdbeurteilung 2 bis 4 Jahre 8.2 SDQ-Fremdbeurteilung 4 bis 17 Jahre 8.3 SDQ-Selbstbeurteilung 11 bis 17 Jahre Selbstständigkeitserklärung Danksagung

Cells grow in environments that can change suddenly. To cope with unpredictable perturbations, they have evolved mechanisms to adjust their metabolism according to the various types of environmental stress. Cells experiencing starvation, for example, have low energy levels and are forced to lower their metabolism and enter a protective quiescent state to survive until nutrients become available again. Recently, it has been shown that starved yeast cells experience a marked acidification of the cytoplasm, due to a passive influx of protons. This pH drop causes multiple rearrangements in the cytoplasm: increased crowding, reduced mobility of intracellular components and formation of stress-induced non-membrane bound compartments of specific metabolic enzymes. Cytoplasm rearrangements are required for cell survival and can be reversed upon replenishment of energy. However, there is little understanding of how cytoplasmic components reorganize in stressed quiescent cells. Using high-pressure freezing, correlative light and electron microscopy (CLEM) and electron tomography, coupled to high-resolution 3D-reconstruction techniques, I investigate the structural modi cations that happen in situ in yeast cells undergoing quiescence. I observe that the cytoplasm becomes increasingly crowded, due to a massive rearrangement of membranous structures, including accumulation of intracellular vesicles and pronounced invaginations in the plasma membrane. This is proved by quantification of the difference in ribosome densities between stressed and not stressed cells. The increased crowding, coupled to cytoplasm acidification, leads to the formation of non-membrane bound enzyme compartments, that appear as foci and elongated structures of fluorescently tagged enzymes. I prove that the fluorescent structures correspond to bundles of filaments. Among many essential enzymes, known to form mesoscale structure in stressed yeast, I demonstrate that the eukaryotic translation initiation factor 2B (eIF2B) forms bundles of filaments in situ, and the evolutionary conserved glutamine synthetase (Gln1) self-assembles into filaments in vitro. The present study on the energy depleted cytoplasm and the structural analysis of filament-forming enzymes provides insights into an unexplored survival strategy that is used by yeast, as well as other organisms, to cope with extreme environmental conditions and stress.:1 Introduction 1 Stress, survival and quiescence 2 1.1 Cytoplasm and cellular compartments 2 1.2 Membraneless compartmentalization in the cell 3 1.3 Stress-induced non-membrane bound assemblies 4 The quiescent sleeping yeast 6 1.4 The yeast S.cerevisiae as model organism 7 1.5 Growth and metabolism of yeast 9 1.5.1 Yeast eukaryotic translation initiation factor 2B: eIF2B 11 1.5.2 Yeast glutamine synthetase: Gln1 12 3D electron microscopy 14 Aims of the Thesis 18 2 Materials and methods 21 Room temperature electron microscopy (EM) 21 2.1 Yeast strains, media and energy depletion 21 2.2 High-pressure freezing of yeast cells 22 2.2.1 EM sample preparation for untagged eIF2B yeast strains 22 2.2.2 EM sample preparation for GFP-tagged eIF2B yeast strains 23 2.3 Electron tomography 23 2.4 Subtomogram averaging 24 2.5 Fiji script for automated ribosome counting 25 2.6 Immunofluorescence of eIF2B in yeast 26 2.7 Western-blot on yeast ribosomes 27 Single particle procedures 30 2.8 Protein purification protocols 30 2.8.1 Baculovirus-insect cell expression and purification of eIF2B 30 2.8.2 Gradient of fixation for fragile complexes 31 2.8.3 Yeast expression and purification of Gln1 33 2.9 Negative staining 34 2.9.1 Image acquisition and analysis—eIF2B 35 2.9.2 Image acquisition and analysis—Gln1 36 Cryo-electronmicroscopy(cryo-EM) 37 2.10 Plunge freezing 37 2.11 Image acquisition and 3D reconstruction 37 3 Results Visualizing yeast’s cytoplasmic reorganization 39 3.1 Quiescence is accompanied by reorganization of the cytoplasm 40 3.2 Ribosome density proves cytoplasmic crowding in starved cells 42 3.3 eIF2B organizes in bundles of filaments in energy-depleted cells 45 3.4 eIF2B filaments are polymers of the eIF2B complex 47 3.5 Filaments are found in wild-type energy-depleted cells 49 Structural analysis of filament forming enzymes 51 3.6 Purification of eIF2B complexes 51 3.7 Single particle analysis of eIF2B 53 3.8 Purification of Gln1 complexes 55 3.9 Single particle analysis of Gln1 56 3.10 Gln1 forms filaments in vitro 58 4 Discussion and Outlook 59 4.1 Yeast cytoplasm reorganizes in response of stress 59 4.2 Ribosomes density is a measure of increased macromolecular crowding 60 4.3 eIF2B forms filaments as a survival strategy 62 4.4 Molecular analysis of filament forming enzymes 64 4.5 Outlook 65 Appendix 67 Bibliography 83

Metabolic reprogramming has been recognised as a hallmark in solid tumours. Malignant modification of the tumour’s bioenergetics provides energy for tumour growth and progression. Otto Warburg first reported these metabolic and biochemical changes in 1927. In prostate cancer (PCa) epithelial cells, the tumour metabolism also changes during development and progress. These alterations are partly driven by the androgen receptor, the key regulator in PCa development, progress, and survival. In contrast to other epithelial cells of different entities, glycolytic metabolism in prostate cells sustains physiological citrate secretion in the normal prostatic epithelium. In the early stages of PCa, citrate is utilised to power oxidative phosphorylation and fuel lipogenesis, enabling tumour growth and progression. In advanced and incurable castration-resistant PCa, a metabolic shift towards choline, amino acid, and glycolytic metabolism fueling tumour growth and progression has been described. Therefore, even if the metabolic changes are not fully understood, the altered metabolism during tumour progression may provide opportunities for novel therapeutic strategies, especially in advanced PCa stages. This review focuses on the main differences in PCa’s metabolism during tumourigenesis and progression highlighting glutamine’s role in PCa.

Obesity is a major health concern that is accompanied by a high risk for several disorders such as type 2 diabetes, cardiovascular disease and certain forms of cancer (Stevens et al., 2012; Lahey and Khan, 2018). Since the prevalence of obesity has nearly tripled within the last 45 years and is still on the rise (WHO, 2018), it is imperative to understand mechanisms that might underlie the emergence and maintenance of obesity to develop new prevention- and intervention strategies. The high availability of energy-rich food is one of the main contributing factors for the increasing prevalence of obesity. Hence, the mechanisms underlying eating without physiological needs come into focus. In that regard, the olfactory system plays a major role: it is equally involved in homeostatic signaling of hunger and hedonic eating (Palouzier-Paulignan et al., 2012). Given that the sense of smell is altered in obesity (for an overview see Peng et al., 2019), the overall goal of this thesis is to contribute to further understanding of the mechanisms that might underlie this phenomenon. It has been previously shown that people with obesity evaluate food odors as more pleasant (Stafford and Whittle, 2015) and show higher reactivity towards them (Proserpio et al., 2019), however, they persistently have lower olfactory function. This low function is most evident in olfactory sensitivity, i.e. picking up odors from the environment, and is therefore related to appetite and food search. Odor sensitivity evaluation is usually a lengthy procedure and is standardly performed with non-food odors. However, Stafford and Whittle (2015), revealed a different result for sensitivity to food odors: obese outperformed normal-weight participants for chocolate odor. Strikingly, further scrutiny reveals that metabolic and endocrine health factors could provide a possible explanation for divergent results of olfactory sensitivity to food and non-food odors in obesity: whereas the chocolate-study included only class 1 obese participants (BMI 30-35 kg/m2), all other studies included class 2-3 obese participants (BMI > 35 kg/m2). It is likely that obese class 2-3 participants are more affected by hormonal changes, such as higher insulin resistance and higher leptin levels than their less obese counterparts. On a recent note, it has been shown that the olfactory and endocrine systems are closely linked (Palouzier-Paulignan et al., 2012). As such there are many receptors for hunger-related hormones located in brain structures that are highly relevant for odor processing as well as for the regulation of homeostatic needs (Baly et al., 2007; Lacroix et al., 2008; Henkin, 2010). Especially, the olfactory bulbs, where olfactory information is firstly processed in the brain, have a high density of insulin and leptin receptors (Baskin et al., 1983; Thanarajah et al., 2019; Havrankova et al., 1981; Marks et al., 1990). Further, animal studies have reliably demonstrated that obesity leads to structural and functional changes in the olfactory system (Thiebaud et al., 2014; Fadool et al.2011; Riviére et al., 2016). However, brain anatomical changes in the olfactory system of humans have not been studied yet. To conclude, we firstly aimed to develop an olfactory test that is easy to administer and of short duration to apply in a complex research design, because available tests are time consuming and highly variable in duration (10-25 min). Secondly, in order to elucidate the potential link between olfactory impairments in obesity and metabolic health factors, we investigated food and non-food odor sensitivity in a wide body weight range and related it to metabolic and endocrine factors such as insulin resistance. Third, we aimed to investigate the possible relationship between obesity and brain anatomical changes in the olfactory bulbs. Study 1: In our first study, we measured olfactory sensitivity in a within-subject repeated-measures design in 20 young and healthy participants. Using the odor detection threshold subtest from the “Sniffin’ Sticks” test battery, we applied three different presentation methods: (1) gold standard, (2) shorter single staircase method and (3) ascending procedure. Compared to the gold-standard, the shorter single staircase procedure was 26% and the ascending procedure was 51% shorter in duration. Both short procedure thresholds correlated highly with the gold standard threshold. All three tests showed similar test-retest reliability. To conclude, we have developed a test that takes on average 5-7 minutes less time and is as reliable as the gold standard. Study 2: Within the second study, we focused on metabolic health parameters that might explain the relationship between odor sensitivity and obesity. We investigated food and non-food odor sensitivity in the hungry and sated state in 75 young healthy participants with normal weight, overweight and obesity in a within-subject, repeated-measures design. We assessed metabolic health status with BMI, WHR, pre- and postprandial levels of insulin, leptin, glucose, and ghrelin. We showed that odor sensitivity did not directly depend on body weight status or BMI. However, we found a strong negative mediating effect of insulin resistance as assessed by HOMA-IR score on the relationship between BMI and olfactory sensitivity for the food odor. Post-hoc regression models revealed that insulin resistance rather than obesity is responsible for this effect. To conclude, our findings indicate a strong negative association between insulin resistance and sensitivity to food odors. Study 3: In the third study, we examined neuroanatomical correlates of smell perception in obesity and its relationship with metabolic health factors. Olfactory bulb volume was assessed with magnetic resonance imaging in 67 healthy normal weight, overweight and obese participants. To examine recently proposed mechanistic explanatory models of altered smell perception in obesity, we collected parameters that are associated with metabolic health in obesity, such as insulin resistance, leptin, body fat percentage and fat mass index. We showed that in our sample, people with obesity had significantly lower olfactory bulb volume when compared to people with normal weight. Further, we found that olfactory bulb volume was negatively associated with other measures of metabolic health, especially insulin resistance, leptin, and body fat percentage. Our results imply that, similar to other diseases such as depression and Parkinson’s disease, obesity also involves a neuroanatomical change in the olfactory bulbs compared to healthy participants with normal weight. Hence, our study provides first indications that obesity is associated with brain anatomical changes in the olfactory bulbs. Conclusion The overall aim of this thesis was to shed light on the complex relationship between obesity and olfaction. Study 1 provides two easy-to-use odor threshold test procedures for clinical use or for complex research designs with limited time frames. Importantly, this thesis emphasizes the major role of metabolic health status and especially insulin resistance in the altered smell perception in obesity. Most notably, poor metabolic health mediates the relationship between obesity and olfactory sensitivity (study 2). Metabolic health parameters rather than obesity per se might be responsible for low olfactory function and should be further scrutinized in future studies. In particular, a group-design with elevated vs. normal HOMA-IR participants instead of BMI groups could provide more insights. Intriguingly, a high BMI and related metabolic health factors, such as high insulin resistance and high body fat percentage are associated with neuroanatomical changes in the olfactory system, i.e., lower olfactory bulb volume (study 3). These findings contribute to a further understanding of explanatory models introduced by Peng et al. (2019). In accordance with this metabolic and hormonal model our results support the theoretical framework that metabolic and hormonal shifts in obesity might be crucial for changes in olfactory perception. Thereby, these results provide a deeper understanding of the pathophysiological mechanisms underlying altered olfactory function in obesity. Subsequently, olfaction might represent a new target for prevention or therapy.:LIST OF ABBREVIATIONS I LIST OF FIGURES II LIST OF TABLES III I. INTRODUCTION 1 1. THE OBESITY PANDEMIC 1 2. HORMONES INVOLVED IN OBESITY AND OLFACTION 4 2.1 HORMONES IN THE REGULATION OF EATING BEHAVIOR AND OBESITY 4 2.2 HORMONES IN THE CONTEXT OF SMELL PERCEPTION 7 3. THE OLFACTORY SYSTEM 9 3.1 ANATOMY AND PHYSIOLOGY 9 3.2 MEASURING SMELL ABILITY: THREE DIMENSIONS OF OLFACTORY FUNCTION 13 3.3 THE ROLE OF OLFACTION IN THE CONTROL OF EATING BEHAVIOR 14 3.4 SMELL PERCEPTION IN OBESITY 15 4. THE LINK: WHY TARGET THE OLFACTORY SYSTEM IN OBESITY? 19 II. RATIONALE OF THE EXPERIMENTAL WORK 20 III. EXPERIMENTAL WORK 21 STUDY 1: SHORT PROCEDURE TO ASSESS ODOR DETECTION THRESHOLDS 21 STUDY 2: ODOR SENSITIVITY FOR FOOD AND NON-FOOD ODORS IN OBESITY 30 STUDY 3: BRAIN ANATOMICAL CORRELATES OF SMELL PERCEPTION IN OBESITY 47 IV. SUMMARY 60 V. REFERENCES 65 VI. APPENDIX 75 A. DECLARATION OF AUTHENTICITY 75 B. AUTHOR CONTRIBUTIONS 76 C. CURRICULUM VITAE 80 D. ACKNOWLEDGEMENTS 83